English

• 1.   引 言

  近年来,水质污染日益严重,越来越多的毒性物质流入水体,对生物产生各种各样的毒性效应^[1]。因此,为了保障用水安全必须实现水体急性毒性的快速检测。传统的水体毒性检测方法采用了精确的终点生物化验法,例如：死亡率、生长率等。采用的受试体则包括高等动物浮游生物(D. magna)^[2]、藻类^[3]、鱼类等^[4]。但是,这些检测手段耗时(24~96 h)、成本高,需要特殊的设备和专业的工作人员。微生物种群数量大、生长周期短、对环境变化的敏感性高,具有与高等动物类似的物理化学特性以及酶作用过程等特点,适合开发省时、低耗、无道德争议的生物学毒性测试方法,因此,以微生物为毒性检测受试体的水体急性毒性快速检测方法引起越来越多的关注^{[5, 6]}。

  目前,以微生物作为毒性检测受试体的水体急性毒性检测方法的毒性响应机理主要是毒性物质能够引起微生物的活性变化,包括微生物的光学活性^{[7, 8]}、呼吸活性^[9~11]以及催化活性等^[12]。然而,毒性的作用方式不仅可以改变微生物的活性,还可以改变微生物的结构^[13]。最近,本课题组以细胞膜受损作为微生物的毒性响应机理,建立了一种以中性红为信号分子的水体急性毒性比色检测方法^[14]。该方法简单、快速、可以使用不同的微生物作为毒性检测的受体,具有很好的应用前景。

  本研究在前述工作的基础上,建立了一种基于亚甲基蓝的水体急性毒性快速检测方法。此方法以亚甲基蓝为信号分子,以微生物细胞膜的损伤为毒性响应机理,其对3,5-二氯苯酚(DCP)、As³⁺和Hg²⁺的最低响应浓度分别为1.6、12.5和3.2 mg/L。与使用中性红作为信号分子的方法比较^[14],使用亚甲基蓝作为信号分子可以提高对Hg²⁺的毒性响应灵敏度,但是却降低了对3,5-二氯苯酚的毒性响应灵敏度。尽管如此,本研究报道的方法对DCP的最低响应浓度仍然要低于商业化仪器Baroxymeter^[15]。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  Leica TCS SP2激光共聚焦显微镜(德国莱卡公司)；Centrifuge 5804R 离心机(德国Eppendorf公司)； Cary 50紫外可见分光光度计(美国Varian公司)。DCP(Sigma-Aldrich公司)；1 g/L Hg²⁺和As³⁺标准溶液(国家有色金属及电子材料分析中心)； 亚甲基蓝(阿拉丁试剂(上海)有限公司)；荧光假单胞细菌种(中国普通微生物菌种保藏管理中心)；其它试剂为国产分析纯。所有试剂未经纯化处理,直接使用。实验用水为去离子水。0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)。1.0 g/L DCP和苯酚溶液,用于毒性检测。

  2.2.   实验方法

  荧光假单胞细菌的培养和保存方法参照文献^[14],培养好的细菌在室温下,6000 r/min离心收集,并用0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗两遍。将洗好的细菌重新分散到0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液中,并将所得细菌的悬浊液在4℃保存,待用。所有的细菌都是当天使用。

  亚甲基蓝溶液为新鲜配制。细菌用0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释至所需浓度。细菌浓度用其在600 nm处的吸光度值(OD₆₀₀)表示,OD₆₀₀=1对应的细胞浓度为1×10⁸ CFU。含有不同浓度毒性物质的溶液均由0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释其1 g/L母液获得。在毒性检测中,将400 μL细菌悬浊液、100 μL 毒性溶液与500 μL 亚甲基蓝溶液混合,其中,标准样(无毒)中用0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液代替毒性溶液。将所有样品在4℃存放60 min,然后离心去除样品中的微生物,测量上层清夜吸光度值,从而获得残余亚甲基蓝的量,用于毒性分析。毒性的强弱用移除率(R)表示,如公式(1):

  1 \begin{document} $R\left( \% \right) = \left( {1 - {{{A_T}} \over {{A_C}}}} \right) \times 100\% $ \end{document}

  其中,A_T和A_C分别代表有毒和无毒样品的上层清液中残余亚甲基蓝在655 nm处的吸收峰强度值。将移除率为5%时所需的毒性物质的浓度定义为本检测方法对相应的毒性物质的最低响应浓度。Removal₅₀值为移除率为50%时所需毒性物质的浓度。用Removal₅₀值与其它方法的半数抑制率进行比较,判断本方法对毒性物质的灵敏度。

  3.   结果与讨论

  3.1.   基于亚甲基蓝的水体急毒性检测方法的可行性

  本方法的检测机理为：当有毒性物质存在并对细胞膜产生破坏时,溶液中的亚甲基蓝会进入细胞,对细胞进行染色,降低溶液中的亚甲基蓝浓度。通过光谱法检测溶液中亚甲基蓝浓度的变化,可以实现对水体急性毒性的快速检测,如图 1所示。为了验证本方法的可行性,含有OD₆₀₀=2的荧光假单胞细菌与5 μmol/L亚甲基蓝的混合溶液分别在有和没有30 mg/L DCP存在情况下,于4℃放置60 min,然后对样品进行离心处理,最终得到的水样的照片如图 2所示。结果表明,只有在毒性物质DCP存在的条件下,荧光假单胞细菌才可以被亚甲基蓝染色,因此证明本方法可行。

  图 1

  

  图 1  基于亚甲基蓝的水体急毒性检测方法原理示意图

  Figure 1.  Schematic illustration of the detection mechanism of the proposed methylene blue based method towards the acute water toxicity

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  图 2

  

  图 2  荧光假单胞细菌在有(A)和无(B)3,5-二氯苯酚 (DCP) 情况下,在4℃与亚甲基蓝作用60 min后的照片。细菌采用离心富集

  Figure 2.  Photographs of P. fluorescens after incubation with 3,5-dichlorophenol (DCP) (A) and without DCP (B) at 4℃ for 60 min. The P. fluorescens was collected by centrifugation

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  在含有OD₆₀₀=2的荧光假单胞细菌和5 μmol/L 亚甲基蓝的溶液中加入终浓度为10 mg/L的Hg^{2+[16, 17]},于4℃放置60 min,然后离心收集荧光假单胞细菌,并进行激光共聚焦扫描显微镜表征,激发线543 nm(图 3)。为了避免细胞表面吸附亚甲基蓝对荧光检测的干扰,用0.2 mol/L磷酸盐缓冲清洗细菌一次。从图 3可见,只有当毒性污染物Hg²⁺存在时,荧光假单胞细菌才能显示出明显的荧光,从而表明只有存在毒性污染物时,荧光假单孢细菌才可以被亚甲基蓝染色。激光共聚焦扫描显微镜结果进一步证明了本方法的有效性。

  图 3

  

  图 3  荧光假单胞细菌在有(A,C)和无(B,D)Hg²⁺存在条件下与亚甲基蓝作用60 min后的激光共聚焦显微镜照片和明场与荧光叠加照片。激发光为543 nm

  Figure 3.  Confocal images and overlay laser confocal microscopic (CLSM) images and bright field of P. fluorescens after incubation with (A,C) and without (B,D) 10 mg/L Hg²⁺. The excitation line is 543 nm

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  3.2.   亚甲基蓝浓度对水体急毒性检测灵敏度的影响

  在水样中加入终浓度为OD₆₀₀=2的荧光假单胞细菌与终浓度为5,10,20和40 μmol/L的亚甲基蓝溶液,随后将水样在有和没有终浓度为10 mg/L DCP的情况下,恒温4℃放置60 min。将样品中的荧光假单胞细菌离心去除,并将所得的上层清液用紫外-可见分光光度计表征。如图 4A所示，亚甲基蓝有两个明显的吸收峰,分别位于655和609 nm。随着亚甲基蓝浓度升高,亚甲基蓝的吸收峰强度逐渐增加。对于加入了相同浓度亚甲基蓝溶液的水样,当有毒性污染物DCP存在时,亚甲基蓝的吸收峰明显比降低,而且有毒性和没有毒性的水样在655 nm处的吸收强度差异逐渐增大(图 4B)。如图 4B所示,对于含有亚甲基蓝的终浓度为5,10,20和40 μmol/L的水样,根据公式(1)计算出的移除率分别为30.1%,32.4%,29.1%和23.8%。因此,当亚甲基蓝溶液的浓度不大于20 μmol/L时,其对毒性检测结果的影响很小。综合考虑检测信号的强度差异和毒性检测的灵敏度,最终选择20 μmol/L为亚甲基蓝最佳使用浓度,用于后续的毒性检测。图 4C是不同浓度亚甲基蓝溶液在655 nm处的吸收峰强度曲线,当亚甲基蓝溶液的浓度在5~20 μmol/L之间,其吸收峰强度与浓度呈线性关系,符合郎伯比尔定律。当亚甲基蓝的浓度为40 μmol/L时,609与655 nm处吸收峰强度之比值比低浓度时明显增大,表明在该浓度下亚甲基蓝溶液中形成了分子聚集体,并导致其655 nm处吸收峰强度与低浓度时不成线性，此时其吸收峰强度的变化与浓度的变化呈非线性关系。这也是在40 μmol/L亚甲基蓝条件下获得的10 mg/L DCP的移除率明显降低的原因。

  图 4

  

  图 4  (A)含有不同浓度亚甲基蓝的样品在有和无DCP存在下,4℃静置60 min后,溶液中残留的亚甲基蓝的吸收光谱；(B)残留亚甲基蓝在655 nm处的吸收峰强度差值和亚甲基蓝的移除率与亚甲基蓝使用浓度的关系图；(C)亚甲基蓝在655 nm处的吸收峰强度随其浓度变化的关系图

  Figure 4.  (A) UV-visible spectra of residual NR in supernatant solutions over 60-min incubation at 4℃ in the presence and absence of 10 mg/L DCP. The concentration of P. fluorescens used is OD₆₀₀=2; (B) The plot of deviation of the absorption peaks at 655 nm and the removal ratio in the presence and absence of 10 mg/L DCP as a function of the concentration of methylene blue (MB) used. (C) The plot of the absorption peak intensity at 655 nm in the absence of DCP as a function of the concentration of MB used

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  3.3.   对DCP、As³⁺和Hg²⁺的毒性检测

  从图 5可见,本方法对DCP、As³⁺和Hg²⁺的最低响应浓度分别为1.6,12.5和3.2 mg/L,与文献中报道的使用中性红作为毒性检测指示剂的水体急毒性检测方法和基于电子媒介体的水体急毒性检测方法基本一致(表 1),并且其对DCP的最低响应浓度比商业化的毒性检测仪器Baroxymeter (25 mg/L)低^[15]。毒性最低响应浓度越低,越适用于毒性的在线监测应用。如微生物燃料电池和电化学媒介体法都以检测信号降低10%为毒性报警的界限值。因此,本方法在水体急毒性的现场分析中具有广阔的应用前景。此外,从表 1可知,使用中性红作为信号分子时获得的DCP和Hg²⁺的半数移除率(Removal₅₀)都是20.0 mg/L,而使用亚甲基蓝作为信号分子时,DCP的半数移除率大于100 mg/L,Hg²⁺的半数移除率为6.4 mg/L。因此,以细胞膜结构变化为毒性响应的水体急毒性检测方法,其检测的灵敏度与所用染料明显相关,这可能与不同染料分子与细胞膜和毒性物质的作用不同有关。

  图 5

  

  图 5  不同浓度(A)3,5-二氯苯酚(B)As³⁺(C)Hg²⁺存在下的残留亚甲基蓝在655 nm的吸收值以及移除率与相应毒性物质浓度的关系图；荧光假单胞细菌浓度为OD₆₀₀=2,亚甲基蓝使用浓度为20 μmol/L

  Figure 5.  Plot of the peak intensity at 655 nm and the removal ratio as a function of the concentration of DCP (A),Hg²⁺(B) and As³⁺ (C). The concentration of P. fluorescens and MB used are OD₆₀₀ = 2 and 20 μmol/L,respectively

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  表 1

  

  表 1  不同毒性检测方法对毒性物质的响应(3种方法都使用荧光假单胞细菌)

  Table 1.  Response of different method for water acute toxicity determination to toxic chemicals (P. fluorescens were used for three tests)

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  毒性物质Toxicchemicals	基于亚甲基蓝的水体急毒性检测方法[14]MB-based acute toxicity method			基于中性红的水体急毒性检测方法Neutral red-based acute toxicity method			基于电子媒介体的水体急毒性检测方法[14]Ferricyanide-based acute toxicity method
  	最低响应浓度Detection limit(mg/L)	50%移除率Removal50(mg/L)		最低响应浓度Detection limit(mg/L)	50%移除率Removal50(mg/L)		最低响应浓度Detection limit(mg/L)	50%移除率Removal50(mg/L)
  DCP	3.2	>100.0		3.2	20.0		6.2	10.0
  As3+	12.5	>100.0		12.5	>100.0		25.0	120.0
  Hg2+	3.2	6.4		1.2	20.0		5.0	10.0

  实验结果表明，本方法对DCP，As³⁺和Hg²⁺等毒性物质的最低响应浓度低,适合用于水体急毒性的预警与检测。这种基于毒性物质对微生物膜结构破坏的毒性检测方法的检测灵敏度与所用染料的种类有关。因此,可以通过选择合适的染料开发出对某类毒性物质具有高灵敏性的水体急毒性检测方法,在进行毒性检测时可以对毒性物质的种类进行鉴别。

• 1. [1]

     Tencaliec A M, Laschi S, Magearu V, Mascini M. Talanta, 2006, 69(2): 365-369

  2. [2]

     Sorvari J, Sillanpää M. Chemosphere, 1996, 33(6): 1119-1127

  3. [3]

     Moreira-Santos M, Soares A, Ribeiro R. Environ. Toxicol. Chem., 2004, 23(6), 1549-1560

  4. [4]

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  5. [5]

     Liu C, Yong D M, Yu D B, Dong S J. Talanta, 2011, 84(3): 766-770

  6. [6]

     Ma H P, Yong D M, Kim H, Zhang Z J, Ma S H, Han X J. Electroanalysis, 2016, 28(3): 580-587

  7. [7]

     Weitz H J, Campbell C D, Killham K. Environ. Microbiol., 2002, 4(7): 422-429

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     Hsieh C Y, Tsai M H, Ryan D K, Pancorbo O C. Sci. Total Environ, 2004, 320(1): 37-50

  9. [9]

     QIAN Jun, LI Jiu-Ming, ZHI Jin-Fang, QIN Shi-Dong. Chinese J. Anal. Chem., 2013, 41(5): 738-743钱俊, 李久铭, 只金芳, 覃事栋. 分析化学, 2013, 41(5): 738-743

  10. [10]

      Tzoris A, Fernandez-Perez V, Hall E A H. Sensor. Actuat B, 2005, 105(1): 39-49

  11. [11]

      Wang X J, Liu M, Wang X, Wu Z, Yang L Z, Xia S Q, Chen L, Zhao J F. Biosens. Bioelectron., 2013, 41: 557-562

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      Fang D Y, Yu Y, Wu L Z, Wang Y, Zhang J H, Zhi J F. RSC Adv., 2015, 5(73): 59472-59479

  13. [13]

      Popovtzer R, Neufeld T, Biran N, Ron E Z, Rishpon J, Shacham-Diamand Y. Nano Lett., 2005, 5(6): 1023-1027

  14. [14]

      Zhai J F, Liu L, Yong D M, Li D, Dong S J. Anal. Methods, 2012, 4(11): 3849-3854

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  Figure 1  Schematic illustration of the detection mechanism of the proposed methylene blue based method towards the acute water toxicity

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  Figure 2  Photographs of P. fluorescens after incubation with 3,5-dichlorophenol (DCP) (A) and without DCP (B) at 4℃ for 60 min. The P. fluorescens was collected by centrifugation

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  Figure 3  Confocal images and overlay laser confocal microscopic (CLSM) images and bright field of P. fluorescens after incubation with (A,C) and without (B,D) 10 mg/L Hg²⁺. The excitation line is 543 nm

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  Figure 4  (A) UV-visible spectra of residual NR in supernatant solutions over 60-min incubation at 4℃ in the presence and absence of 10 mg/L DCP. The concentration of P. fluorescens used is OD₆₀₀=2; (B) The plot of deviation of the absorption peaks at 655 nm and the removal ratio in the presence and absence of 10 mg/L DCP as a function of the concentration of methylene blue (MB) used. (C) The plot of the absorption peak intensity at 655 nm in the absence of DCP as a function of the concentration of MB used

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  Figure 5  Plot of the peak intensity at 655 nm and the removal ratio as a function of the concentration of DCP (A),Hg²⁺(B) and As³⁺ (C). The concentration of P. fluorescens and MB used are OD₆₀₀ = 2 and 20 μmol/L,respectively

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  Table 1.  Response of different method for water acute toxicity determination to toxic chemicals (P. fluorescens were used for three tests)

  毒性物质Toxicchemicals	基于亚甲基蓝的水体急毒性检测方法[14]MB-based acute toxicity method			基于中性红的水体急毒性检测方法Neutral red-based acute toxicity method			基于电子媒介体的水体急毒性检测方法[14]Ferricyanide-based acute toxicity method
  	最低响应浓度Detection limit(mg/L)	50%移除率Removal50(mg/L)		最低响应浓度Detection limit(mg/L)	50%移除率Removal50(mg/L)		最低响应浓度Detection limit(mg/L)	50%移除率Removal50(mg/L)
  DCP	3.2	>100.0		3.2	20.0		6.2	10.0
  As3+	12.5	>100.0		12.5	>100.0		25.0	120.0
  Hg2+	3.2	6.4		1.2	20.0		5.0	10.0

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