English

• 1.   引 言

  Pb²⁺是一种在生态系统中普遍存在的稳定、不可降解的污染物^[1],可在环境中长期积累,并对人体产生持续性影响。因此,检测水环境中的Pb²⁺浓度显得尤为重要^[2]。近年来,发展了一些检测Pb²⁺的方法,包括比色法^[3]、荧光法^[4]、原子吸收法^[5]和伏安法^[6]等。核酸适配体(Aptamer)是采用配体进化指数富集方法(SELEX),从随机寡核苷酸文库中筛选得到的一类能够与靶分子特异性结合的人工合成的寡核苷酸序列,包括RNA、ssDNA 或dsDNA^{[7, 8]}。核酸适配体具有良好的稳定性和选择性^[3],一些适配子可以特异性识别金属离子。Li等^[9]利用具有脱氧核酶(DNAzyme)活性的核酸适配体,结合氧化石墨烯,建立了比色检测Pb²⁺的方法。此外,研究者们利用Pb²⁺与发夹型富含鸟嘌呤(G)的核酸适配体结合,使其折叠形成G-四联体的强特异性配位作用,构建了多种基于G4-Pb²⁺结构的电化学传感器^{[6, 10~13]}以及荧光传感器^[14],然而这些传感器产生信号的效率低,灵敏度不高。

  门控制效应^[15] 通过利用待测物控制探针分子穿过修饰电极表面的空隙到达电极表面的数量,进而间接测定待测物浓度。门控制效应通过含量极低的待测物来控制门的闭合,从而引起高浓度探针氧化还原电流值的改变,可以提高信噪比,最终实现对检测信号的放大。

  β-环糊精(β-CD)是由7个葡萄糖单元首尾相连成环的大环类化合物,具有疏水性空腔结构。本研究将门控制效应和核酸适配体结合,制备基于G-四联体门控制效应的新型Pb²⁺适配体传感器。将巯基-β-环糊精自组装在金电极表面时,β-CD分子间形成可以使铁氰化钾探针通过的空隙^{[16, 17]},构成了对探针氧化还原电流起控制作用的"门"。利用连接在β-CD上的富G序列适配体特异性识别Pb²⁺离子并折叠生成G-四联体,覆盖β-CD分子间空隙并阻挡探针通过,形成门控制效应,使探针在电极上的氧化还原电流减小,通过测定差分脉冲伏安电流响应值实现了对Pb²⁺高灵敏的定量检测。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);手提式压力蒸汽灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公司);ZHJH-C2112B垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司);KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);GSP-77-03磁力磁力搅拌器(苏北分析仪器厂)。

  核酸适配体G-4序列(5'-TCATGGGTGGGTGGGTGGGTGA-NH₂-3',上海生工生物工程股份有限公司); 6-巯基-β-环糊精(6-SH-β-CD,山东滨州智源生物科技有限公司);对甲基苯磺酰氯(PTSC,国药集团化学试剂有限公司);吡啶(C₅H₅N,广东汕头西陇化工厂);氨基乙酸(C₂H₅NO₂,国药集团化学试剂有限公司); HCl、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、二甲基亚砜(DMSO)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、Pb(NO₃)₂等均为分析纯;所用缓冲液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.4);实验用水为超纯水。

  2.2.   核酸适配体溶液的配制

  Tris-HCl-EDTA(T-E)缓冲溶液:配制1 mol/L Tris-HCl缓冲液,取1 mL与0.2 mL的 0.5 mol/L ETDA溶液混合,用水定容至100 mL,得到T-E缓冲液(pH 7.4)。

  将T-E缓冲液、玻璃棒、移液枪头于120℃高温高压下灭菌20 min。冷却后取出,同移液枪一起置于超净工作台上,于紫外灯下辐射30 min灭菌。将装有适配体的离心管解冻,4800 r/min离心15 min。用移液枪移取适量的灭菌T-E缓冲液,小心地注入离心管,摇匀,室温下放置过夜使其完全溶解,于-20℃保存。移液枪头于烘箱中50℃烘干过夜,密封保存。

  2.3.   传感器的制备

  将金电极(直径=3 mm)分别用0.30和0.05 μm Al₂O₃粉末研磨抛光,分别置于水、乙醇、HNO₃(1:1,V/V)溶液中超声清洗,备用。

  以DMSO-H₂O (3:2,V/V)为溶剂,配制10 mmol/L 6-SH-β-CD溶液,溶将处理好的金电极浸入上述溶液中,室温自组装80 min。

  参考文献^[18~21]的方法,在50℃恒温水浴条件下将上述修饰电极浸泡于25 mmol/L PTSC的无水吡啶溶液中反应3 h,使β-CD的次面羟基得以活化并被对甲苯磺酰基(Tosyl-)取代;随后将电极取出并用水清洗后浸入到30 mmol/L 乙二胺溶液中(溶剂为CH₃CN-H₂O,1:1,V/V),50℃恒温水浴条件下反应3 h^[22],使乙二胺取代PTSC而以稳定的共价键作用结合到环糊精腔口。取出电极经清洗和干燥后,在30℃恒温水浴条件下,将修饰电极依次浸入氨基乙酸溶液和2.5% 戊二醛溶液中分别反应2.5 h,氨基乙酸的羧基端将与固载于环糊精腔口上的乙二胺剩余氨基端进行反应,而戊二醛的醛基又可以同氨基乙酸的氨基发生席夫碱反应,通过共价键作用得到固载有稳定"单臂"结构的环糊精修饰电极。最后,再向修饰电极表面滴加20 μL配制好的核酸适配体溶液,30℃条件下继续恒温固载2 h,将适配体连接在环糊精的次面端口。

  2.4.   电化学检测

  采用三电极体系:修饰金电极为工作电极,参比电极为Ag/AgCl(饱和KCl)电极,铂丝为对电极。电化学检测均在0.05 mol/L K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]溶液(含0.1 mol/L KCl)中进行。循环伏安法电位扫描范围-0.2-0.6 V,扫速100 mV/s;差分脉冲伏安法扫描范围-0.2-0.6 V,脉冲振幅0.05 V,脉冲周期0.2 s,脉冲宽度0.05 s。检测时,将电极置于不同浓度的Pb²⁺溶液中反应15 min后取出,以水洗去表面吸附的Pb²⁺溶液,转移至K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]溶液中进行电化学测量。实验原理图如图 1所示。

  图 1

  

  图 1  基于G-四联体门控制效应的Pb²⁺适配体传感器实验原理图

  Figure 1.  Scheme of Pb²⁺ assay based on G-quadruplex and gate-controlled signal amplification

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  3.   结果与讨论

  3.1.   自组装条件的优化

  分别将处理好的电极浸泡在6-SH-β-CD的DMSO溶液中,在不同温度和时间下进行自组装,测定电极在K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]溶液(含0.1 mol/L KCl)中的差分脉冲伏安(DPV)响应电流(图 2)。随着自组装的进行,β-CD在金电极表面形成了一层自组装膜,并随着时间的延长逐渐变得致密,电极表面裸露的面积减少,电流逐渐降低。自组装80 min以上,电流响应值基本保持不变。分别在17℃和30℃(n=5)下进行自组装,得到的修饰电极电流响应值基本重合,说明自组装过程基本不受温度影响。故本研究选择在室温下自组装80 min。

  图 2

  

  图 2  金电极上SH-β-CD自组装时温度和时间的影响。差分脉冲伏安法扫描范围:-0.2-0.6 V;脉冲振幅:0.05 V;脉冲宽度: 0.05 s

  Figure 2.  Effect of temperature and time on self-assembly of 6-thio-β-cyclodextrin (SH-β-CD) on gold electrode. Differential pulse voltammetry (DPV) scanning range,-0.2-0.6 V,pulse amplitude,0.05 V; pulse width,0.05 s

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  3.2.   传感器与Pb²⁺反应时间的优化

  将制备好的传感器置于1×10^-13 mol/L Pb²⁺溶液中,每隔2 min检测电极上的适配体与Pb²⁺反应后的DPV响应电流。结果表明,随着反应时间延长,DPV响应电流不断减小,这是由于随着Pb²⁺与适配体G-4链反应生成的G-四联体逐渐增多,覆盖住电活性探针分子转移的通道,阻挡探针分子通过,因而引起电流值不断减小。反应进行15 min后,电流基本不变,表明Pb²⁺与适配体G-4的反应达到平衡状态。故选择适配体与Pb²⁺的反应时间为15 min。

  3.3.   传感器与Pb²⁺反应的循环伏安表征

  在 0.05 mol/L K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆溶液(含0.1 mol/L KCl)中,以100 mV/s扫描速度对不同的修饰电极进行循环伏安表征(图 3)。金电极表面修饰了β-CD和核酸适配体后,使得电子传递受阻,因此氧化还原峰电流减小(曲线a→b),表明修饰电极制备成功。使用所制备的传感器分别测定5×10^-12 mol/L(曲线c)和8×10^-12 mol/L(曲线d)的Pb²⁺溶液,峰电流值随Pb²⁺浓度的增加而减小,这是由于Pb²⁺浓度越大,形成的G-四联体更多。上述实验结果表明,传感器对不同浓度Pb²⁺的响应电流不同,可用于Pb²⁺的定量检测。

  图 3

  

  图 3  传感器的循环伏安表征

  Figure 3.  Cyclic voltammetry characterization of the sensor

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  3.4.   工作曲线

  分别配制浓度为0,1.0×10^-13,1.2×10^-13,2.0×10^-13,3.7×10^-13,5.4×10^-13,8.3×10^-13,1.25×10^-12,2.0×10^-12,5.0×10^-12,8.0×10^-12和5.0×10^-11 mol/L的Pb²⁺溶液,以0.05 mol/L K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]溶液(含0.1 mol/L KCl)为底液,在优化的实验条件下,采用差分脉冲伏安法(DPV)测定不同浓度Pb²⁺对应的电流响应值,结果如图 4所示。在1×10^-13- 5×10^-11 mol/L浓度范围内,Pb²⁺浓度的负对数值与DPV峰电流响应值呈良好的线性关系,线性回归方程为i_p(mA)=0.122lgC(mol/L)+1.081,线性相关系数R=0.9951。检出限为3.6×10^-14 mol/L(DL=3δ_b/K)。

  图 4

  

  图 4  传感器对不同浓度Pb²⁺的差分脉冲伏安响应

  Figure 4.  DPV responses of the sensor toward different concentrations of Pb²⁺

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  3.5.   干扰实验

  考察了常见的的重金属离子对传感器的干扰。在1×10^-11 mol/L Pb²⁺溶液中,分别加入干扰离子,测量传感器对Pb²⁺的响应。结果表明,700倍以上的Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ge⁴⁺; 300倍Co²⁺、Cu²⁺; 200倍Bi³⁺、Zn²⁺、Ni²⁺; 100倍Cd²⁺、Hg²⁺; 50倍Ag⁺对传感器测定Pb²⁺无干扰,K⁺,Na⁺对实验也均无干扰。由于Ag⁺的存在会破坏G-四联体,因此浓度过高会影响实验结果。

  3.6.   重现性及稳定性

  在2×10^-13 mol/L Pb²⁺溶液中,采用同一支传感器连续测定5次DPV信号,相对标准偏差为0.6%;考察了5支传感器的DPV响应信号,其相对标准偏差为1.1%,表明传感器具有良好的重现性。

  将制备好的传感器在2×10^-13 mol/L Pb²⁺溶液中反应后定期检测DPV信号响应,3天后其DPV信号强度无明显变化,检测的相对标准偏差RSD值为1.4%。7天后DPV信号响应值降低3.3%,30天后DPV信号强度降低12.4%,表明传感器具有良好的稳定性。

  3.7.   水样分析

  分别取自来水、漓江水样品,采用慢速滤纸过滤除去泥沙、悬浮颗粒等杂质。测试时,每次吸取5 mL经处理后的样品,采用本方法测定DPV响应电流,计算Pb²⁺的浓度,结果如表 1所示,加标回收率为97.5%-103.3%。

  表 1

  

  表 1  实际水样中Pb²⁺的测定及加标回收实验结果 (n=5)

  Table 1.  Determination results of Pb²⁺ in real water samples (n=5)

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  样品 Samples	测定值 Found (mol/L)	相对标准偏差 RSD (%)	加标值 Added (mol/L)	总测定值 Total found (mol/L)	回收率 Recovery (%)
  自来水 Tap water	3.7×10-13	2.8	3.0×10-13	6.8×10-13	103.3
  			4.0×10-13	7.6×10-13	97.5
  漓江水 The Lijiang River	4.8×10-12	3.8	4.0×10-12	8.9×10-12	102.5
  			5.0×10-12	9.7×10-12	98.0
  标准对照水样 Reference standard of water*	2.0×10-11	2.0	-	-	-
  * 对照物质为铅标准溶液(GSB 04-1742-2004)逐级稀释至2.0×10-11 mol/L。 * Reference material of water (GSB 04-1742-2004) was diluted stepwise to 2.0×10-11 mol/L before determination.

  实验结果表明,将富G序列核酸适配体与门控制效应结合,利用门控制效应显著提升信噪比,实现了检测信号的放大,并提高了检测灵敏度,通过G-四联体构型的转变实现了对Pb²⁺的高灵敏检测。

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• 

  Figure 1  Scheme of Pb²⁺ assay based on G-quadruplex and gate-controlled signal amplification

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  Figure 2  Effect of temperature and time on self-assembly of 6-thio-β-cyclodextrin (SH-β-CD) on gold electrode. Differential pulse voltammetry (DPV) scanning range,-0.2-0.6 V,pulse amplitude,0.05 V; pulse width,0.05 s

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  Figure 3  Cyclic voltammetry characterization of the sensor

  a. 裸金电极; b. 环糊精/适配体修饰电极; c. 修饰电极与5×10^-12 mol/L Pb²⁺反应; d. 修饰电极与8×10^-12 mol/L Pb²⁺反应。

  a. Bare gold electrode; b. Cyclodextrin (CD)/aptamer modified electrode; c. CD/aptamer modified electrode after incubating with 5×10^-12 mol/L Pb²⁺; d. CD/aptamer modified electrode after incubating with 8×10^-12 mol/L Pb²⁺.

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  Figure 4  DPV responses of the sensor toward different concentrations of Pb²⁺

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  Table 1.  Determination results of Pb²⁺ in real water samples (n=5)

  样品 Samples	测定值 Found (mol/L)	相对标准偏差 RSD (%)	加标值 Added (mol/L)	总测定值 Total found (mol/L)	回收率 Recovery (%)
  自来水 Tap water	3.7×10-13	2.8	3.0×10-13	6.8×10-13	103.3
  			4.0×10-13	7.6×10-13	97.5
  漓江水 The Lijiang River	4.8×10-12	3.8	4.0×10-12	8.9×10-12	102.5
  			5.0×10-12	9.7×10-12	98.0
  标准对照水样 Reference standard of water*	2.0×10-11	2.0	-	-	-
  * 对照物质为铅标准溶液(GSB 04-1742-2004)逐级稀释至2.0×10-11 mol/L。 * Reference material of water (GSB 04-1742-2004) was diluted stepwise to 2.0×10-11 mol/L before determination.

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