English

• 1.   引 言

  多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指分子中由两个或两个以上的苯环按照线性、角状或簇状的方式稠合在一起的芳香型化合物,可分为芳香稠环型和芳香非稠环型^[1]。它存在于土壤、水等自然环境中,也存在于通过食物链而富集的蚯蚓等生物体内^{[2, 3]}。是环境中广泛存在的一类典型的持久性有机污染物。由于它脂溶性好,能够通过食物链在生物体内富集,因此,对人类的健康存在很大的威胁,并且具有"致癌、致畸、致突变"的"三致"效应^[4~6],16种不带支链的PAHs被美国环保署(USEPA)列为优先控制的POPs之一^[7]。其来源主要包括燃烧(森林、草原的天然火灾和火山喷发)和生物合成(沉积物成岩过程、生物转化过程和焦油矿坑内气体),以及未开采的煤、石油中等自然源;也包括煤、石油、木材以及有机高分子化合物的不完全燃烧、垃圾焚烧和填埋、食品制作及直接的交通排放等人为源^[8~10]。近年来,国内学者对土壤中的PAHs污染进行了大量的现场调查研究^[11~13]。结果表明,在我国土壤中,对16种优先控制PAHs都有不同程度的检出,且检出率非常高。参照荷兰Maliszewska-Kordybach (1996)^[14] 根据欧洲农业土壤中 PAHs的质量分数与分布情况,将土壤PAHs的污染程度分成4个水平:土壤16种PAHs总含量＜200 μg/kg为未污染土壤;PAHs总量在200~600 μg/kg为轻度污染土壤;PAHs总量在600~1000 μg/kg为中度污染土壤;PAHs总量＞1000 μg/kg为重度污染土壤。国家环保总局推荐使用高效液相色谱测定水体(饮用水、地下水、河流湖泊水以及工业废水等)中的PAHs含量^[15]。但对土壤及生物体内PAHs的测定方法却鲜有涉及。土壤样品及生物体比较复杂,有机质等杂质含量高,比较难以纯化,影响出峰效果,因此,需要对样品进行提取、浓缩、纯化等前处理,以期提高检测的灵敏度并降低检出限。

  目前,对土壤及生物体内(如蚯蚓)PAHs总量的提取方法主要包括索氏萃取和超声波萃取等^[16~18]。索氏萃取回收率较高,但工作量较大、耗时长,提取甚至需要72 h^[19],且对有机溶剂的消耗量大;超声波萃取是美国EPA推荐的方法之-(EPASW-846-3550),该方法简单、快速,一般只需要数小时^[20],该方法虽然可以节约资源和时间,但是萃取不完全回收率偏低^[21]。加速溶剂萃取(Accelerated solvent extraction,ASE)是近些年来发展起来的,兼具速度快、效率高、有机溶剂用量少、自动化操作等优点的一项技术,被广泛用于多溴联苯、多氯联苯、PAHs以及农药残留等土壤中有机污染物的提取^[22~25]。蚯蚓具备如下优点:(1)体内含氧功能团活性低,能对PAHs类污染物进行富集而不会像其它生物一样把它代谢掉;(2)没有角质层,不仅能直接吞食还能通过扩散作用从皮肤直接吸收土壤中的污染物;(3)对不同类型土壤的适应能力强,容易存活;(4)生物量大、利于测定。因此蚯蚓常用做土壤PAHs富集实验的模式生物^{[26, 27]},测定其体内PAHs的含量也具有很重要的现实意义。本实验采用ASE萃取技术,结合HPLC,建立一种高效快捷、高灵敏度、低检出限的测定土壤样品及蚯蚓体内PAHs含量的分析方法。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司),配有PAHs专用柱(250 mm × 4.6 mm不锈钢柱,填料粒径为5 μm,美国Supelco公司)和RF-10AXL型荧光检测器(日本岛津公司);ASE200型-加速溶剂萃取仪(美国戴安公司);R210/R215型-旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)。

  PAHs的标准品:分别为菲(Phe,99%)、芘(Pyr,99%)、䓛(Chyr,99%)、苯并[a]蒽(BaA,99%)、苯并[b]荧蒽(BbF,99%)、苯并[k]荧蒽(BkF,99%)以及苯并[a]芘(BaP,96%),购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 层析硅胶(130℃烘干2 h进行活化),硅藻土、氧化铝以及无水硫酸钠和石英砂(200℃高温处理4h以去除水分)均为分析纯试剂; 二氯甲烷(99.5%)、丙酮(99.5%)、正己烷(98.0%)、乙腈(99.9%)等试剂(色谱纯,南京第一化学试剂公司)。实验所用蚯蚓是的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida),正蚓科(Lumbricidae),平均湿重为0.25 g左右,购自南京某养殖场。

  2.2.   土壤样品的采集与分析

  供试清洁土壤采自海南的红壤(19°46'16.6″N,110°00'21.5″E)。采集0~20 cm的表层土壤,土样置于室内自然风干,磨碎,过2 mm筛,保存备用。其基本理化性质如下: pH 为6.33,总碳含量为20.57 g/kg,砂粒含量为40.88%,粉砂粒含量为26.76%,黏粒含量为32.36%,土壤质地为粘壤土。

  2.3.   色谱条件

  用HPLC荧光检测器对PAHs进行检测。PAHs专用柱进行分离,检测器的波长设置如表 1所示。流动相为乙腈-水(9:1,V/V);进样量为20 μL,流速为1.5 mL/min,柱温设置为30℃。

  表 1

  

  表 1  HPLC 荧光检测器检测7种PAHs的波长程序设置

  Table 1.  Fluorescence detector wavelength program for 7 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

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  保留时间Retention time (min)	激发波长Excitation wavelength (nm)	发射波长 Emission wavelength(nm)	PAHs
  0.1~4.3	245	365	菲 Phenanthrine, Phe
  4.3~5.5	270	390	芘 Pyrene,Pyr
  5.5~8.0	266	403	䓛Chrysene, Chry; 苯并[b]荧蒽Benzo [b] fluoranthene,BbF
  8.1~14.9	260	420	苯并[a]蒽Benzo [a] anthracene, BaA; 苯并[k]荧蒽Benzo [k] fluoranthene, BkF; 苯并[a]芘Benzo [a] pyrene, BaP
  15.0	Stop

  2.4.   固相萃取柱纯化实验

  用加速溶剂提取获得的土壤溶液呈浅黄色,蚯蚓由于脂类含量高溶液通常呈黄褐色,杂质含量多,用HPLC对其污染物浓度定量之前,用聚丙烯固相萃取柱(简称SPE,6 mL)进行净化。本实验选取硅胶为SPE柱的主要填料(简称硅胶柱,填充材料从上到下依次为:垫片+0.5 g无水Na₂SO₄+1 g硅胶+0.5 g无水Na₂SO₄+垫片)对土壤提取液进行净化。选取Al₂O₃和硅胶为SPE柱的主要填料对蚯蚓提取液进行净化(简称Al₂O₃-硅胶柱,填充材料从上到下依次为:垫片+0.5 g无水Na₂SO₄+0.5 g Al₂O₃+0.5 g硅胶+0.5 g无水Na₂SO₄+垫片)。

  洗脱剂的选择:用3种不同的有机溶剂:分别为正己烷、二氯甲烷、正己烷-二氯甲烷(9:1,V/V),对加标500 μg/kg的SPE柱(硅胶柱和Al₂O₃-硅胶柱)样品(土壤和蚯蚓样品)进行洗脱实验。

  2.5.   ASE提取

  分别加入50 mg 7种不同的PAHs于100 mL乙腈溶液中,得到各PAH浓度分别为500 μg/L的混合标准溶液。在5 g石英砂中加入1.0 mL 500 μg/L混合标准溶液,然后分别用二氯甲烷、丙酮、正己烷、正己烷-丙酮 (1:1,V/V) 和正己烷-丙酮 (4:1,V/V) 5种有机溶剂进行加速溶剂提取实验。萃取仪参数设置为:在炉温度为125℃、压力为10 MPa的条件下,预热5 min后,进行静态提取5 min,然后氮吹60 s,循环2次。

  2.6.   土壤及蚯蚓样品加标回收实验

  取实际土壤(或蚯蚓)样品1.0 g,分别加入0.1 mL和1 mL 500 μg/L的PAHs混合标准储备液,土壤(或蚯蚓)样品中最终加标量分别为100和500 μg/kg。每个浓度做3个平行。用正己烷-丙酮(4:1,V/V)萃取剂进行ASE提取,提取液用R210/R215型旋转蒸发仪浓缩至2 mL。提取液中由于杂质含量多,要用SPE柱(土壤样品用硅胶柱,蚯蚓样品用Al₂O₃-硅胶柱)对其进行净化。先用5 mL正己烷对SPE柱进行润洗,舍弃润洗液,再用10 mL正己烷-二氯甲烷(9:1,V/V)对2 mL浓缩提取液进行洗脱,将洗脱液旋转蒸干,用乙腈定容至1.0 mL,过0.22 μm有机滤膜后移入2 mL棕色样品瓶中,最后用HPLC测定提取液中PAHs的含量。

  3.   结果与讨论

  3.1.   HPLC对7种PAHs的分离

  参考文献^{[28, 29]},优化出7种PAHs的激发波长和发射波长,荧光检测器检测,PAHs专用柱分离,成功的实现了7种PAHs的高灵敏度检测,出峰时间为14 min,峰型对称无拖尾,基线平稳,基本无干扰,出峰时间短。经荧光检测器检测得到的HPLC谱图如图 1所示。

  图 1

  

  图 1  7种PAHs的荧光检测器检测HPLC色谱图

  Figure 1.  HPLC chromatogram of 7 PAHs detected by FLD detector

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  3.2.   标准曲线制作及方法检出限的确定

  取7种PAHs混合标样(各组分浓度分别为500 μg/L)4 mL于10 mL容量瓶中,以乙腈稀释定容,再逐级将此溶液稀释为原来的1,2.5,5,10,25和50倍,分别配制浓度为10,20,50,100,200和500 μg/L 的PAHs系列混合标准溶液,用HPLC进行分析测定。用被测组分峰面积y对其浓度x做工作曲线,由表 2所示,各标准系列在10-500 μg/L 浓度范围内均呈现出良好的线性关系,相关系数为0.9998~1.0000,相对标准偏差为1.5%~3.9%,方法检出限为0.15~0.85 μg/L,满足样品分析的质量控制要求,表明本方法的准确性与可靠性良好。

  表 2

  

  表 2  标准曲线和检出限

  Table 2.  Standard curves and detection limits

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  化合物 Compound	校准曲线Linear regression equation	相关系数Correlation coefficient (R2)	相对标准偏差 RSD (%)	方法检出限 Limit of detection (μg/kg)
  Phe	y=8.99598×10-5x + 1.43463	1.0000	1.5	0.85
  Pyr	y=3.49478×10-5x+ 1.13369	0.9999	2.2	0.35
  Chry	y=2.10463×10-5x+ 1.96916	0.9999	3.0	0.25
  BbF	y=4.09655×10-5x－ 2.12086	1.0000	2.6	0.25
  BaA	y=0.00017×10-5x+ 2.58186	0.9999	1.7	0.15
  BkF	y=2.09002×10-5x－1.97394	1.0000	2.3	0.35
  BaP	y=5.44737×10-5x－0.48174	0.9998	3.9	0.20

  3.3.   SPE柱的优化

  3.4.   ASE萃取剂的选择与优化

  从表 3可以看出,二氯甲烷对7种PAHs的回收率在87.6%~110.3%之间,丙酮对7种PAHs的回收率在87.1%~105.6%之间,正己烷对7种PAHs的回收率在66.6%~92.4%之间。由此可见,二氯甲烷和丙酮对所研究的7种PAHs的提取效率高于正己烷。其主要原因是丙酮和二氯甲烷的亲核性质比较强,更有利于同基质颗粒竞争吸附具有强亲核性质和较大电子密度的PAHs^{[30, 31]}。 但是二者对PAHs提取的稳定性较差,相对标准偏差分别在5.7%~9.3%和6.4%~7.5%之间。正己烷加入丙酮之后,PAHs提取率较正己烷显著提高:正己烷-丙酮(1:1,V/V)对7种PAHs的回收率在83.6%~108.2%之间,正己烷-丙酮(4:1,V/V)对7种PAHs的回收率在87.4%~112.2%之间。这是因为丙酮极性比正己烷强,对有机污染物的溶解能力强,有助于PAHs溶解。相对标准偏差分别在2.4%~4.6%和0.98%~1.4%之间,稳定性较好。体系中丙酮所占的比例越高,极性就越强,提取出的杂质越多,提取液的颜色越深,增加了净化过程的难度。而杂质去除不干净,也会影响HPLC对污染物定性及定量分析,影响方法的稳定性与准确性。所研究的5种不同的提取剂,正己烷-丙酮(4:1,V/V)的混合溶液对PAHs整体的提取效率最高,稳定性也最好。本实验选取正己烷-丙酮(4:1,V/V)作为ASE对土壤及蚯蚓样品中PAHs提取的提取剂。

  表 3

  

  表 3  ASE提取溶剂的优化

  Table 3.  Optimization of ASE extraction solvents

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  萃取体系Extraction system	加标量 Added (μg/kg)	回收率Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%, n=3)
  二氯甲烷 Dichloromethane	100	~~110.3	5.7~9.3
  丙酮 Acetone	100	87.1~105.6	6.4~7.5
  正己烷 n-Hexane	100	66.6~92.4	1.1~2.5
  正己烷-丙酮 n-Hexane-aceton (1:1, V/V)	100	83.6~108.2	2.4~4.6
  正己烷-丙酮 n-Hexane-aceton (4:1, V/V)	100	87.4~112.2	1.0~1.4

  3.5.   土壤样品及蚯蚓样品基质加标回收率实验

  用土壤样品及蚯蚓样品基质加标回收率实验来验证该方法的精密度与准确性。检测结果如表 4所示。可以看出,土壤样品7种PAHs的回收率稳定在83.5%~110.2%之间,相对标准偏差为1.1%~4.6%;蚯蚓样品的回收率稳定在81.2%~97.1%之间,相对标准偏差为1.6%~4.2%。说明本方法可准确用于土壤及蚯蚓样品中PAHs的测定。

  表 4

  

  表 4  土壤及蚯蚓样品中7种PAHs的加标回收率(n=3)

  Table 4.  Recoveries of 7 PAHs in soils and earthworms samples (n=3)

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  Phe 83.5 4.6 85.2 3.6 81.2 4.2 83.3 3.6

  PAHs	土壤样品 Soilsample						蚯蚓样品 Earthworm sample
  	添加浓度 Added(100 μg/kg)			添加浓度 Added(500 μg/kg)			添加浓度 Added(100 μg/kg)			添加浓度 Added(500 μg/kg)
  	回收率Recovery(%)	标准偏差RSD(%)		回收率Recovery(%)	标准偏差RSD(%)		回收率Recovery(%)	标准偏RSD(%)		回收率Recovery(%)	标准偏差RSD(%)
  Pyr	99.1	2.2		97.3	2.1		93.1	2.3		94.5	2.8
  Chry	93.2	1.0		98.3	2.8		92.7	3.5		95.6	2.6
  BbF	94.7	2.3		95.7	1.6		93.6	1.56		92.1	1.8
  BaA	93.6	2.0		99.1	3.4		89.9	2.0		94.9	1.9
  BkF	108.9	1.7		110.2	4.5		96.4	2.8		97.1	3.6
  BaP	80.8	2.6		86.9	2.9		81.3	1.6		82.8	2.5

  3.3.1.   SPE柱淋洗液的选择

  图 2展示了20 mL的正己烷、二氯甲烷和正己烷-二氯甲烷(9:1,V/V)作为淋洗液分别对硅胶柱以及Al₂O₃-硅胶柱中PAHs的加标回收率。无论是硅胶柱还是Al₂O₃-硅胶柱,二氯甲烷对3环Phe的回收率比正己烷高,而正己烷对4环Pyr、Chry、BbF、BaA、BkF和5环的BaP的回收率比二氯甲烷高。主要是因为二氯甲烷的极性比正己烷更强,所以对极性稍高的Phe的提取能力强,对极性稍弱的4环和5环的PAHs提取能力弱^[30]。为了避免单一溶剂的缺陷,选取正己烷:二氯甲烷 (9:1,V/V) 的混合溶液作为洗脱剂,硅胶柱的回收率达到84.5%~101.5%,标准偏差在0.2%~2.4%之间;Al₂O₃-硅胶柱达到82.7%~97.6%,标准偏差为0.4%~1.6%。

  图 2

  

  图 2  不同淋洗液对SPE柱中PAHs的回收率(a:硅胶柱,b:Al₂O₃-硅胶柱)

  Figure 2.  PAHs recoveries with different leacheates in solid phase extraction column (a: silica gel column,b: Al₂O₃- silica gel column)

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  3.3.2.   SPE柱洗脱剂用量的优化

  由3.2.1结论得出,本实验选用正己烷-二氯甲烷(9:1,V/V)作为SPE柱(硅胶柱和Al₂O₃-硅胶柱)的洗脱剂。向正己烷润洗后的SPE柱加入1.0 mL 500 μg/L的PAHs混标溶液,分别用5,8,10,12,15和20 mL的洗脱剂正己烷-二氯甲烷(9:1,V/V)进行洗脱,HPLC进行定量分析,以洗脱剂体积为横坐标,回收率为纵坐标,绘制洗脱曲线。

  不同淋洗体积下PAHs的洗脱效果如图 3所示。可以看出,当淋洗体积为10 mL时,7种PAHs都能被彻底洗脱,因此本实验选择10 mL为两种SPE柱的最佳洗脱体积。

  图 3

  

  图 3  SPE柱中7 PAHs的洗脱曲线(a:硅胶柱,b:Al₂O₃-硅胶柱)

  Figure 3.  Elution curve of 7 PAHs in solid phase extraction column(a: silica gel column,b:Al₂O₃- silica gel column)

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  4.   结 论

  采用正己烷-丙酮(4:1,V/V)作为提取液,ASE提取技术提取土壤及蚯蚓中的PAHs,提取液经SPE柱净化,其中土壤样品用硅胶柱,蚯蚓样品用Al₂O₃-硅胶柱,洗脱剂用正己烷-二氯甲烷(9:1,V/V)的混合溶剂,洗脱体积为10 mL,最后用HPLC测定提取液中的PAHs的浓度。通过土壤及蚯蚓加标实验验证,土壤样品7种PAHs的回收率在83.5%~110.2%之间,相对标准偏差为1.1%~4.6%;蚯蚓样品的回收率在81.2%~97.1%之间,相对标准偏差为1.6%~4.2%。表明本方法可以准确用于土壤及蚯蚓样品中PAHs的定量分析。

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      ZHANG Qian, LIU Xiao-Wei, LUO Ming, WANG Lu, LI Hong, WANG Di, XU Ya-Ping. Environ. Chem., 2011, 30(4): 771-777 张 茜, 刘潇威, 罗 铭, 王 璐, 李 红, 王 迪, 徐亚平. 环境化学, 2011, 30(4): 771-777

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  Figure 1  HPLC chromatogram of 7 PAHs detected by FLD detector

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  Figure 2  PAHs recoveries with different leacheates in solid phase extraction column (a: silica gel column,b: Al₂O₃- silica gel column)

  二氯甲烷(Dichloromethane); 正己烷(n-hexane); 正己烷:二氯甲烷(n-hexane:dichloromethane)(9:1)

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  Figure 3  Elution curve of 7 PAHs in solid phase extraction column(a: silica gel column,b:Al₂O₃- silica gel column)

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  Table 1.  Fluorescence detector wavelength program for 7 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

  保留时间Retention time (min)	激发波长Excitation wavelength (nm)	发射波长 Emission wavelength(nm)	PAHs
  0.1~4.3	245	365	菲 Phenanthrine, Phe
  4.3~5.5	270	390	芘 Pyrene,Pyr
  5.5~8.0	266	403	䓛Chrysene, Chry; 苯并[b]荧蒽Benzo [b] fluoranthene,BbF
  8.1~14.9	260	420	苯并[a]蒽Benzo [a] anthracene, BaA; 苯并[k]荧蒽Benzo [k] fluoranthene, BkF; 苯并[a]芘Benzo [a] pyrene, BaP
  15.0	Stop

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  Table 2.  Standard curves and detection limits

  化合物 Compound	校准曲线Linear regression equation	相关系数Correlation coefficient (R2)	相对标准偏差 RSD (%)	方法检出限 Limit of detection (μg/kg)
  Phe	y=8.99598×10-5x + 1.43463	1.0000	1.5	0.85
  Pyr	y=3.49478×10-5x+ 1.13369	0.9999	2.2	0.35
  Chry	y=2.10463×10-5x+ 1.96916	0.9999	3.0	0.25
  BbF	y=4.09655×10-5x－ 2.12086	1.0000	2.6	0.25
  BaA	y=0.00017×10-5x+ 2.58186	0.9999	1.7	0.15
  BkF	y=2.09002×10-5x－1.97394	1.0000	2.3	0.35
  BaP	y=5.44737×10-5x－0.48174	0.9998	3.9	0.20

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  Table 3.  Optimization of ASE extraction solvents

  萃取体系Extraction system	加标量 Added (μg/kg)	回收率Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%, n=3)
  二氯甲烷 Dichloromethane	100	~~110.3	5.7~9.3
  丙酮 Acetone	100	87.1~105.6	6.4~7.5
  正己烷 n-Hexane	100	66.6~92.4	1.1~2.5
  正己烷-丙酮 n-Hexane-aceton (1:1, V/V)	100	83.6~108.2	2.4~4.6
  正己烷-丙酮 n-Hexane-aceton (4:1, V/V)	100	87.4~112.2	1.0~1.4

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  Table 4.  Recoveries of 7 PAHs in soils and earthworms samples (n=3)

  Phe 83.5 4.6 85.2 3.6 81.2 4.2 83.3 3.6

  PAHs	土壤样品 Soilsample						蚯蚓样品 Earthworm sample
  	添加浓度 Added(100 μg/kg)			添加浓度 Added(500 μg/kg)			添加浓度 Added(100 μg/kg)			添加浓度 Added(500 μg/kg)
  	回收率Recovery(%)	标准偏差RSD(%)		回收率Recovery(%)	标准偏差RSD(%)		回收率Recovery(%)	标准偏RSD(%)		回收率Recovery(%)	标准偏差RSD(%)
  Pyr	99.1	2.2		97.3	2.1		93.1	2.3		94.5	2.8
  Chry	93.2	1.0		98.3	2.8		92.7	3.5		95.6	2.6
  BbF	94.7	2.3		95.7	1.6		93.6	1.56		92.1	1.8
  BaA	93.6	2.0		99.1	3.4		89.9	2.0		94.9	1.9
  BkF	108.9	1.7		110.2	4.5		96.4	2.8		97.1	3.6
  BaP	80.8	2.6		86.9	2.9		81.3	1.6		82.8	2.5

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