English

• 1.   引 言

  Pb是铅锌矿区土壤中毒性最大的重金属,直接危害生长在该土壤中的植物^[1]。在微生物作用下,Pb²⁺在土壤和植物根际环境中发生吸收-解吸、获取-排泄、氧化-还原等过程^[2]。在微生物细胞表面也进行生物吸附、生物过滤、生物转化、生物螯合、生物矿化、生物累积等过程^[3]。伴随这些反应,植物根际环境中的Pb含量和存在形态发生改变,直接或间接影响Pb的生物有效性和毒性,对生长在该环境中的植物吸收Pb有着重要的影响作用^[4]。例如,解磷细菌能降低Pb有效态26%~36%^[5]; 抗性芽孢杆菌降低铅可交换态35%^[6]。相反,某种抗性菌株也可增加土壤中Pb有效态67%～93%^[7]; 接种特性菌株也能促进植物对Pb的吸收^[8]; 外生菌根真菌可增加Pb可提取态133%^[9]。由此可见,不同抗性菌株对土壤中Pb影响方式不同,需要从微观方面开展微生物对Pb的吸附转化研究。

  微生物对Pb的吸附和转化与细胞表面的胞外聚合物有关,主要吸附官能团有羧酸基、羟基、氨基有机磷酸基团等,转化过程主要与巯基及金属硫蛋白等有关^[10]。然而，由于微生物特殊的存在形态及吸附方式的差异,普通的分析测试方式对细菌吸附Pb的定量测试存在很大难度,原位微区同步辐射X射线荧光(μ-SRXRF)的发展为其定量分析提供了技术条件,在细胞等微小样品中的应用也较普遍,主要用于研究元素分布规律,而对微量元素的定量测试较少^[11]。结合同步辐射X射线吸收近边结构(XANES)还可用于研究细胞中元素的存在形态。例如：采用XANES和μ-SRXRF技术发现角膜中S在成熟深层基质中以蛋白质和硫酸盐存在^[12]。结合微分干涉显微镜(DIC)与SRXRF可研究单细胞内Cu元素在血液再生中的主要功能^[13]。采用SRXRF可研究药物处理后癌细胞中钌和碘在细胞质和细胞核内的分布^[14]。结合μ-SRXRF和微区XANES可以研究As在活细胞各个细胞器内的存在形态^[15]。在细菌累积的毒性元素研究方面,大多局限于砷等元素^[16],对Pb元素形态研究的报道极少。

  μ-SRXRF结合XANES技术可以用于研究特征细菌吸附Pb的定量分布规律及形态转化机理。本研究以云南兰坪铅锌矿区农田土壤为研究对象,结合土壤理化性质及毒性金属含量,筛选获得具有Pb耐受性的细菌。采用μ-SRXRF对特异性细菌从培养基中吸附Pb的分布规律及细菌累积Pb含量进行定量分析探索,同时用XANES测定细菌累积Pb的存在形态信息,研究特异微生物吸收和转化Pb的机理。为研究土壤中微生物对Pb的生物有效性转化规律提供参考数据。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  能量色散型X射线荧光光谱 (ED-XRF,Spectro X-Lab 2000),微区XRF(光斑直径约20 µm),FJA-6土壤pH-Eh计(南京传滴仪器设备有限公司),μ-SRXRF(北京光源4W1B),XANES(上海光源BLl4Wl和BL15U)。PbO,Pb₃O₄,PbSO₄,Pb(NO₃)₂,Pb(CH₃COO)₂·3H₂O,KNO₃,K₂HPO₄·3H₂O,MgSO₄·7H₂O,FeSO₄·7H₂O,KH₂PO₄,K₂Cr₂O₇、可溶性淀粉与葡萄糖(分析纯,国药集团化学试剂有限公司); (C₁₇H₃₅COO)₂Pb与2PbCO₃·Pb(OH)₂(CP,国药集团化学试剂有限公司); 琼脂粉与孟加拉红(BR,国药集团化学试剂有限公司); 牛肉膏与蛋白胨(BR,北京奥博星生物技术有限责任公司); 硫酸链霉素、Pb(SC₁₆H₃₃)₂与NaCl(Sigma); PbS(矿石粉碎),Pb₅(PO₄)₃Cl实验室合成,XRD验证^[17]。

  2.2.   土壤分析及微生物的分离筛选

  采用ED-XRF测定采集土壤中毒性元素含量^[18],土壤pH-Eh计原位测定土壤样品的pH值和Eh值。采用牛肉膏-蛋白胨(LB)、马丁氏、改良高氏一号培养基对土壤中细菌、真菌、放线菌进行分离培养,放线菌培养加入50 µg/mL K₂Cr₂O₇作为抗生素,采用相应的稀释梯度进行人眼计数分析。以毒性金属含量比较高的土壤制备菌悬液,涂于含Pb培养基上,定向筛选Pb耐受性的细菌,通过DNA的提取进行16 S基因测序,并以BLAST分析确定耐受菌株的种属(由北京六合华大基因科技公司完成)^[19]。

  2.3.   耐受细菌Pb微区分布

  将耐受细菌划线接种到Pb浓度为400 µg/g的LB固体培养基上,截取培养基表面和剖面方向的一段细菌生长区域,获取细菌与培养基接触的两个平面,固定后以湿样直接测定。μ-SRXRF运行电子能量为2.5 GeV,电流150~250 mA,入射X射线能量为15 keV,高性能Si(Li)固态探测器。线站毛细管聚焦光斑50 × 50 µm²,根据样品大小及样品扫描谱图信息选择X轴扫描步长分别为：B1、B2: 100 µm; B3、B3-JM、B3-JM-BK: 50 µm; Y轴步长为B1: 100 µm; B2: 300 µm; B3: 400 µm; B3-JM: 500 µm; B3-JM-BK: 200 µm,扫描Live time为B1、B2: 7 s; B3、B3-JM、B3-JM-BK: 6 s,采用PyMCA软件拟合分析和数据处理^[20]。

  2.4.   微区SRXRF分析

  向LB培养基加入琼脂之前,先加入不同量的25 mg/g Pb²⁺溶液,配制成浓度为0,200,300,400,500,600,700和800 µg/mL的Pb-LB培养基标准25 mL。再分别加入琼脂粉0.5 g,于沸水下煮沸3 h,通过观察沉淀在培养基中的分布状态,保证Pb²⁺溶液在培养基中的充分混匀。确保冷却后Pb在培养基中均匀分布,倒入培养皿中,冷却,获得标准系列样品。 采用实验室微区XRF对该标样进行随机单点30 s采谱,通过Pb峰计数值统计检查其均一性,误差在5%以内。采用μ-SRXRF进行单点采谱实验,扫描Live time为60 s,采集标准系列的XRF图谱,通过数据处理绘制标准曲线。利用本方法测定每次微区扫描实验结束后各含量分布区域及细菌菌体中Pb的含量,所有实验过程采用400 µg/mL Pb-LB培养基标准作为流程监控,确保对线站仪器的稳定性的监控。

  2.5.   细菌吸附Pb形态转化实验与XANES分析

  XANES线站储能环能量3.5 GeV,环电流120~200 mA,Si双晶单色器,在样品测试前利用Pb-L_Ⅲ吸收边(13035 eV)进行能量校准。在获得足够多种类的Pb标准化合物谱图后^[22],测定Pb耐受菌落菌体、培养基、矿区土壤样品(湿样)中Pb的形态,采用Athena软件进行数据处理,将所得样品的吸收曲线与Pb形态标样进行对比拟合分析,获得样品中Pb的形态数据结果。

  3.   结果与讨论

  3.1.   土壤概况及特异性菌株筛选

  相对于土壤环境质量标准(修订)(GB 15618-2008),采集的土壤样品中毒性金属超标严重,其中Pb含量范围为49.1~2133 µg/g,As含量范围为14.4~206 µg/g,Cd含量范围为0.8~27.3 µg/g; 原位测定Eh范围544.6~736.5 mV; pH 4.65~8.27,基本为弱酸性。对土壤中菌株计数分析结果表明,该区域土壤中主要微生物为细菌,占95%以上。

  在不同Pb浓度的培养基中筛选Pb耐受性的菌株8株,经鉴定发现主要为Arthrobacter sp.(节杆菌属),其中B1,B2,B3菌株对Pb的耐受浓度达600 µg/g以上,并在多个土壤中均发现该耐受菌株。

  3.2.   特异性细菌吸附Pb的SRXRF微区分布

  采用µ-SRXRF对细菌B1,B2,B3在含Pb 400 µg/g的培养基进行微区扫描,分别扫描在培养基上呈条带状分布的一段菌株生长区域,结果如图 1所示。培养基扫描结果中Pb含量高的区域都出现在细菌生长区域,表明细菌B1,B2,B3都具有吸附培养基中Pb的能力,并具有一定的积累效果。

  图 1

  

  图 1  3株耐受细菌吸附Pb分布图

  Figure 1.  Distribution characteristics of Pb biosorpted in lead-resistant bacteria

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  在实验中,由于SRXRF光源的高强度,对轻基体样品穿透性更强,当扫描到细菌生长区域时,X射线可能穿透比较薄的细菌菌落而进入培养基中,而培养基为非空白本底(Pb含量为400 µg/g),可能出现培养基平面扫描误差。为了进一步确定细菌本身对Pb的吸附及吸附过程的细菌-培养基吸收或转移的界面效应,对菌株B3细菌-培养基生长的剖面也进行微区扫描,结果如图 2所示。

  图 2

  

  图 2  细菌-培养基界面微区扫描示意图及扫描结果

  Figure 2.  Distribution characteristics of Pb in the interface of lead-resistant bacteria-medium

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  观察图 2中含细菌的扫描区域B3-JM,从左至右依次为空气、细菌与空气接触面、细菌菌体、细菌与培养基接触面、培养基。该扫描结果显示：Pb分布较高区域出现在细菌菌体,明显高于培养基。B3-JM-BK扫描区域从左至右Pb依次增高,最高区域出现在培养基。对比这两个区域扫描结果发现，当细菌B3接种到含Pb培养基后,其生长过程伴随对Pb的吸附,且吸附Pb含量远超过培养基本身含量。

  3.3.   特异性细菌吸附Pb的微区定量分析

  为了简单快速定量测定细菌体内吸附Pb的浓度,采用μ-SRXRF对微区测试方法进行了探索,忽略培养基和细菌基体不同的差异,制作含Pb的LB培养基标样,应用于细菌微区Pb的定量分析中^[22]。单点测试时间为60 s,图 3A为含Pb浓度800 µg/mL的LB培养基XRF谱图,图中谱峰信噪比非常高,Pb特征谱峰非常明显,表明60 s的测量时间足以适用于定量分析。

  图 3

  

  图 3  含Pb的LB培养基及细菌样品的SRXRF谱图(A)及定量分析标准曲线(B)

  Figure 3.  Synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) characteristics of Pb in lead-resistant bacteria and Lysogeny broth (LB) medium (A) and Pb standard curve of quantitative analysis (B)

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  为避免As K_α与Pb L_α的干扰,选择Pb L_β1线为分析谱线; 考虑到细菌样品及其生长培养基为轻基体,选择Pb L_β1峰与Compton峰之比校正基体效应。将标样的XRF谱图经能量校正后,对Pb的L_β1峰(12.6 keV)和Compton峰(包含Rayleigh峰)进行手动积分,以两者的比值作为纵坐标,以Pb浓度为横坐标作标准曲线,见图 3B。标准曲线方程为y=2.9201×10^-4x－0.0084,R²=0.9404,计算得检出限为10.2 µg/g,置信区间99%,在原位微区分析中,本方法可用于Pb的微区定量。在忽略细菌和培养基的基体差异的基础上,可将本方法应用于细菌体内Pb浓度的检测。测定细菌体内Pb含量,测试时间也为60 s,测量结果如表 1所示。对同株细菌不同位置的测量结果的RSD多在10%以内,表明在微区快速定量测定中,本方法基本可靠。

  表 1

  

  表 1  细菌吸附Pb含量

  Table 1.  Concentration of Pb biosorpted in lead-resistant bacteria

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  样品Samples	编号No.	Pb L峰面积Pb Lβ1Peak area(×104)	康普顿峰面积Comptonpeak area(×104)	比值Ratio	Pb含量Pb content(µg/g)	RSD(%)	测定次数Test times(n)
  空白 Blank	BK	0.061	2.83	0.0022	36.1	2.9	4
  400 µg/g 培养基标样400 µg/g Medium standard	PYG-1	2.13	18.93	0.113	415	3.5	5
  	PYG-2	2.17	19.83	0.1010	404
  	PYG-3	2.26	20.38	0.111	409
  	PYG-4	0.873	7.25	0.120	441
  	PYG-5	1.68	14.66	0.114	420
  微区扫描图红色区域单点µ-SRXRF mapping redarea point	B1	13.85	7.00	1.978	6801	3.8	6
  	B2	2.02	5.39	0.37	1311	13.6	3
  	B3	4.00	14.39	0.278	980	8.1	4
  细菌Bacteria	B1-W	4.97	2.88	1.72	5925	8.5	4
  	B2-W	1.04	2.54	0.411	1434	6.8	5
  	B3-W	0.709	1.44	0.528	1836	9.8	4

  3株细菌微区Pb高计数区显示了不同细菌吸附Pb的浓度大小,测定的浓度与微区分析后选择测试点有关。将吸附Pb后的细菌完全剥离下培养基固定再进行单点分析(表 1中B-W系列),直接反映了细菌对Pb的吸附累积能力,其中B1菌株累积的Pb含量高达5.93 mg/g。由LB培养基Pb浓度400 μg/g可以计算菌株B1,B2及B3的Pb生物富集系数分别为14.8,3.6和4.6,推测该富集系数在低含量Pb培养基上还有升高的趋势。

  3.4.   细菌吸附后Pb的形态转变

  为了测定细菌体内Pb的赋存形态,对其进行XANES分析。分别测定B2矿区土壤、细菌B2和LB培养基的Pb形态,获得相应XANES图谱。测定的含Pb的化合物标准样品包含PbS,PbO,Pb₃O₄,PbSO₄,Pb(NO₃)₂,2PbCO₃·Pb(OH)₂,Pb₅(PO₄)₃Cl,Pb(CH₃COO)₂·3H₂O,(C₁₇H₃₅COO)₂Pb,Pb(SC₁₆H₃₃)₂,Pb箔等。对各种Pb形态标准样品进行矫正和谱峰拟合,再将样品谱图与Pb标样进行拟合分析,结果如图 4所示。采用R-factor进行评估,值越小,表明拟合误差越小,效果越好,各样品的拟合结果见表 2。

  图 4

  

  图 4  细菌B2及其生长培养基和土壤样品中Pb的XANES拟合谱图

  Figure 4.  Fitting spectra of lead-resistant bacteria B2,Lysogeny broth (LB) medium and soil

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  表 2

  

  表 2  拟合的Pb形态XANES谱图

  Table 2.  Fitting results of lead-resistant bacteria B2,LB medium and soil

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  样品Samples	Pb化合物Pb-Compounds	比重Weight	评估因子R-factor
  菌株B2Bacteria strainB2	Pb5(PO4)3Cl	0.198	0.000115
  	PbS	0.580
  	(C17H35COO)2Pb	0.222
  土壤Soil	(C17H35COO)2Pb	0.859	0.000234
  	Pb5(PO4)3Cl	0.141
  LB培养基LB medium	Pb(CH3COO)2·3H2O	0.040	0.000082
  	(C17H35COO)2Pb	0.706
  	PbCO3·Pb(OH)2	0.254
  注：评估因子\begin{document} $R - factor = \Sigma {\left( {y - {y_{fit}}} \right)^2}/\Sigma {y^2}$ \end{document}，y为样品归一化后的吸收系数，yfit为标样拟合后的吸收系数。 Evaluation factors \begin{document} $R - factor = \Sigma {\left( {y - {y_{fit}}} \right)^2}/\Sigma {y^2}$ \end{document}; where,y is the absorption coefficient of the sample normalization,and yfit is the absorption coefficient after the standard sample fitting.

  由表 2中细菌、土壤和培养基的Pb形态结果可知,该铅锌矿区土壤中Pb主要以有机配体结合铅形式存在,这也是土壤中Pb的生物利用度较高的存在形态,表明该农田土壤中Pb易于迁移到植物体内。同时对土壤中Pb形态的测试可能与样品的保存方式有关,本实验的土壤样品在4℃保存,未经过烘干粉碎等过程,直接进行测定,与其它处理方式测定的Pb形态存在差异,但该处理方式保证了土壤样品的原位信息,更具有可参考性。将Pb(NO₃)₂加入LB培养基后,当Pb浓度较高时,游离态的Pb²⁺会与培养基中其它有机分子粒子产生络合作用,形成沉淀,这些沉淀主要以有机螯合态存在,其中的有机离子来源主要是牛肉膏及蛋白胨溶解后的有机配体。而对吸附后的细菌体内Pb形态的结果说明其主要以PbS形式存在,表明细菌从培养基中吸附有机螯合态Pb后,经过细菌的生理代谢作用,将其转化为硫化物形式在菌体内沉积,表明本研究筛选的Arthrobacter sp.属细菌具有转化环境中Pb的能力,其在改变Pb毒性金属生物有效性方面具有重要的影响作用。

  本研究发现，从铅锌矿区农田土壤中分离的Pb耐受性细菌Arthrobacter sp.吸附Pb的浓度高达5925 μg/g,该细菌吸附Pb后,经过生物代谢及生理作用,可以将Pb从有机结合态转变为硫化物的形式。对细菌吸附Pb后的排出机制进行研究,可以反映出细菌对其生长环境中Pb的生物有效性的作用变化机理,在矿山污染区超富集植物及其它可食用植物对铅的吸收和抑制方面有重要的参考价值。

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  Figure 1  Distribution characteristics of Pb biosorpted in lead-resistant bacteria

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  Figure 2  Distribution characteristics of Pb in the interface of lead-resistant bacteria-medium

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  Figure 3  Synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) characteristics of Pb in lead-resistant bacteria and Lysogeny broth (LB) medium (A) and Pb standard curve of quantitative analysis (B)

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  Figure 4  Fitting spectra of lead-resistant bacteria B2,Lysogeny broth (LB) medium and soil

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  Table 1.  Concentration of Pb biosorpted in lead-resistant bacteria

  样品Samples	编号No.	Pb L峰面积Pb Lβ1Peak area(×104)	康普顿峰面积Comptonpeak area(×104)	比值Ratio	Pb含量Pb content(µg/g)	RSD(%)	测定次数Test times(n)
  空白 Blank	BK	0.061	2.83	0.0022	36.1	2.9	4
  400 µg/g 培养基标样400 µg/g Medium standard	PYG-1	2.13	18.93	0.113	415	3.5	5
  	PYG-2	2.17	19.83	0.1010	404
  	PYG-3	2.26	20.38	0.111	409
  	PYG-4	0.873	7.25	0.120	441
  	PYG-5	1.68	14.66	0.114	420
  微区扫描图红色区域单点µ-SRXRF mapping redarea point	B1	13.85	7.00	1.978	6801	3.8	6
  	B2	2.02	5.39	0.37	1311	13.6	3
  	B3	4.00	14.39	0.278	980	8.1	4
  细菌Bacteria	B1-W	4.97	2.88	1.72	5925	8.5	4
  	B2-W	1.04	2.54	0.411	1434	6.8	5
  	B3-W	0.709	1.44	0.528	1836	9.8	4

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  Table 2.  Fitting results of lead-resistant bacteria B2,LB medium and soil

  样品Samples	Pb化合物Pb-Compounds	比重Weight	评估因子R-factor
  菌株B2Bacteria strainB2	Pb5(PO4)3Cl	0.198	0.000115
  	PbS	0.580
  	(C17H35COO)2Pb	0.222
  土壤Soil	(C17H35COO)2Pb	0.859	0.000234
  	Pb5(PO4)3Cl	0.141
  LB培养基LB medium	Pb(CH3COO)2·3H2O	0.040	0.000082
  	(C17H35COO)2Pb	0.706
  	PbCO3·Pb(OH)2	0.254
  注：评估因子\begin{document} $R - factor = \Sigma {\left( {y - {y_{fit}}} \right)^2}/\Sigma {y^2}$ \end{document}，y为样品归一化后的吸收系数，yfit为标样拟合后的吸收系数。 Evaluation factors \begin{document} $R - factor = \Sigma {\left( {y - {y_{fit}}} \right)^2}/\Sigma {y^2}$ \end{document}; where,y is the absorption coefficient of the sample normalization,and yfit is the absorption coefficient after the standard sample fitting.

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