紫外线(Ultraviolet,UV)辐射具有强烈的生物学效应,可导致皮肤衰老、晒伤、炎症、免疫抑制,甚至引发皮肤癌[1~3]。中波紫外线(Ultraviolet B,UVB,290-320nm)又称紫外线的晒伤(红)段,短时间的UVB照射即可使皮肤发生红斑效应和损伤,如组织脱水,皮肤脱落等; 长时间的UVB照射,皮肤会出现红斑,严重者可引发皮肤癌,所以它是重点预防的紫外线波段[4~7]。关于紫外线照射而引起的生物学效应已有诸多报道,但是关于其机制的研究主要集中在观察一些生理生化指标和大分子标记物的含量或表达的改变,如DNA、蛋白质、酶类等[8~13]; 小分子物质虽然也有报道,如尿刊酸(UCA)、神经酰胺类等,但都只是着眼于局部的变化,系统、全面地评价紫外线对生物体扰动产生的内源性标记物变化[14~17]的报道不多。
代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)是从整体分析生物体系受外界刺激或扰动后其内源性代谢产物种类、数量及其变化规律的科学[18, 19],其代表分析手段有核磁共振技术、液相色谱-质谱联用技术等,核磁共振技术的优点在于其对样本分析的高选择性及无损伤性,而液相色谱-质谱技术则有更高的灵敏度和分辨率,随着快速高分辨液相色谱(RRLC)及超高效液相色谱(UPLC)的发展,更高灵敏度、更高分辨率及分离度的方法被开发出来,使该技术更适合于代谢组学的研究[20, 21]。
本研究通过建立代谢组学的分析思路与方法,考察UVB照射前后的大鼠尿液中内源性代谢物谱的变化,研究UVB辐射导致急性光损伤的生理机制,为早期临床治疗提供依据。
Agilent1200 快速分离液相色谱系统(美国Agilent Technologies 公司),配备高压二元泵,控温自动进样器; Agilent 6520 Q-TOF 质谱仪(美国Agilent Technologies 公司),配有ESI 离子源和在Mass Hunter数据采集处理系统; Eppendorf 5804R高速离心机(德国Eppendorf公司),TL-01窄谱中波紫外线光源采用飞利浦紫外线灯(峰值311-313 nm); UV-340A紫外线辐照计(280-400 nm,台湾路昌公司)。乙腈(色谱级,美国TEDIA公司); 和甲酸(色谱级,美国Sigma公司); 超纯水由美国Millipore 公司的Milli-Q系统制得。标准品购自Sigma-Aldrich公司。
雄性Wistar大鼠16只,体重(180 ± 30)g,动物合格证号: SCXK-(吉)2011-0007,由长春生物制品有限公司动物中心提供。在标准环境下(湿度 50%±10%; 温度 (25±2)℃; 12 h 昼夜循环)进食进水,放入代谢笼内适应性饲养3天,实验前禁食12 h,实验过程中所有动物都受到精心照顾。
取上述雄性大鼠16只,用婴儿理发器剃除整个大鼠背部(尾部至颈部)的绒毛,每3天剃毛一次,实验前随机分成空白对照组与UVB模型组,每组8只。UVB辐照剂量和造模周期与文献[5, 22]相似,并适当改进: 在对将照射Wistar大鼠置于自制的鼠盒中,自由活动,活动期间禁食不禁水。UVB照射时,大鼠背部暴露在距光源30～42 cm处,每次剂量为170 mJ/cm2,连续UVB照射5天,从第6天开始,每2天照射一次,共14天(10次),UVB总剂量为2.38 J/cm2,照射后送回动物饲养室。连续收集14天健康对照组、UVB模型组的24 h尿液样品,于-80℃冷冻贮藏。样品采用离心沉降后四倍稀释法[23],检测前,室温融化尿液样品,在4℃以12000 r/min离心10 min,取250μL上清液蒸馏水稀释至1 mL,用0.22 μm滤膜过滤,供RRLC-Q-TOF-MS测定。
样品用RRLC/MS进行检测,得到样品的总离子流色谱图,用Mass Hunter软件分子特征提取(Molecular feature extract,MFE)模式下进行峰校准、背景扣除、面积归一化和数据简化处理,将结果转化为包含化合物的保留时间和质荷比信息的化合物转换文件(Compound exchange file,CEF),之后将CEF文件导入Mass Profiler Professional (MPP,Agilent Technologies,USA)统计软件进行滤噪和归一化,单变量数据统计采用t检验(t-test),倍性变化分析(Fold-change analysis,FC),参数检验(One way ANOVA)等方法,用p值评估单变量方法处理的数据是否具有统计学意义,当p＜0.05被认为据有统计学意义,Fold-change 分析中,倍数(FC)≥2时被认为差异具有意义。多变量数据分析采用主成分分析法(PCA),通过PCA载荷图发现可作为生物标记物的化合物。运用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法建立预测模型,选取基于PCA分析得出的特征项列表,以原样本的2/3建立训练集,剩余的1/3作为验证集,验证该特征项在UVB辐射致光损伤模型诊断上的预测能力。在鉴定潜在生物标时用到以下数据库: HMDB (http://www.hmdb.ca/), METLIN(http://metlin.scripps.edu/), MASSBANK(http://www.massbank.jp/), KEGG (http://www.genome.jp/)。
从所有待测尿液样品中各取50 μL混合,制成质控样品,用于方法验证。每5个样品运行一个质控样品,根据结果评价系统稳定性及重现性。正离子模式和负离子模式各选取5个离子,选取的正离子为m/z 126.0892,238.1078,311.1618,180.0467和436.1628; 选取的负离子为m/z 296.2363,165.0673,189.9957,314.249和269.033,提取它们的保留时间和峰面积进行方法学验证。
采用正负两种电离模式,气体温度: 350℃; 干燥气流速: 8 L/min; 喷雾气压: 276 kPa; 毛细管电压: 3.5 kV; 裂解电压: 220 V; 锥孔电压: 65 V; 质量扫描范围: m/z 50～1000。在样品测试之前,使用调谐液校正质量轴。
采用Supelco Ascentis® Express C18 HPLC 色谱柱(50 mm×3.0 mm,2.7 μm),流动相: A为超纯水(含体积百分比0.1%甲酸),B为乙腈; 流动相梯度: 正谱: 0-12 min,5%~25% B; 12-20 min,25%~70% B; 20-25 min,100% B; 负谱: 0-7 min,5%~25% B; 7-15 min,25%~70% B; 15-21 min,100% B。每次进样前,色谱柱在初始流动相条件下平衡8 min。柱温: 35℃; 流速: 0.3 mL/min,进样量8 μL。
RRLC-Q-TOF-MS系统的重复性和稳定性结果显示: 这10个离子的保留时间、质荷比和峰面积的系统稳定性分别为0.13%~0.38%,0.0001%~0.0007%和6.8%~8.5%。结果表明,在整个分析过程中,色谱分离和质谱检测均具有很好的稳定性和重现性。
图 1是空白对照组与UVB模型组的大鼠尿液经RRLC-Q-TOF-MS分析、优化色谱条件得到的正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI－)下的基峰强度(Base peak intensity,BPI)色谱图。
植物鞘氨醇(Phytosphingosine)作为皮肤的重要组成,具有诱导癌细胞凋亡、抗炎、抗真菌剂、抑制痤疮的作用,本实验中UVB照射的直接结果是导致大鼠体内植物鞘氨醇的水平下调,UVB可导致机体免疫器官、呼吸器官损伤,正常水平的植物鞘氨醇可以一定程度上维持这两种器官的正常生理功能,而当植物鞘氨醇水平下调时,容易使受损器官细胞由炎症向癌症发展; 本实验中UVB照射而导致的间接结果是,UVB照射刺激或干扰了鞘磷脂代谢通路(Sphingolipid metabolism pathway)的正常运行,照射可导致丝氨酸棕榈酰转移酶(Serine palmitoyltransferase)和神经酰胺酶(CDase)活性的下降,从而使其下游产物的含量发生变化,前者是UV长期照射而导致的结果,后者低剂量的UV即可发生[24]。推测体内植物鞘氨醇水平的下调可能与Serine palmitoyltransferase活性的下降有关,CDase活性的抑制,可导致神经酰胺(Ceramide)在细胞内大量累积,造成细胞生长受到抑制或者凋亡。本实验涉及Ceramide的刺激源包括UVB的直接照射、由照射引发的体内细胞因子TNF-α、IL-1β和维生素D水平的升高等,Serine palmitoyltransferase活性下降同样会导致Ceramide和S-1-P的产量下降,由于受UV照射影响,S-1-P的下降速度更快,从而影响细胞内二者的比值Ceramide/S-1-P,最终的结果可能是导致细胞的凋亡[25~30]。
7-甲基鸟嘌呤(7-Methylguanine,m7Gua)是在正常人生物流体中发现的DNA甲基化和脱嘌呤产物,被认为是肺癌的重要生物标记物。烟草中的烟草特异性亚硝胺(Tobacco-specic nitrosamines,TSNA),经代谢活化后,可以形成许多DNA加合物,其中的m7Gua占总加合物量的70%～90%[31]。DNA加合物可导致变异的发生,具有潜在的致癌作用,这些变异如果发生在调控细胞生长作用的基因中,将会引发良性肿瘤,并进一步发展成恶性肿瘤(癌症)[32]。本实验中UVB照射对正常大鼠的影响包括呼吸、免疫、皮肤等多器官的损伤,同时对大鼠的饮食也产生了一定的负作用,m7Gua的上调验证了大鼠的正常身体状态受到了影响,与上述报道结果一致。
黄素单核苷酸(Flavin mononucleotide,FMN)是核黄素激酶催化核黄素(维生素B2)的产物,是各种氧化还原酶,在催化循环的过程中,其氧化形式FMN,半醌式FMNH·,FMNH2式结构可在各种氧化还原酶的催化下相互转换。FMN是一种比NAD还要强的强氧化剂,因为它可以参与1个或2个电子的转移,主要以核黄素的形式存在于细胞和组织中。维生素B2又叫核黄素,当体内缺乏该物质时,将会影响机体的生物氧化,影响叶酸、维生素B6和维生素B12等其他B族维生素的代谢进而影响机体的抗氧化能力,致使代谢发生障碍[33]。由于体内维生素B2的储存是很有限的,因此每天都要由饮食提供。维生素B2的两个性质是造成其损失的主要原因: (1)对光敏感,光照下不稳定,可由光照破坏; (2)在热碱溶液中不稳定。游离型的核黄素对日光照射,特别是紫外线照射高度敏感,在碱性溶液中能光解为光黄素而丧失活性[34]。在本实验中,UVB的高剂量照射可能破坏模型组的大鼠体内维生素B2结构,导致体内的维生素B2的大量损失,其下游产物FMN在体内的含量也随之下降,可见UVB可以通过干预核黄素代谢通路来影响FMN在体内的含量。
本研究利用代谢组学的方法,通过使用RRLC-Q-TOF高分辨质谱手段研究UVB辐射诱导大鼠尿液中代谢物的变化机制,通过单变量数理统计结合多元统计分析数据表明,正常对照组与UVB模型组能够很好地区分,发现并鉴定了11种差异代谢物,它们在UVB模型组大鼠尿液中浓度的变化,表明了UVB辐射可影响正常大鼠的鞘脂类代谢、核酸代谢、亚油酸代谢、氨基酸代谢等通路,经鉴定的11种差异代谢物可作为UVB辐射造成大鼠损伤的潜在潜在的生物标志物。经PLS-DA分析验证,该模型中的差异代谢物对UVB辐射导致的光损伤疾病具有较好的预测能力。
通过Agilent Mass Hunter Workstation对RRLC-Q-TOF-MS获得数据进行分子特征识别,将提取出来的化合物列表导入MPP软件,经过处理,在正离子模式下获得了15938个化合物数据,经t检验分析,得到88个在两组比较中具有统计学意义的变量(p＜0.05),经FC分析,得到FC≥2的共有88个变量; 负离子模式下,得出7448个化合物数据,t检验分析得到具有显著差异的变量470个(p＜0.05),经FC分析,得到FC≥2的共有470个变量。
为了观察大鼠总体代谢轮廓的变化,将所有14天所采集的模型组的大鼠尿液进行动态的代谢物分析,将RRLC-(+) ESI－MS采集的分析样本PCA分析,每天数据样为一组,选取其中具有代表性的3组与空白对照组比较,其得分图(PCA Scores plot)见图 2,图 2显示的大鼠尿液样本有6个明显的聚类,包括空白对照组第3天、模型组第3天,空白对照组第9天、模型组第9天,空白对照组第14天及模型组第14天,显示出空白组与模型组大鼠的动态代谢变化。实验第3天,未经照射的大鼠生理代谢与照射模型组大鼠有一定的区分,但不明显; 通过生理药理实验得出(该部分工作另行发表),模型组大鼠在照射第3天开始出现畏光,进食量减少,背部皮肤出现大面积红斑,最明显的是耳缘部位出现黑色晒伤结痂生理病理改变。随着UVB照射剂量的继续加大,大鼠皮肤及体内各个脏器所受到的损伤同时加重,系统免疫功能下降,在图 2中表现为空白组与模型组在第9天与第14天区分进一步加大。
为了进一步对数据进行分析,对实验第14天大鼠的尿液进行了PCA分析,在正离子模式和负离子模式下,空白对照组与UVB模型组在PCA Scores图中获得了明显区分,如图 3所示,图中每个点都代表一个样本在二维平面的投影,每个样本的位置由其自身的代谢决定,处于相同生理病理状态的样本,通常具有相似的代谢物组成,因此在得分图上也处于相似的位置,彼此之间距离越远,表示其生理病理状态相差越大。结果表明,经UVB辐射后的大鼠的尿液代谢物谱发生了明显的变化。
利用MPP软件包中的聚类分析(Cluster Analysis)功能对样本数据进行系统聚类,基于t检验筛选出的化合物且FC≥2的变量作为分析对象,以化合物的强度作为考察指标,统计不同类别之间的距离时,采用重心法(Centroid clustering)计算,结果如图 4所示,图中纵向的矩阵代表样本,横向代表化合物,化合物在样本中的强度用颜色的深浅来表示,相似颜色表示样本中含有该化合物的强度相似,上方树状结构为根据化合物在所有样本中强度的相似程度进行的层次聚类。从图 4可见,在正负离子模式下,性质相近的变量聚为一类,空白对照组与UVB模型组被分成性质不同的两大类,并且在组内各样本间化合物强度都比较相似,组间相似性差异较大,说明UVB照射对正常大鼠尿液代谢产生了较大的影响。
基于非监督模式的主成分分析(PCA)法对空白对照组与UVB模型组大鼠尿液代谢物进行区分,变量载荷图(Loadings)如图 5所示。根据载荷图的结果,选取其中距离原点较远,即对分组模型贡献较大的代谢物作为潜在生物标记物,在正离子模式下选定3个,负离子模式下选定11个。本研究的潜在标记物的鉴定是利用高分辨质谱检测到的分子离子与同位素丰度比确定其分子组成后,进一步通过串联质谱结果与数据库进行解析校对; 或通过购买标准品,比较两者的精确分子量、串联质谱数据及保留时间来完成的; 由于代谢组学考察的内源性代谢物的分子量范围在1000 g/mol以内,而质谱的质量精度在1000 g/mol时误差在为1×10-6,所以在使用数据库考察潜在生物标记物时,应选择测量值与真实值分子量误差差距小于1×10-6的化合物。通过以上的方法共鉴定出11种潜在的生物标记物,结果见表 1,它们分别是正离子模式下的: 神经碱(Neurine)、3-亚甲基-假吲哚(3-Methylene-indolenine)、植物鞘氨醇(Phytosphingosine); 负离子模式下的: 7-甲基鸟嘌呤(7-Methylguanine)、马尿酸(Hippuric acid)、L-甲硫氨酸(L-Methionine)、黄素单核苷酸(Flavine mononucleotide,FMN)、N-乙酰基-L-谷酰基-5-磷酸(N-Acetyl-L-glutamyl 5-phosphate)、9,10-二羟基-12(Z)-十八碳烯酸(9,10-dihydroxy-12(Z)-octadecenoic acid)、7-脱氢孕烯醇酮(7-Dehydropregnenolone)、13-羟基十八碳二烯酸(13(S)-Hydroxyoctadecadienoic acid,13-HODE)。
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保留时间 Retention time (min) | 质荷比 (m/z) | 化合物 Identified compound | 质量偏差 Mass deviation (×10-6) | 104P值 (UVB模型组对空白组) 104P value (UVB model group vs Control group) | 变化趋势 (模型组对空白组) Change trends (UVB model group vs Control group) | 变化倍数 Fold change |
| ESI+ | ||||||
| 2.26 | 126.0892 | 神经碱 Neurine | 2.6 | 12.8 | 下调 Down | 2.7 |
| 6.80 | 130.0643 | 3-亚甲基-假吲哚 3-Methylene-indolenine | 6.4 | 49.3 | 下调 Down | 2.4 |
| 16.36 | 318.2993 | 植物鞘氨醇 Phytosphingosine | 3.1 | 36.3 | 下调 Down | 2.5 |
| ESI－ | ||||||
| 1.15 | 164.0594 | 7-甲基鸟嘌呤 7-Methylguanine | 9.7 | 22.4 | 上调 Up | 2.7 |
| 1.25 | 178.0528 | 马尿酸 Hippuric acid | 10.0 | 0.63 | 下调 Down | 3.2 |
| 1.44 | 148.0451 | L-甲硫氨酸 L-Methionine | 8.9 | 22.6 | 下调 Down | 2.7 |
| 1.63 | 188.9878 | C6 H6 O5 S | － | 22.2 | 下调 Down | 2.7 |
| 4.02 | 160.0297 | C3H7 N5OS | － | 0.66 | 下调 Down | 3.2 |
| 4.20 | 455.0962 | 黄素单核苷酸 Flavine mononucleotide (FMN) | 2.5 | 1.69×10-13 | 下调 Down | 3.8 |
| 9.35 | 268.0251 | N-乙酰基-L- 谷酰基-5-磷酸 N-Acetyl-L-glutamyl 5-phosphate | 8.6 | 19.2 | 下调 Down | 2.7 |
| 11.07 | 229.1332 | C14H18N2O | － | 0.15 | 下调 Down | 3.3 |
| 13.82 | 313.2411 | 9,10-二羟基-12(Z)- 十八碳烯酸 9,10-dihydroxy 12(Z)- octadecenoic acid | 1.8 | 22.4 | 下调 Down | 2.7 |
| 14.07 | 313.2205 | 7-脱氢孕烯醇酮 7-Dehydropregnenolone | 10.0 | 79.9 | 下调 Down | 2.5 |
| 16.05 | 295.2284 | 13-羟基十八碳二烯酸 13(S)-Hydroxyoctadeca- dienoic acid | 1.8 | 102 | 下调 Down | 2.4 |
图 6所示为负离子模式下的离子m/z 164.0594鉴定过程,图 6A为该离子的提取离子流图,将其精确分子质量与数据库进行比对,初步鉴定为7-甲基鸟嘌呤,串联质谱分析结果证明了此结论,见图 6B,此结果与购买的标准品串联质谱结果及保留时间完全吻合。综上,此标记物被确定为7-甲基鸟嘌呤,其它生物标记物的鉴定过程同上所述。
利用PLS-DA法对全体样本数据,基于PCA分析得出的特征项,即t检验与倍性变化分析筛选出的标志物(p＜0.05,且FC≥2)为分析对象,得出在正负离子模式下,该模型对UVB致光损伤模型诊断能力准确度为100%。
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Figure 1 Representative base peak intensity chromatograms of urine samples from control group and ultraviolet B(UVB) model group
正离子模式下: A 空白对照组尿样,B UVB模型组尿样; 负离子模式下: C 空白对照组尿样,D UVB模型组尿样。
ESI+: control group (A),model group (B); ESI－: control group (C); model group (D)
Figure 2 Principal component analysis (PCA) scores plot of urine samples in positive ion mode
(■)空白对照组第3天尿样,(▲) 空白对照组第9天尿样,(●) 空白对照组第14天尿样,(+) 模型组组第3天尿样,(－) 模型组第9天尿样,(∣) 模型组第14天尿样。
(■) Control group on the 3rd day,(▲) Control group on the 9th day,(●) Control group on the 14th day,(+) Model group on the 3rd day,(－) Model group on the 9th day,(∣) Model group on the 14th day.
Figure 3 PCA Scores plot of urine samples on the 14th day
(a)正离子模式; (b)负离子模式。(■ 空白对照组,▲ 模型组第14天)。
(a) ESI+ ; (b)ESI-. (■ Control group,▲Model group on the 14th day ).
Figure 4 Clustering analysis on urine samples of UVB model group and control group on the 14th day
A:正离子模式; B: 负离子模式。
A: [ESI+],B: [ESI－].
Figure 6 Identifcation of a selected marker 7-methylguanine: (A) 7-methylguanine in extracted ion chromatogram with negtive mode; (B) MS/MS spectrum,the collision energy was 20 eV
Table 1. Identification result of biomarkers between UVB model group and control group
保留时间 Retention time (min) | 质荷比 (m/z) | 化合物 Identified compound | 质量偏差 Mass deviation (×10-6) | 104P值 (UVB模型组对空白组) 104P value (UVB model group vs Control group) | 变化趋势 (模型组对空白组) Change trends (UVB model group vs Control group) | 变化倍数 Fold change |
| ESI+ | ||||||
| 2.26 | 126.0892 | 神经碱 Neurine | 2.6 | 12.8 | 下调 Down | 2.7 |
| 6.80 | 130.0643 | 3-亚甲基-假吲哚 3-Methylene-indolenine | 6.4 | 49.3 | 下调 Down | 2.4 |
| 16.36 | 318.2993 | 植物鞘氨醇 Phytosphingosine | 3.1 | 36.3 | 下调 Down | 2.5 |
| ESI－ | ||||||
| 1.15 | 164.0594 | 7-甲基鸟嘌呤 7-Methylguanine | 9.7 | 22.4 | 上调 Up | 2.7 |
| 1.25 | 178.0528 | 马尿酸 Hippuric acid | 10.0 | 0.63 | 下调 Down | 3.2 |
| 1.44 | 148.0451 | L-甲硫氨酸 L-Methionine | 8.9 | 22.6 | 下调 Down | 2.7 |
| 1.63 | 188.9878 | C6 H6 O5 S | － | 22.2 | 下调 Down | 2.7 |
| 4.02 | 160.0297 | C3H7 N5OS | － | 0.66 | 下调 Down | 3.2 |
| 4.20 | 455.0962 | 黄素单核苷酸 Flavine mononucleotide (FMN) | 2.5 | 1.69×10-13 | 下调 Down | 3.8 |
| 9.35 | 268.0251 | N-乙酰基-L- 谷酰基-5-磷酸 N-Acetyl-L-glutamyl 5-phosphate | 8.6 | 19.2 | 下调 Down | 2.7 |
| 11.07 | 229.1332 | C14H18N2O | － | 0.15 | 下调 Down | 3.3 |
| 13.82 | 313.2411 | 9,10-二羟基-12(Z)- 十八碳烯酸 9,10-dihydroxy 12(Z)- octadecenoic acid | 1.8 | 22.4 | 下调 Down | 2.7 |
| 14.07 | 313.2205 | 7-脱氢孕烯醇酮 7-Dehydropregnenolone | 10.0 | 79.9 | 下调 Down | 2.5 |
| 16.05 | 295.2284 | 13-羟基十八碳二烯酸 13(S)-Hydroxyoctadeca- dienoic acid | 1.8 | 102 | 下调 Down | 2.4 |
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