English

• 1.   引 言

  在已报道的检测葡萄糖的方法中,电化学传感器是最常采用的方法之一^[1],可分为基于葡萄糖氧化酶的传感器和无酶传感器两类。由于酶活性易受到环境,如温度、湿度及酸碱度等因素的影响,在一定程度上限制了酶传感器的应用。而无酶葡萄糖传感器不仅不需要葡萄糖氧化酶在电极表面复杂的固定化过程,而且稳定性好、价格低廉,因此一直是该领域的研究热点^[2~5]。无酶葡萄糖传感器是基于葡萄糖在电极表面的直接电催化氧化而构建的,已报道的对葡萄糖具有电催化氧化作用的材料包括贵金属、合金材料、过渡金属及其氧化物等,其中相对廉价的过渡金属Cu、Ni及其氧化物或氢氧化物等,由于对葡萄糖检测具有较好的选择性和稳定性而得到了广泛关注^{[6, 7]}。

  多巴胺是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质,参与控制运动、认知、情感等多种生理功能,其电化学行为已被广泛研究^{[8, 9]}。近年的研究表明,多巴胺在水溶液中很容易被溶解氧所氧化,继而引发自聚-交联反应,可在几乎所有固体基质表面形成具有极强粘附性的聚多巴胺(PDA)层^{[10, 11]},聚多巴胺的邻苯二酚基团能够对很多金属离子产生较强的配位作用,且聚多巴胺对金属离子具有较强的还原能力,因此可在基质表面获得聚多巴胺/金属复合修饰层^{[12, 13]}。

  本实验利用多巴胺自聚反应的特性,首先制备聚多巴胺修饰的玻碳电极,然后利用聚多巴胺对Cu²⁺的配位作用及水合肼对Cu²⁺的强还原作用,获得聚多巴胺和铜(Cu)微粒共修饰的玻碳电极,通过层层自组装,构建了基于(PDA/Cu)_n多层膜的灵敏度可调的无酶葡萄糖电化学传感器。采用紫外-可见光谱对多层膜的形成过程进行了跟踪表征,采用循环伏安法和电流-时间曲线法详细研究了传感器对葡萄糖的电催化氧化性能。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司),采用三电极体系:以修饰的玻碳电极(GCE,Φ=3 mm)为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝电极为对电极;Hitachi S3400N扫描电子显微镜(日本日立公司);TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);PW3040/60型X射线衍射仪(荷兰PANalytical B.V公司,Cu Kα辐射源)。

  多巴胺盐酸盐(DA,Sigma-Aldrich公司);CuSO₄、葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司);所用试剂均为分析纯;实验用水为去离子水。

  2.2.   传感器的制备

  将玻碳电极依次用1.0,0.3和0.05 μm的α-Al₂O₃粉末抛光,用去离子水和乙醇交替超声清洗3次,然后用氮气吹干,备用。将处理好的裸玻碳电极浸入含有2 mmol/L多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中(10 mmol/L,pH 8.5),30 min后取出,用去离子水冲洗并用氮气吹干,即得到聚多巴胺修饰的玻碳电极(GCE/PDA)^[14]。将GCE/PDA浸入含有0.5 mol/L水合肼以及0.05 mol/L Cu²⁺-EDTA的溶液中,2 h后取出,用去离子水冲洗并用氮气吹干,即得到由聚多巴胺和铜微粒共同修饰的玻碳电极(GCE/PDA/Cu)。重复上述步骤可得到多层膜修饰电极(GCE/(PDA/Cu)_n),膜的层数可由重复次数控制。

  3.   结果与讨论

  3.1.   多层膜的表征

  采用紫外-可见光谱跟踪表征了多层膜的组装过程,图 1为在石英基底上分别组装了1,2,3,4和5个双层的(PDA/Cu)_n多层膜的紫外-可见吸收光谱。由对照实验可知,250 nm处的吸收峰源自于石英基底上沉积的金属铜。由图 1插图可知,250 nm处吸收峰的强度随组装层数的增加而线性增加,线性回归方程为A=0.01869+0.1178n,其线性相关系数为0.9992。这表明多层膜的组装是一个逐步且均匀的过程,每个双层中铜微粒的含量近似相等。

  图 1

  

  图 1  (PDA/Cu)_n多层膜的紫外-可见吸收光谱,从下至上,n=1,2,3,4和5。插图为 250 nm处吸收峰强度与多层膜层数间的关系曲线

  Figure 1.  UV-Vis absorption spectra of (polydopamine (PDA)/Cu)_n multilayer films. The number of bilayers is,from bottom to top,1,2,3,4 and 5. Inset is the relationship of absorption at 250 nm vs. the number of bilayers

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  采用扫描电镜对修饰电极的表面形貌进行了表征,图 2为在玻碳电极上组装了1个双层的PDA/Cu多层膜的电镜照片。由图 2可知,经水合肼还原Cu²⁺而获得的铜微粒均匀地分布于电极表面,且粒径较为均一,约为(5±1) μm。图 3为GCE/PDA/Cu修饰电极的X射线衍射图,位于43.3°和50.4°的两个峰分别对应于金属Cu立方晶型的(111)和(200)晶面^[15]。谱图中未出现Cu₂O和CuO相应的衍射峰,表明微粒中没有Cu的其它氧化物存在。

  图 2

  

  图 2  修饰玻碳电极GCE/PDA/Cu的扫描电镜照片

  Figure 2.  SEM image of modified glassy carbon electrode (GCE/PDA/Cu)

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  图 3

  

  图 3  修饰电极GCE/PDA/Cu的X射线衍射谱图

  Figure 3.  XRD pattern of modified electrode GCE/PDA/Cu

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  3.2.   多层膜电极对葡萄糖的电催化氧化

  图 4为裸玻碳电极和组装了不同层数的(PDA/Cu)_n多层膜电极在含有3.0 mmol/L葡萄糖的0.2 mol/L NaOH溶液中的循环伏安曲线。由图 4可见,在0-0.8 V的电位范围内,在裸玻碳电极上未出现氧化峰(曲线a),表明在此电位范围内,裸玻碳电极对葡萄糖无电催化氧化作用。而修饰电极约在0.5 V处出现了一个明显的氧化峰,表明修饰电极对葡萄糖的电化学氧化具有较强的催化能力。随组装层数的增加,电极上铜微粒数量也增加,氧化峰电流线性增大(图 4插图),这也从另一个侧面表明此多层膜的组装是一个均匀的过程。GCE/(PDA/Cu)_n修饰电极在碱性介质中催化葡萄糖氧化的可能机理推测如下^[16]:

  1

  2

  3

  4

  图 4

  

  图 4  GCE/(PDA/Cu)_n修饰电极在含有3 mmol/L葡萄糖的0.2 mol/L NaOH溶液中的循环伏安曲线,双层数n:a. 0;b. 1;c. 2;d. 3;e. 4;f. 5。插图为氧化峰电流与多层膜层数间的关系曲线

  Figure 4.  Cyclic voltammograms of GCE/(PDA/Cu)_n modified electrode in 0.2 mol/L NaOH solution containing 3 mmol/L glucose,number of bilayers: a. 0; b. 1; c. 2; d. 3; e. 4; f. 5. Inset is the relationship of oxidation peak currents vs. number of bilayers.

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  首先,Cu在NaOH溶液中被电化学氧化为CuO;CuO进一步被氧化为具有强氧化力的Cu形式,如CuOOH或Cu(OH)₄^-;最后,葡萄糖被Cu催化氧化为葡萄糖酸内酯,而葡萄糖酸内酯最终水解为葡萄糖酸。

  图 5为GCE/(PDA/Cu)₃在含有3 mmol/L葡萄糖的0.2 mol/L NaOH溶液中不同扫速下的循环伏安曲线。由图 5可见,随着扫速增大,氧化峰电流也随之增大,且与扫速的平方根成正比(图 5 插图),说明此电极反应是受扩散控制的过程。

  图 5

  

  图 5  GCE/(PDA/Cu)₃修饰电极在含有3 mmol/L葡萄糖的0.2 mol/L NaOH溶液中不同扫速下的循环伏安曲线,扫速从a到i依次为10,20,30,40,50,60,70,80和90 mV/s。插图为氧化峰电流与扫速平方根间的关系曲线

  Figure 5.  Cyclic voltammograms of GCE/(PDA/Cu)₃ modified electrode in 0.2 mol/L NaOH solution containing 3 mmol/L glucose at different scan rates. Scan rate: 10,20,30,40,50,60,70,80 and 90 mV/s,respectively. Inset is the relationship of oxidation peak currents vs. the square root of scan rates.

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  3.3.   NaOH溶液浓度的优化

  由修饰电极在碱性介质中电催化氧化葡萄糖的机理可知,底液中OH^-的浓度对葡萄糖的催化氧化具有重要影响。因此对底液中NaOH的浓度进行了优化。图 6显示了在含有3 mmol/L葡萄糖的NaOH溶液中,GCE/PDA/Cu修饰电极的氧化峰电流和峰电位随NaOH浓度的变化情况。当NaOH浓度由0.05 mol/L增加到0.35 mol/L,氧化峰电流呈现出先增大后减小的趋势,而氧化峰电位呈现出先减小后增大的趋势。当NaOH浓度为0.2 mol/L时,氧化峰电流最大,且氧化峰过电位最小,说明NaOH浓度为0.2 mol/L时,最有利于葡萄糖的电催化氧化。

  图 6

  

  图 6  NaOH溶液的浓度对GCE/PDA/Cu修饰电极的氧化峰电流和峰电位的影响,葡萄糖浓度为3 mmol/L

  Figure 6.  Effect of NaOH concentrations on peak current and peak potential of 3 mmol/L glucose for GCE/PDA/Cu modified electrode

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  3.4.   多层膜电极的分析性能

  考虑到组装层数越多,修饰电极的制备时间越长,本实验仅考察了1-4个双层的修饰电极的分析性能。图 7曲线a-d分别为1,2,3和4个双层修饰电极的氧化峰电流对葡萄糖浓度的关系曲线,不同传感器对同浓度葡萄糖的响应电流随组装层数的增加而明显增大。由关系曲线的直线部分可以求得不同组装层数的传感器的灵敏度(即单位浓度变化对应的响应电流的变化),其大小分别为42.7,60.6,80.4和111.0 mA/(mol/L)。结果表明,传感器的灵敏度随组装层数的增加而增大,灵敏度的可调控性对于传感器的潜在应用具有重要意义。

  图 7

  

  图 7  GCE/(PDA/Cu)_n修饰电极的氧化峰电流与葡萄糖浓度的关系曲线,双层数n:a. 1;b. 2;c. 3;d. 4

  Figure 7.  Relationship of oxidation peak currents vs. glucose concentrations. The number of bilayers (from a to d) is 1,2,3 and 4,respectively

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  采用电流-时间曲线法对GCE/(PDA/Cu)₄修饰电极的分析性能进行了研究。在0.35 V电压下,向0.2 mol/L NaOH溶液中连续加入葡萄糖标准溶液,检测氧化电流对葡萄糖浓度的计时响应。由图 8A可知,每次加入葡萄糖后,响应电流均会迅速发生变化,达到95%稳态响应电流的时间小于5 s。图 8B为GCE/(PDA/Cu)₄修饰电极的稳态电流对葡萄糖浓度的校正曲线,稳态电流与葡萄糖的浓度在0.5-9.0 mmol/L范围内时,呈良好的线性关系,线性回归方程为I(mA)=0.016 + 0.058C(mmol/L),线性相关系数为0.9991,检出限为5.8 μmol/L(S/N=3)。

  图 8

  

  图 8  (A)GCE/(PDA/Cu)₄对在0.2 mol/L NaOH溶液中连续加入葡萄糖的电流-时间曲线,应用电位为0.35 V;(B) 检测葡萄糖的校正曲线。

  Figure 8.  (A) Amperometric response of GCE/(PDA/Cu)₄ modified electrode for successive addition of glucose to 0.2 mol/L NaOH solution at 0.35 V. (B) Calibration curve for glucose detection.

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  将本研究中制备的GCE/(PDA/Cu)₄修饰电极的分析性能与文献中已报道的部分基于铜材料的无酶葡萄糖传感器进行了比较。由表 1可知,所制备的传感器具有较宽的线性检测范围。这是由于采用了层层自组装技术可使电极表面生长更多的铜微粒,从而为葡萄糖分子的吸附和反应提供了更大的面积和更多的电活性位点。

  表 1

  

  表 1  GCE/(PDA/Cu)₄修饰电极与其它基于铜材料的无酶葡萄糖传感器分析性能的比较

  Table 1.  Comparison of analytical performance of GCE/(PDA/Cu)₄ with other non-enzymatic glucose sensors

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  修饰电极Modified electrode	测试电位 Applied potential (V)	线性范围 Linear range (mmol/L)	检出限 Limit of detection (μmol/L)	文献 Reference
  Cu NPs/graphene electrode	0.5	0.005-1.4	0.2	[17]
  Cu-MWCNTs electrode	0.55	Up to 7.5	1.0	[18]
  Nafion-Cu-N-G/GCE	0.5	0.004-4.5	1.3	[19]
  Cu-graphene sheets electrode	0.5	Up to 4.5	0.5	[20]
  Cu nanobelt electrode	0.6	Up to 1.13	10	[21]
  GCE/(PDA/Cu)4	0.35	0.5-9.0	5.8	This work

  3.5.   多层膜电极的选择性、稳定性和重现性

  考察了在实际样品检测中可能存在的易被氧化的抗坏血酸、尿酸、L-半胱氨酸、果糖、乳糖和蔗糖对本方法检测葡萄糖的干扰情况。考虑到在实际血样中,葡萄糖的浓度至少为共存干扰物的30倍,干扰实验采用电流-时间曲线法,在0.35 V电压下,依次向0.2 mol/L NaOH溶液中加入0.5 mmol/L葡萄糖和0.1 mmol/L干扰物,记录其计时电流。结果表明,当加入上述干扰物质后,响应电流无明显改变,说明此修饰电极具有良好的选择性。

  将GCE/(PDA/Cu)₄修饰电极在4℃保存,每隔5天对3 mmol/L葡萄糖进行一次循环伏安检测,30天后其氧化峰电流约下降7.2%,表明此传感器具有良好的稳定性。这主要是由于聚多巴胺对基质具有超强的粘附性,有效防止了修饰膜的破损或脱落,且其酚羟基可与金属原子或离子间形成较强的配位键。

  对同一支玻碳电极重复5次组装GCE/(PDA/Cu)₄修饰电极,分别测试其对3 mmol/L葡萄糖的电化学响应,氧化峰电流的标准偏差仅为4.3%,说明此修饰电极具有较好的制备重现性。

  表 2

  

  表 2  血清样品中葡萄糖浓度的测定

  Table 2.  Determination results of glucose in human blood serum (n=5)

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  样品 Sample	测定值 Found(mmol/L)	相对标准偏差 Relative standard deviation(%)	医院参考值 Measured by hospital(mmol/L)
  1	5.16± 0.09	1.7	5.34
  2	4.54 ± 0.20	4.4	4.80

  3.6.   血样分析

  采用GCE/(PDA/Cu)₃修饰电极对由东北大学医院提供的两份血清样品中葡萄糖的浓度进行了检测。将100 μL血清加入到5.0 mL 0.2 mol/L NaOH溶液中,在0.35 V测试电位下,记录稳态电流。由如表 2可知,该测试结果与医院的参考值(由静脉血清葡萄糖氧化酶法测定)一致,表明此修饰电极能够用于血清中葡萄糖浓度的检测。

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• 

  Figure 1  UV-Vis absorption spectra of (polydopamine (PDA)/Cu)_n multilayer films. The number of bilayers is,from bottom to top,1,2,3,4 and 5. Inset is the relationship of absorption at 250 nm vs. the number of bilayers

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  Figure 2  SEM image of modified glassy carbon electrode (GCE/PDA/Cu)

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  Figure 3  XRD pattern of modified electrode GCE/PDA/Cu

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  Figure 4  Cyclic voltammograms of GCE/(PDA/Cu)_n modified electrode in 0.2 mol/L NaOH solution containing 3 mmol/L glucose,number of bilayers: a. 0; b. 1; c. 2; d. 3; e. 4; f. 5. Inset is the relationship of oxidation peak currents vs. number of bilayers.

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  Figure 5  Cyclic voltammograms of GCE/(PDA/Cu)₃ modified electrode in 0.2 mol/L NaOH solution containing 3 mmol/L glucose at different scan rates. Scan rate: 10,20,30,40,50,60,70,80 and 90 mV/s,respectively. Inset is the relationship of oxidation peak currents vs. the square root of scan rates.

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  Figure 6  Effect of NaOH concentrations on peak current and peak potential of 3 mmol/L glucose for GCE/PDA/Cu modified electrode

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  Figure 7  Relationship of oxidation peak currents vs. glucose concentrations. The number of bilayers (from a to d) is 1,2,3 and 4,respectively

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  Figure 8  (A) Amperometric response of GCE/(PDA/Cu)₄ modified electrode for successive addition of glucose to 0.2 mol/L NaOH solution at 0.35 V. (B) Calibration curve for glucose detection.

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  Table 1.  Comparison of analytical performance of GCE/(PDA/Cu)₄ with other non-enzymatic glucose sensors

  修饰电极Modified electrode	测试电位 Applied potential (V)	线性范围 Linear range (mmol/L)	检出限 Limit of detection (μmol/L)	文献 Reference
  Cu NPs/graphene electrode	0.5	0.005-1.4	0.2	[17]
  Cu-MWCNTs electrode	0.55	Up to 7.5	1.0	[18]
  Nafion-Cu-N-G/GCE	0.5	0.004-4.5	1.3	[19]
  Cu-graphene sheets electrode	0.5	Up to 4.5	0.5	[20]
  Cu nanobelt electrode	0.6	Up to 1.13	10	[21]
  GCE/(PDA/Cu)4	0.35	0.5-9.0	5.8	This work

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  Table 2.  Determination results of glucose in human blood serum (n=5)

  样品 Sample	测定值 Found(mmol/L)	相对标准偏差 Relative standard deviation(%)	医院参考值 Measured by hospital(mmol/L)
  1	5.16± 0.09	1.7	5.34
  2	4.54 ± 0.20	4.4	4.80

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