English

• 1.   引 言

  流感病毒等微生物在宿主细胞中有效复制和拮抗宿主免疫反应涉及到细胞内的多种重要信号转导通路,如WNT^[1],NF-КB^[2],MAPK^[3],PI3K/Akt^[4]等,是一个非常复杂的生物学过程。在此过程中,蛋白质翻译后修饰如泛素和类泛素化修饰起到了十分重要的作用。泛素和类泛素化修饰是一类最富诱导性和可逆性的蛋白修饰^[5]。其中,干扰素刺激基因15蛋白 (Interferon stimulated gene 15 kDa protein,ISG15) 类泛素化修饰在调节病原微生物的感染和复制、宿主细胞先天免疫反应等过程中发挥着极其重要的作用^{[6, 7]}。ISG15是由干扰素诱导产生的一种分子量约为15 kDa的蛋白质,由两个泛素样的小亚基通过一个短铰链区连接组成^[8]。ISG15对蛋白质的修饰作用是可逆的共价修饰,可以调节底物蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等^[9]。研究表明,ISG15缺失的小鼠对包括流感病毒在内的许多病毒感染的易受性明显高于野生型小鼠^[10]。进一步的研究发现,ISG15修饰能够在很大程度上抑制流感病毒在人源细胞中的基因表达和复制,而在小鼠胚胎成纤维细胞中却没有观察到明显的类似的抑制作用^[11]。这说明,类泛素修饰ISG15在流感病毒感染人源细胞过程中发挥着极其重要的作用。因此,分析鉴定流感病毒感染引起人源宿主细胞中类泛素ISG15修饰蛋白的变化,对于深入理解人源宿主通过ISG15抵抗病毒感染的分子机制具有重要意义。

  现代质谱技术在蛋白质结构分析和大规模蛋白质组分析等领域得到了越来越广泛的应用。相对于其它分析技术,质谱技术具有高分辨率和高灵敏度等优势,逐渐成为多肽、蛋白质分子结构分析研究中最为重要的技术手段之一^[12~15]。而免疫沉淀技术是基于高特异性的抗体抗原反应,利用抗体将复杂混合物中的抗原分子特异性富集的一种样品制备技术。目前,将免疫分离技术与质谱分析技术相结合,已经成为对复杂生物样品进行定性、半定量、甚至定量分析的强有力手段。这种分析技术将传统免疫分析技术的高度特异性和质谱技术的高度灵敏性、高分辨率等特性相结合,可以对复杂生物样品如具有各种翻译后修饰的蛋白质进行分析鉴定^{[16, 17]}。

  目前,大规模分析泛素或类泛素修饰的研究主要集中于对泛素(Ubiquitin)和类泛素(SUMO、ISG15)修饰蛋白在各种生物学体系中的表征^[18~21]。对于流感病毒感染人源宿主细胞过程中ISG15修饰蛋白的大规模分析研究未见报导。在本研究中,采用免疫沉淀技术与液相色谱-质谱联用技术,对流感病毒感染宿主细胞过程中的ISG15修饰蛋白进行分析鉴定。首先将人流感病毒株H3N2接种到来源于人肺腺癌上皮的细胞系A549中,感染一定时间后,利用免疫沉淀技术将被类泛素ISG15修饰的蛋白富集纯化,利用液相色谱-质谱联用技术对富集蛋白进行分析,成功鉴定到了22种来源于宿主细胞的蛋白(包括类泛素ISG15蛋白)和1种流感病毒非结构蛋白。结果表明,流感病毒感染能够引起多种宿主蛋白的类泛素ISG15修饰,而免疫沉淀结合液相色谱-质谱联用技术可以非常有效地对类泛素ISG15修饰蛋白进行分析鉴定。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  LTQ Orbitrap电场轨道阱回旋共振组合质谱仪(美国Thermo公司);BIO Wide Pore C₁₈ 反相毛细管色谱柱(150 mm×0.18 mm,5 μm,美国Sigma公司);Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳及Mini Trans-Blot^ Cell电转系统(美国Bio-Rad公司);Allegra TM X-22R离心机(美国Beckman Coulter公司);Microchemi Chemiluminescence system 4.2凝胶成像仪(以色列DNR Bio-Imaging Systems公司);Varioskan Flash酶标仪(美国Thermo公司);四维旋转混合仪(海门其林贝尔公司)。

  Bradford蛋白定量试剂盒、尿素、碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺(美国Bio-Rad公司);测序级TPCK修饰的胰蛋白酶(美国Promega公司);免疫沉淀试剂盒Classic IP Kit(美国Pierce公司);甲酸、乙腈、β-巯基乙醇(美国Sigma公司);抗ISG15单克隆抗体、HRP标记的兔抗鼠二抗(美国Santa Cruz公司);DMEM培养基美国(Hyclone公司);胎牛血清(美国Gibco公司);牛血清白蛋白(BSA)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司);增强化学发光底物试剂(ECL Prime,瑞典GE Healthcare公司);其它试剂均为国产分析纯。人肺腺癌上皮的细胞系A549及人流感病毒株H3N2由本实验室保存;实验用水为经Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备的超纯水。

  2.2.   病毒接种与感染A549细胞

  用含血清的DMEM培养基将A549细胞培养至80%-90%成片状态,弃去培养基,用PBS清洗3遍。 加入含0.2%胰酶的无血清DMEM培养基继续培养2 h后,接种经适当稀释的流感病毒株H3N2。感染24 h后,弃去培养上清液,收集细胞。使用IP裂解液(pH 7.4,25 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1% NP40,5% Glycerol)裂解细胞,于4℃、12000 r/min离心20 min,取上清液,分装后置-80℃保存。使用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

  2.3.   免疫沉淀技术富集ISG15修饰蛋白

  采用Pierce公司Classic IP Kit免疫沉淀试剂盒进行蛋白的富集。首先,在细胞裂解液上清液中加入未偶联抗体的琼脂糖微球(表面包被有蛋白A/蛋白G)进行预处理,4℃旋转振摇过夜,离心,收集上清液。再按照免疫沉淀试剂盒说明书步骤,将抗ISG15单克隆抗体偶联到琼脂糖磁珠表面上。经充分清洗后,加入到经过预处理的细胞裂解液中。混匀后,4℃旋转振摇过夜,离心收集琼脂糖微球。经洗涤后,用洗脱缓冲液进行洗脱。对照组使用未经流感病毒感染的A549细胞,采用相同的方法富集内源性的ISG15修饰蛋白。将含有经免疫沉淀富集的ISG15修饰蛋白样品分装后保存于-80℃。取少量蛋白样品加入2×SDS上样缓冲液,95℃保温5 min。用12% SDS-PAGE进行分离,电泳结束后将蛋白电转移到PVDF膜上。将PVDF膜清洗、用BSA封闭后,与抗ISG15单克隆抗体在室温孵育2 h。将膜充分清洗后,再与HRP标记的兔抗鼠二抗在室温孵育2 h。将PVDF膜充分清洗后,加上新混合的ECL(增强化学发光)底物,使用凝胶成像仪记录蛋白印迹信号。

  2.4.   蛋白质样品的胰蛋白酶水解

  在2.3小节中免疫沉淀富集的蛋白质样品中加入5倍体积的预冷丙酮,-20℃放置过夜后离心,弃去上清液。将沉淀用含有50 mmol/L NH₄HCO₃的2 mol/L尿素溶液溶解,加入终浓度50 mmol/L 二硫苏糖醇溶液,室温放置60 min。再加入终浓度100 mmol/L 碘乙酰胺,避光反应60 min,将巯基烷基化。加入新配制的测序级TPCK-胰蛋白酶溶液,37℃反应过夜后,加入适量10%甲酸终止反应。离心取上清液,冻干后于-20℃保存。

  2.5.   液相色谱-质谱联用分析鉴定蛋白质

  使用液相色谱-质谱联用技术分析胰酶水解多肽样品。将多肽样品溶解在洗脱缓冲液A(99% 水+1%乙腈+0.1%甲酸)中,经BIO Wide Pore C₁₈ 反相毛细管色谱柱(150 mm×0.18 mm,5 μm)分离。梯度洗脱程序为: 0-180 min,5%-40% 缓冲液B(99% 乙腈+1% 水+0.1% 甲酸)。流速为0.25 μL/min。洗脱出的多肽直接进入LTQ Orbitrap质谱离子源进行分析。毛细管温度200℃,喷雾电压为1.5 kV,质核比检测范围为400-2000 amu。应用数据依赖方式进行二级质谱扫描,每个全扫描后进行5个二级扫描,碰撞能量为35%归一化能量,母离子窗口宽度为2 Da,持续动态排除时间为1 min。将采集到的质谱数据传输到数据处理工作站,并使用Thermo Proteome Discoverer 1.1质谱数据分析软件进行分析。蛋白质数据库检索时采用SEQUEST模式,在Uniprot蛋白质数据库进行检索。

  2.6.   生物信息学分析

  参照文献^{[22, 23]}的方法,使用PANTHER (Protein annotation through evolutionary relationship)分析软件对得到的ISG15修饰蛋白质进行分析,将所鉴定的蛋白按照不同的生物学功能进行分类。

  图 1

  

  图 1  免疫沉淀富集干扰素刺激基因15编码蛋白(ISG15)修饰蛋白的印迹分析图谱

  Figure 1.  Western plot analysis of interferon stimulated gene 15 kDa protein (ISG15)-modified proteins enriched by immunoprecipitation

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  3.   结果与讨论

  3.1.   ISG15修饰蛋白的免疫沉淀富集

  将H3N2病毒株接种于A549细胞,在不含血清的DMEM培养基中培养24 h,弃去培养液,以PBS缓冲液洗涤3次后,收集并裂解细胞。对照组为未接种病毒的A549细胞,培养条件与实验组相同。共进行6次平行实验。实验组和对照组细胞裂解液分别采用抗ISG15抗体免疫沉淀富集、SDS-PAGE电泳分离及转膜,进行蛋白印迹分析(图 1)。为了减少非特异性吸附,在免疫沉淀富集之前,向细胞裂解液中加入未偶联抗体的琼脂糖微球进行预吸附,然后离心弃去琼脂糖微球。再在上清液中加入偶联ISG15抗体的琼脂糖微球进行免疫沉淀实验。实验结果表明,未经病毒感染的A549细胞中也能检测到极微量的ISG15以及ISG15修饰蛋白;而病毒感染细胞后,显著诱导了ISG15及其修饰系统的表达,使得宿主细胞蛋白产生明显的ISG15修饰,说明ISG15修饰在宿主细胞抵抗病毒的固有免疫反应中发挥了重要作用。

  3.2.   ISG15修饰蛋白的液相色谱-质谱联用分析鉴定

  将经免疫沉淀富集的ISG15修饰蛋白进行二硫键还原、碘乙酰胺烷基化后,利用胰蛋白酶对蛋白质混合物进行特异性水解,得到酶解多肽的混合物。经液相色谱-质谱联用分析得到酶解多肽的质谱数据,再通过蛋白质数据库检索,在流感病毒感染的A549细胞中鉴定得到包括ISG15蛋白在内的23种蛋白(表 1)。其中6种蛋白在未经感染的细胞中也得到表达,说明在细胞正常的代谢过程中,一部分细胞内源性蛋白也会发生ISG15修饰。文献^[24]表明,细胞经过病毒感染等外界刺激后,会显著诱导表达ISG15。而ISG15对感染病毒的宿主细胞中的哪些蛋白进行修饰,尚未有系统的研究报道。流感病毒的非结构蛋白NS1是人源宿主细胞中类泛素ISG15修饰的一个重要靶蛋白^{[25, 26]},宿主细胞通过ISG15修饰抑制NS1的功能,从而抵抗病毒在机体内的有效复制,是病毒和宿主相互作用途径之一。在本研究中,也同样鉴定到来自流感病毒的非结构蛋白NS1。在流感病毒感染宿主细胞过程中,NS1蛋白是一个关键致病因子,它通过多种机制,包括双链RNA的结合和隔离来拮抗宿主的抗病毒反应。

  表 1

  

  表 1  液相色谱-质谱联用分析鉴定得到的ISG15修饰蛋白

  Table 1.  Summary of ISG15-modified proteins identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

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  登录号* Accession* number	蛋白名称Protein name	匹配肽段数Number of matched peptides	样品Samples	基因名称Gene name	等电点pI	分子量 MW (kDa)
  P04083	膜联蛋白 A1 Annexin A1	4	F,C	ANXA1	6.57	38.69
  P04075	果糖二磷酸醛缩酶A Fructose-bisphosphate aldolase A	7	F,C	ALDOA	8.30	39.40
  O60563	细胞周期蛋白-T1 Cyclin-T1	8	F	CCNT1	8.90	80.63
  O75964	线粒体三磷酸腺苷合成酶亚基g ATP synthase subunit g,mitochondrial	11	F,C	ATP5L	9.65	114.21
  P17987	T-复合物蛋白1亚基α T-complex protein 1 subunit α	7	F	TCP1	5.80	60.31
  P60709	肌动蛋白,细胞质1 Actin,cytoplasmic 1	5	F,C	ACTB	5.29	41.71
  Q06830	过氧化物酶-1 Peroxiredoxin-1	4	F	PRDX1	8.27	22.09
  P20700	核纤层蛋白-B1 Lamin-B1	7	F	LMNB1	5.11	66.37
  Q05682	钙调素结合蛋白 Caldesmon	9	F	CALD1	5.62	93.18
  P68366	微管蛋白α-4A 链 Tubulin α-4 A chain	5	F,C	TUBA4A	4.93	49.89
  D1MMA0	非结构蛋白1 Non-structural protein 1	3	F	NS1	5.43	26.06
  P06733	烯醇化酶1 Enolase 1	6	F,C	ENO1	7.01	47.14
  P05161	类泛素蛋白ISG15 Ubiquitin-like protein ISG15	2	F	ISG15	6.83	17.88
  P11142	热休克蛋白质71 kDa Heat shock cognate 71 kDa protein	6	F	HSPA8	5.37	70.86
  Q15459	剪接因子3A 亚基1 Splicing factor 3A subunit 1	4	F	SF3A1	5.15	88.83
  P04792	热休克蛋白β-1 Heat shock protein β-1	3	F	HSPB1	5.98	22.77
  Q9Y3Z3	脱氧核苷三磷酸水解酶SAMHD1 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1	5	F	SAMHD1	6.69	72.15
  P25788	蛋白酶体α type-3亚基 Proteasome subunit α type-3	2	F	PSMA3	5.19	27.63
  P20042	真核翻译起始因子2亚基2 Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 2	2	F	IF2B	5.60	38.36
  P54886	1-吡咯啉-5-羧酸合成酶 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase	6	F	ALDH18A1	6.66	87.25
  Q13838	剪接体的RNA解旋酶DDX39B Spliceosome RNA helicase DDX39B	3	F	DDX39B	5.44	48.96
  * 登录号为UniProt数据库的登录号(Accession number is the registered number in UniProt database)。F: 经流感病毒感染的A549细胞(A549 cells infected with influenza virus); C: 未经病毒感染的A549细胞(Non-infected A549 cells)。

  目前,采用免疫沉淀和免疫共沉淀技术将目标蛋白进行纯化,再经液相色谱-质谱联用技术进行分析鉴定的方法,已广泛应用于生命分析科学的多个领域^{[27, 28]}。然而,采用这种技术对ISG15修饰蛋白的研究还鲜有报道。目前,关于ISG15修饰蛋白的研究,多先构建带有某种标签(如Flag,HA等)的ISG15表达载体,再转染到合适的细胞中进行表达。将细胞裂解后,利用对标签具有特异性的固相支持物对ISG15修饰的蛋白进行富集^{[29, 30]}。这种方法对修饰蛋白富集的特异性较高(源自于标签的特异性)。然而由于方法本身的限制,多用于体外研究。而本研究所采用的直接对ISG15免疫富集的方法,可以更有效地分析识别内源性ISG15的修饰状态,以及减少外源表达体系对生物学过程的干扰。因此,这种方法更适合体内研究体系以及基于临床样本的研究。

  3.3.   ISG15修饰蛋白的生物信息学分析

  本研究得到的大部分ISG15修饰蛋白是经病毒感染后诱导产生ISG15修饰的,这些蛋白的修饰往往跟流感病毒与宿主细胞相互作用的分子机制密切相关。采用PANTHER软件对这些蛋白(只在流感病毒感染的细胞中检测到的ISG15修饰的宿主蛋白,共15种)进行了聚类分析,将具有相似生物学功能属性的蛋白进行归属(表 2)。结果表明,流感病毒感染引起的ISG15修饰蛋白具有较广泛的功能分布,分别归属于9个不同的蛋白分类(Protein class),包括细胞骨架、分子伴侣、酶调节剂、核酸结合、激酶、转移酶、转录因子、氧化还原酶以及结构蛋白。ISG15修饰作为一种重要的翻译后修饰,在多种信号转导途径中具有十分重要的作用。研究表明,ISG15可以通过多种方式在流感病毒和宿主相互作用中发挥生物学功能。一方面,ISG15可以通过对宿主蛋白的修饰,增强宿主对病毒的抵抗作用。另一方面,ISG15可以对病毒蛋白进行修饰,导致其不能形成特定的高级结构,从而降低其对宿主抗病毒作用的抵抗能力。

  表 2

  

  表 2  免疫沉淀富集的ISG15修饰蛋白的聚类分析

  Table 2.  Classification of ISG15-modified proteins enriched by immunoprecipitation

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  序号 No.	蛋白分类 Protein class	基因数 Gene number	基因名称 Gene name
  1	分子伴侣 Chaperone	3	TCP1,HSPA8,HSPB1
  2	氧化还原酶 Oxidoreductase	2	PRDX1,ALDH18A1
  3	酶调节剂 Enzyme modulator	1	CCNT1
  4	转移酶 Transferase1ALDH1	8	A1
  5	核酸结合 Nucleic acid binding	6	DDX39B,IF2B,SF3A1,SF3B1,STAT1,CCNT1
  6	转录因子 Transcription factor	2	STAT1,CCNT1
  7	激酶 Kinase 1ALDH1	8	A1
  8	细胞骨架 Cytoskeletal protein	2	LMNB1,CALD1
  9	结构蛋白 Structural protein	1	LMNB1

  4.   结 论

  本研究利用免疫沉淀技术将类泛素ISG15修饰的蛋白富集纯化后,利用液相色谱-质谱联用技术对流感病毒感染A549宿主细胞过程中产生的类泛素ISG15修饰蛋白进行了分析鉴定。成功鉴定出了包括ISG15在内的22种来源于宿主细胞的蛋白和1种来源于流感病毒的非结构蛋白。研究结果提示类泛素ISG15在流感病毒和宿主的相互作用中发挥重要作用。本研究为大规模分析鉴定ISG15修饰蛋白提供了一种特异、有效的研究方法。

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• 

  Figure 1  Western plot analysis of interferon stimulated gene 15 kDa protein (ISG15)-modified proteins enriched by immunoprecipitation

  泳道 1.病毒感染A549细胞,泳道 2.未经感染的A549细胞。

  Lane 1,A549 cells infected with influenza virus; lane 2,non-infected A549 cells.

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  Table 1.  Summary of ISG15-modified proteins identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

  登录号* Accession* number	蛋白名称Protein name	匹配肽段数Number of matched peptides	样品Samples	基因名称Gene name	等电点pI	分子量 MW (kDa)
  P04083	膜联蛋白 A1 Annexin A1	4	F,C	ANXA1	6.57	38.69
  P04075	果糖二磷酸醛缩酶A Fructose-bisphosphate aldolase A	7	F,C	ALDOA	8.30	39.40
  O60563	细胞周期蛋白-T1 Cyclin-T1	8	F	CCNT1	8.90	80.63
  O75964	线粒体三磷酸腺苷合成酶亚基g ATP synthase subunit g,mitochondrial	11	F,C	ATP5L	9.65	114.21
  P17987	T-复合物蛋白1亚基α T-complex protein 1 subunit α	7	F	TCP1	5.80	60.31
  P60709	肌动蛋白,细胞质1 Actin,cytoplasmic 1	5	F,C	ACTB	5.29	41.71
  Q06830	过氧化物酶-1 Peroxiredoxin-1	4	F	PRDX1	8.27	22.09
  P20700	核纤层蛋白-B1 Lamin-B1	7	F	LMNB1	5.11	66.37
  Q05682	钙调素结合蛋白 Caldesmon	9	F	CALD1	5.62	93.18
  P68366	微管蛋白α-4A 链 Tubulin α-4 A chain	5	F,C	TUBA4A	4.93	49.89
  D1MMA0	非结构蛋白1 Non-structural protein 1	3	F	NS1	5.43	26.06
  P06733	烯醇化酶1 Enolase 1	6	F,C	ENO1	7.01	47.14
  P05161	类泛素蛋白ISG15 Ubiquitin-like protein ISG15	2	F	ISG15	6.83	17.88
  P11142	热休克蛋白质71 kDa Heat shock cognate 71 kDa protein	6	F	HSPA8	5.37	70.86
  Q15459	剪接因子3A 亚基1 Splicing factor 3A subunit 1	4	F	SF3A1	5.15	88.83
  P04792	热休克蛋白β-1 Heat shock protein β-1	3	F	HSPB1	5.98	22.77
  Q9Y3Z3	脱氧核苷三磷酸水解酶SAMHD1 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1	5	F	SAMHD1	6.69	72.15
  P25788	蛋白酶体α type-3亚基 Proteasome subunit α type-3	2	F	PSMA3	5.19	27.63
  P20042	真核翻译起始因子2亚基2 Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 2	2	F	IF2B	5.60	38.36
  P54886	1-吡咯啉-5-羧酸合成酶 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase	6	F	ALDH18A1	6.66	87.25
  Q13838	剪接体的RNA解旋酶DDX39B Spliceosome RNA helicase DDX39B	3	F	DDX39B	5.44	48.96
  * 登录号为UniProt数据库的登录号(Accession number is the registered number in UniProt database)。F: 经流感病毒感染的A549细胞(A549 cells infected with influenza virus); C: 未经病毒感染的A549细胞(Non-infected A549 cells)。

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  Table 2.  Classification of ISG15-modified proteins enriched by immunoprecipitation

  序号 No.	蛋白分类 Protein class	基因数 Gene number	基因名称 Gene name
  1	分子伴侣 Chaperone	3	TCP1,HSPA8,HSPB1
  2	氧化还原酶 Oxidoreductase	2	PRDX1,ALDH18A1
  3	酶调节剂 Enzyme modulator	1	CCNT1
  4	转移酶 Transferase1ALDH1	8	A1
  5	核酸结合 Nucleic acid binding	6	DDX39B,IF2B,SF3A1,SF3B1,STAT1,CCNT1
  6	转录因子 Transcription factor	2	STAT1,CCNT1
  7	激酶 Kinase 1ALDH1	8	A1
  8	细胞骨架 Cytoskeletal protein	2	LMNB1,CALD1
  9	结构蛋白 Structural protein	1	LMNB1

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