English

• 0.   引言

  光疗，包括光动力治疗^[1-3](PDT)和光热治疗^[4-6](PTT)，因其非侵入性、时空可控性及较低的全身毒性，已成为肿瘤精准治疗的重要方向。然而，单一光疗模式受限于光在组织中的穿透深度，且其疗效依赖于外部光源的持续照射，光照停止则治疗中断，难以实现长效抑制，易导致肿瘤复发^[7-9]。为克服这些局限，多模式联合治疗策略备受关注^[10-12]。化学动力学治疗^[13-15](CDT)利用肿瘤微环境中过表达的过氧化氢(H₂O₂)，通过类芬顿反应原位生成高毒性的羟基自由基(·OH)，为克服光穿透深度限制、实现内源性激活的持续治疗提供了新思路。但常温下类芬顿反应效率较低，限制了其单药疗效^[16-18]。将PTT的局部升温、PDT的氧化损伤与CDT的化学杀伤相结合，构建“PTT-PDT-CDT”一体化纳米平台，有望实现高效治疗：PTT的热效应可显著加速类芬顿反应动力学；PDT与CDT产生的活性氧(ROS)可叠加作用于肿瘤细胞，增强氧化损伤；CDT不依赖外源光激发，可在光照停止后持续发挥作用，延长材料对肿瘤细胞的损伤作用时长^[19-21]。3种治疗模式可从不同途径诱导肿瘤细胞损伤，提升治疗效能。

  然而，现有的大多数联合治疗策略在纳米平台的构建与激发模式上仍面临显著挑战，限制了其临床转化潜力。在纳米结构设计方面，为实现多功能集成，研究者通常需要将光敏剂(PSs)、光热剂、类芬顿催化剂等不同功能组分，通过物理包裹、化学键合或逐层组装等复杂工艺整合到单一载体中^[22-23]。例如，有研究者构建了集金铂双金属纳米酶、介孔硅及PSs吲哚菁绿(ICG)于一体的Au₂Pt@PMO@ICG纳米复合材料用于联合治疗^[24]，但其合成步骤繁琐、结构复杂。另一项工作通过制备Cu-ICG-CpG-FA复合纳米颗粒来整合功能，同样涉及多步合成与表面修饰^[25]。这类复杂的纳米构筑可能带来制备重现性差、批次稳定性低以及体内代谢行为不确定等问题。在激发模式上，许多体系依赖多波长激光的序贯或同时照射，操作繁琐。例如，Chen等^[26]开发的Ce6@CuS-Pt/PEG纳米平台需先后使用1 064和630 nm激光分别激活PTT和PDT。一些基于上转换纳米颗粒的体系需由980 nm激光激发发光，再借助其发射的可见光激活PDT，同时还可能需要另加一个近红外(NIR)光源以实现PTT。目前已有相关研究报道了单波长NIR激光激发的多模式诊疗体系，但在结构简化、多功能整合以及制备便捷性等方面仍具有进一步优化空间^[27]。因此，尽管PTT-PDT-CDT联合治疗已被证实具有潜力，但在单一纳米制剂中，仅凭单波长NIR激光照射即可同步、高效触发三者联合治疗的体系仍鲜有报道^[28-30]。因此，设计、合成具有结构简洁、稳定，并能实现PTT、PDT和CDT联合作用的肿瘤治疗策略的纳米平台，是多功能纳米药物面临的关键挑战与重要目标。

  近年来，基于铜离子与花菁染料(Cy)配位组装的纳米体系在肿瘤联合治疗中展现出独特优势。Li等通过Cy与Cu²⁺的配位驱动自组装，构建了HA@ Cy-Cu纳米粒子(NPs)，实现了PTT与CDT的协同，其光热转换效率达42.3%^[31]。然而，该体系仅整合了PTT和CDT两种模式，未充分利用Cy的光动力特性。类似地，Xu等开发CuI-ICG NPs，利用X射线激发ICG产生光动力效应，同时借助铜离子诱导铜死亡，但该策略依赖X射线源，无法像NIR激光那样实现便携化应用^[32]。在808 nm单光源触发多模式治疗方面，An等设计的肿瘤微环境激活的花菁光敏剂Cu-Icy-H₂S，可在H₂S触发下原位生成CuS NPs，同时实现PTT和PDT^[33]。铜硫化物基纳米平台(如CuS-ICG@PDA-FA)则通过空心介孔CuS负载ICG，整合了PTT/PDT/CDT三种治疗模式^[34]。这些研究为本工作提供了重要参考，但也存在以下局限：多数体系需多步合成或引入外源载体，制备工艺复杂(表S1，Supporting information)。近红外吲哚类花菁染料IR808分子两端带有羧基官能团(图S1)^[35-36]，可与Cu²⁺发生配位结合，同时IR808具有NIR光响应特性，可在适当条件下产生光诱导ROS^[37-38]，也能通过非辐射跃迁将光能转化为热能以实现PTT^[39-41]。基于上述特性，我们通过Cu²⁺与IR808羧基的配位作用，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)作为稳定剂(抑制纳米颗粒团聚，提升材料在水相缓冲液中的胶体分散稳定性)，通过一步超声法构建了多功能的PVP-K30修饰的Cu-IR808配位自组装NPs。随后，对Cu-IR808 NPs的形貌、元素组成、光学吸收、光热性能、ROS的产生展开研究，并通过体外细胞实验评价材料的生物相容性与多模式抗肿瘤效果，为结构简易的多模式抗肿瘤纳米材料的开发提供基础研究依据。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  二水合氯化铜(CuCl₂·2H₂O)、PVP-K30、亚甲蓝(MB)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、钙黄绿素-乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)、碘化丙啶(PI)均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；IR808购自国药集团化学试剂有限公司；乙醇(CH₃CH₂OH)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

  所用仪器包括85-2型恒温加热磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)、HJ-6(A)型数显多头恒温磁力搅拌器(常州润华电器有限公司)、KSL-1500X-S型高温马弗炉(合肥科晶材料技术有限公司)、TG16-WS型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、PX225DHZ型电子分析天平(奥豪斯仪器公司)、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)、JSM-7500F型扫描电子显微镜(SEM，日本电子)、AXIS Supra型X射线光电子能谱仪(日本岛津)、Fourier Transform型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，美国PE)、Shimadzu UV-2600型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)、NANOTRAC WAVE Ⅱ型纳米粒度及ζ电位分析仪(美国Microtrac公司)、HM-TPK20-3AQF/W型手持测温热像仪(杭州微影软件有限公司)和808-A型半导体激光器(上海熙隆光电科技有限公司)。

  1.2   实验过程

  1.2.1   Cu-IR808 NPs的合成

  采用超声辅助自组装法制备Cu-IR808 NPs。具体步骤：首先，分别配制2种前驱体溶液。将20 mg CuCl₂·2H₂O与10 mg PVP-K30溶于25 mL甲醇和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶剂(二者的体积比为80∶20)中，超声溶解，记为溶液A。将5 mg IR808溶于20 mL甲醇和三乙胺混合溶剂(二者的体积比50∶1)中，超声分散，记为溶液B。随后，在持续搅拌下将溶液A缓慢滴加至溶液B，所得混合液继续超声处理8 h。反应结束后，将混合液于8 000 r·min^-1离心10 min收集沉淀，并依次用乙醇和去离子水各洗涤3次，以去除游离的IR808分子和PVP-K30分子(图S2)，最终获得Cu-IR808 NPs。

  1.2.2   光动力效应测试

  以1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧(¹O₂)捕获剂，通过监测其在415 nm处吸光度(A₄₁₅)的下降来评估¹O₂的生成。具体步骤如下：首先配制2 mg·mL^-1 DPBF的DMF溶液与40 μg·mL^-1 Cu-IR808的DMF溶液。取20 μL DPBF溶液加入3 mL Cu-IR808溶液中，混匀。在808 nm NIR光照射下，每间隔1 min鼓入空气30 s以维持溶氧，分别于照射0、1、2、3、4、5 min时测定A₄₁₅值，记为“Cu-IR808+DPBF+NIR”组。同时设置“DPBF+NIR”与“Cu-IR808+NIR”作为对照组，在相同条件下监测A₄₁₅随时间的变化。

  1.2.3   光热效应测试

  为系统评估Cu-IR808 NPs的光热性能，开展了以下系列实验：(1) 浓度依赖性测试：将Cu-IR808 NPs配制成0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg·mL^-1的水分散液。在808 nm激光照射下，功率密度为1.0 W·cm^-2，采用红外热成像仪实时监测并记录各样品温度随时间的变化。(2) 功率依赖性测试：固定Cu-IR808水分散液质量浓度为0.3 mg·mL^-1，在808 nm激光照射下，依次考察0.3、0.5、0.8、1.0、1.3 W·cm^-2下的光热升温行为，并利用红外热成像技术记录温度变化。(3) 光热稳定性测试：为评价材料的光热循环稳定性，对0.3 mg·mL^-1的Cu-IR808水分散液进行4次“激光开-关”循环实验(808 nm，1.0 W·cm^-2，每次照射10 min，随后自然冷却)，全程使用红外热成像仪记录温度变化曲线。

  1.2.4   ·OH检测

  通过MB的催化降解实验评估·OH的生成动力学。首先，将Cu-IR808 NPs水分散液与MB水溶液混合(90 mL)，使NPs的终质量浓度为0.3 mg·mL^-1，MB的终质量浓度为0.005 mg·mL^-1。混合体系在避光条件下搅拌30 min，以达到吸附-脱附平衡，排除物理吸附对后续降解的干扰。随后，将体系均分为3组进行反应：(1) 对照组：Cu-IR808+MB，于25.0 ℃条件下反应；(2) 常温类芬顿组：Cu-IR808+MB+H₂O₂(400 μmol·L^-1)，于25.0 ℃条件下反应；(3) 光热模拟组：Cu-IR808+MB+H₂O₂(400 μmol·L^-1)，于45.0 ℃反应以模拟光热升温条件。分别于反应0、15、30、45、60 min时取样，利用紫外可见分光光度法测定MB在660 nm处的特征吸光度，以分析·OH的生成效率与反应动力学。

  1.2.5   细胞毒性实验

  使用CCK-8法评估在无光条件下Cu-IR808 NPs对正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16-F10)的细胞毒性。首先以每孔1×10⁴个的密度将HUVEC或B16-F10细胞接种于96孔板中。待贴壁培养后，加入包含不同质量浓度Cu-IR808(0~200 μg·mL^-1)的细胞培养基共同培养24 h。培养完成后去除多余培养基，用PBS洗涤3次，再向96孔板中加入100 μL的CCK-8溶液，共培养1 h。最后，利用全波长酶标仪测定各个孔在450 nm的吸光度值。

  1.2.6   溶血实验

  首先，取新鲜抗凝处理的小鼠血液2 mL，用PBS稀释至约10倍体积，在4.0 ℃、2 000 r·min^-1条件下离心10 min，再用PBS洗涤至上清液澄清，收集沉淀即得红细胞；随后用PBS稀释并配制成2.0%的红细胞悬液。另用PBS溶液分别配制质量浓度为25.0、50.0、100.0、200.0 μg·mL^-1的Cu-IR808分散液。最后，将不同质量浓度的Cu-IR808分散液与2.0%小鼠红细胞悬液在37 ℃水浴锅中共同培养1 h，作为实验组；以去离子水与2.0%红细胞悬液共培养作为阳性对照组；PBS与2.0%红细胞悬液共培养作为阴性对照组。培养结束后，每组取10 μL滴于玻片上，于显微镜下观察并拍照；同时将剩余溶液在4.0 ℃下以2 000 r·min^-1离心10 min，拍摄光学照片后，测定上清液在540 nm处的吸光度，计算溶血率。溶血率(η_Hem)计算公式为η_Hem=(A_sample-A_negative)/(A_positive-A_negative)×100%，其中A_sample、A_negative和A_positive分别代表实验组、阴性对照组和阳性对照组的吸光度值。本实验严格遵循《三峡大学实验动物伦理规范》，经三峡大学实验动物伦理委员会审批(批准号：2026010G)，并严格遵循《实验动物管理条例》及《实验动物饲养与使用指南》的相关规定。

  1.2.7   细胞CDT效果评价

  将B16-F10细胞以每孔1×10⁴个的密度接种于96孔板，培养12 h至贴壁后，分为2组进行处理：一组加入含不同质量浓度Cu-IR808 NPs(0~200 μg·mL^-1)的细胞培养基；另一组加入含有相同质量浓度的NPs及H₂O₂(100 μmol·L^-1)的培养基。继续培养12 h后，弃去培养基，使用PBS轻柔洗涤细胞，最后通过CCK-8法测定各组的细胞存活率，以评价CDT对细胞增殖的抑制效果。

  1.2.8   细胞PTT/PDT效果评价

  首先将Cu-IR808分散液(200 μg·mL^-1)与B16-F10细胞共孵育12 h后，采用NIR激光(808 nm，1.0 W·cm^-2)照射不同时间，并用CCK-8法检测不同治疗组细胞的存活率或用Calcein-AM/PI对细胞进行共染色、荧光拍照。

  1.2.9   体外细胞联合治疗评价

  将B16-F10细胞以每孔1×10⁴个的密度接种于96孔板，培养12 h至细胞贴壁后，弃去原有培养基，将细胞随机分为以下6组进行处理：(1) 对照组；(2) Cu-IR808组(200 μg·mL^-1)；(3) 仅NIR激光组(808 nm，1.0 W·cm^-2，照射10 min)；(4) Cu-IR808+H₂O₂组(100 μmol·L^-1)；(5) Cu-IR808+NIR激光组；(6) Cu-IR808+H₂O₂+NIR激光组。治疗结束后，各组细胞采用Calcein-AM(标记活细胞，绿色荧光)和PI(标记死细胞，红色荧光)共同培养20 min，弃去染色液后以PBS轻柔洗涤，随后使用荧光显微镜拍摄图像，以定性评估细胞存活与死亡情况。

  1.2.10   单克隆实验

  将B16-F10细胞(每孔约100个细胞)均匀接种于6孔板中，每个实验组设置3个重复孔。对照组加入细胞培养基，实验组加入Cu-IR808分散液(50 μg·mL^-1)，分为Cu-IR808和Cu-IR808+NIR两组，其中Cu-IR808+NIR组给予1.0 W·cm^-2 NIR激光照射5 min，随后，将细胞置于37 ℃，5% CO₂氛围培养10 d。平板克隆完成后，加入4.0%多聚甲醛于室温下固定20 min，随后用0.1%结晶紫溶液染色30 min，以使克隆清晰可见。染色结束后，倒置显微镜下观察并记录各孔中形成的克隆数量。最后，向各孔加入0.1%乙酸溶液，利用全波长酶标仪测定各孔在570 nm的吸光度值。

  1.2.11   划痕实验

  将B16-F10细胞接种于6孔板中，接种密度为每孔2.5×10⁵个。待细胞生长至融合率约为80.0%~90.0%时，用200 μL无菌枪头尖端在细胞层表面垂直划出一条直线痕迹，用PBS清洗去除脱落细胞，确保划痕清晰。实验组更换为含Cu-IR808分散液(50 μg·mL^-1)的培养基，同时设置阴性对照组。分别在处理0、24和36 h后，将6孔板置于显微镜下观察划痕变化并拍照。

  1.2.12   统计学分析

  所有定量实验数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示。采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析：2组间比较采用独立样本t检验(双尾)，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001表示差异具有统计学显著性，ns代表无统计学差异。

  2.   结果与讨论

  2.1   Cu-IR808 NPs的表征

  采用超声辅助自组装法制备了Cu-IR808 NPs，并利用多种表征技术对其形貌、化学组成与光学性质进行了系统分析。SEM图像显示，所得NPs呈类球形，尺寸约为150.0 nm(图 1a)。X射线光电子能谱(XPS)证实样品中含有C、O和Cu元素(图 1b、S3~S5)，其中高分辨Cu2p谱图在934.4和954.3 eV处分别出现Cu2p_3/2和Cu2p_1/2的特征峰，942.9和962.5 eV附近的结合能归属于Cu²⁺卫星峰(图 1c)，表明Cu以+2价态存在。FTIR分析进一步揭示了配位结构：与游离IR808分子相比，Cu-IR808中归属于羧基的1 722 cm^-1特征峰显著减弱，同时在1 655 cm^-1附近出现新的羰基振动峰(图 1d)，证实Cu²⁺与IR808中的羧基发生了配位。水动力学粒径测试表明，Cu-IR808在PBS中的平均水合粒径约为245.4 nm，分散性良好(图 1e)。ζ电位分析显示，游离的IR808分子表面带负电，电位为-15.7 mV；而当其与Cu²⁺发生配位作用后，所得Cu-IR808的表面电荷发生反转，ζ电位变为19.9 mV(图S6)。同时，将Cu-IR808 NPs溶解在王水溶液中，通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定Cu²⁺的含量约为17.4%(Cu占Cu-IR808的质量分数)。UV-Vis-NIR吸收光谱显示，Cu-IR808保留了IR808在NIR区的主要吸收特征，同时其吸收峰相对于游离IR808发生了轻微红移(图 1f)，说明NPs保留了IR808的光捕获能力，且提示Cu²⁺配位及组装改变了IR808的局部电子环境和分子间相互作用^[42-43]，与文献报道的金属-有机纳米粒子体系行为一致。以上结果表明，Cu²⁺通过与IR808中羧酸基团的配位作用，成功驱动了Cu-IR808 NPs的自组装形成。

  图 1

  

  图 1.  Cu-IR808的(a) SEM图像、(c) 高分辨Cu2p XPS谱图和(e) 水动力学粒径; Cu-IR808和IR808的(b) XPS全谱图、(d) FTIR谱图和(f) UV-Vis-NIR吸收谱图

  Figure 1.  (a) SEM image, (c) high-resolution Cu2p XPS spectrum, and (e) hydrodynamic size of Cu-IR808; (b) XPS survey spectra, (d) FTIR spectra, and (f) UV-Vis-NIR absorption spectra of Cu-IR808 and IR808

  Inset in panel a : high-magnification SEM image.

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  2.2   光热转换性能

  基于Cu-IR808在NIR区的显著吸收(图 1f)，系统评估了其光热转换性能。首先测试了不同质量浓度(0~0.4 mg·mL^-1)的Cu-IR808分散液在808 nm激光照射下的升温行为。如图 2a所示，纯水对照组温升微弱，温度变化(ΔT)为3.8 ℃，而Cu-IR808表现出明显的浓度依赖性升温，在0.4 mg·mL^-1的质量浓度下，300 s内温度从室温升至57.3 ℃(ΔT=29.3 ℃)。图S7进一步证实了升温幅度与材料质量浓度呈正相关。随后，固定Cu-IR808质量浓度为0.3 mg·mL^-1，考察了激光功率对其温度变化的影响。如图 2b所示，在不同功率密度下，体系均呈现先快速升温后进入平衡的趋势，且最终温升随功率增大而显著提高，从0.3 W·cm^-2时的ΔT=5.7 ℃增至1.3 W·cm^-2时的ΔT=31.6 ℃(图S8)，说明其光热效应具有明确的功率依赖性。热成像图直观展示了Cu-IR808与纯水在相同激光照射下的升温对比(图S9)。如图所示，相同激光照射条件下，Cu-IR808温度随照射时间迅速升高，照射5 min内即由初始温度升至约50 ℃，而纯水对照组在相同条件下的温升幅度则明显较小，该结果与温度-时间曲线所呈现的趋势一致。进一步通过4次激光“开-关”循环实验评估其稳定性(图S10)，结果显示Cu-IR808升温性能稳定，未出现明显的光漂白或热降解，表现出优于商业化ICG的循环稳定性。同时，激光照射前后Cu-IR808溶液颜色无明显变化，仍保持绿色(图S11)。UV-Vis NIR吸收光谱也显示，照射前后吸收峰强度无明显下降(图S12)，以上结果共同证实Cu-IR808具有优异的光稳定性。最后，根据升温-冷却曲线拟合(图 2c、2d)，计算得到Cu-IR808的光热转换效率为29.9%，比文献报道的游离IR808(24.3%)略高^[44]，表明其具有良好的NIR光热转换能力。Cu²⁺作为顺磁性金属离子，与IR808配位后可能改变其激发态弛豫过程，并增加非辐射能量耗散，从而有利于光能向热能的转化^[45]。综上所述，Cu-IR808具备浓度与功率双重依赖的光热响应、优异的光热稳定性及较高的转换效率，为其作为高效光热治疗剂奠定了坚实基础。

  图 2

  

  图 2.  (a) 不同浓度Cu-IR808和纯水在808 nm激光照射下的升温曲线; (b) Cu-IR808在不同激光功率密度下的温度变化; (c) Cu-IR808与纯水激光开-关循环下的温度响应曲线; (d) Cu-IR808通过冷却阶段数据拟合得到的时间-温度线性关系(θ为归一化过余温度)

  Figure 2.  (a) Temperature rise curves of Cu-IR808 with different concentrations and water under 808 nm laser irradiation; (b) Temperature variation of Cu-IR808 under different laser power densities; (c) Temperature response curves under laser on-off cycles of Cu-IR808 and water; (d) Time-temperature linear relationship obtained by fitting the cooling stage data of Cu-IR808 (θ is defined as the normalized excess temperature)

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  2.3   光动力与化学动力学性能

  为评估Cu-IR808的光动力性能，以DPBF为指示剂，对其光动力生成ROS能力进行了测试(图 3a)^[9]。在808 nm激光照射(1.0 W·cm^-2)下，Cu-IR808与DPBF混合体系中DPBF在415 nm处的特征吸收峰强度随光照时间延长持续下降(图 3b)，5 min内吸光度从1.19降至0.70，对应DPBF降解率约为41.2%，表明该材料在NIR光激发下能够产生ROS，提示其具有PDT应用潜力。另一方面，Cu基纳米材料可通过类芬顿反应催化H₂O₂产生·OH，且升温可显著加速反应进程。为此，进一步采用MB降解实验，考察Cu-IR808在模拟光热升温条件下的类芬顿催化性能^[14]。首先将Cu-IR808(0.3 mg·mL^-1)与MB(0.005 mg·mL^-1)混合溶液避光搅拌30 min以达到吸附-脱附平衡，随后加入定量H₂O₂(400 μmol·L^-1)研究不同条件下的降解行为。结果如图 3c和图S13所示，未添加H₂O₂的对照组中MB吸光度基本不变，说明Cu-IR808自身不产生·OH；加入H₂O₂后，25.0 ℃反应60 min内MB吸光度从1.22降至0.88，表明材料在常温下即具备类芬顿催化活性；而在模拟光热升温条件(水浴45.0 ℃)下，MB吸光度在相同时间内从1.22迅速降至0.42，降解速率显著加快。45.0 ℃条件下MB降解效率达65.6%，显著高于常温条件下的27.9%(提升约1.4倍，图 3d)。上述结果表明，Cu-IR808兼具NIR光激发的光动力生成ROS能力与类芬顿催化产生ROS性能，且其类芬顿性能可通过光热升温进一步增强，从而为联合实施PTT、PDT与CDT提供了实验依据。

  图 3

  

  图 3.  (a) Cu-IR808在NIR照射下产生ROS的示意图; (b) 在Cu-IR808存在下，DPBF特征吸收峰随照射时间的变化; (c) 25 ℃下MB与Cu-IR808和H₂O₂作用的时间依赖吸收光谱图; (d) 不同条件下MB降解的比较

  Figure 3.  (a) Schematic diagram of ROS generation by Cu-IR808 under NIR irradiation; (b) Changes in the characteristic absorption peak of DPBF with irradiation time in the presence of Cu-IR808; (c) Time-dependent absorption spectra of MB with Cu-IR808 and H₂O₂ at 25 ℃; (d) Comparison of MB degradation under different conditions

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  2.4   体外细胞实验

  首先采用CCK-8法检测了Cu-IR808 NPs对不同细胞系的生物相容性。结果显示，将HUVEC和B16-F10与不同质量浓度(0~200.00 μg·mL^-1)的Cu-IR808共培养24 h后，2种细胞的活力均保持在85.0%以上(图 4a、4b)，表明Cu-IR808具有优良的细胞相容性。随后，通过体外溶血实验评价其血液相容性。将不同质量浓度Cu-IR808的PBS分散液与2.0%小鼠红细胞悬液于37.0 ℃共培养1 h，并以去离子水(DI-H₂O，阳性对照)和PBS(阴性对照)平行处理。结果显示，即使Cu-IR808的质量浓度高达200 μg·mL^-1时，溶血率也仅为0.7%(图 4c、4d)，远低于5.0%的生物材料安全阈值^[46]。进一步在显微镜下观察红细胞形态(图 4e)，除阳性对照组外，各实验组红细胞形态均与阴性对照组一致，未出现明显溶血或膜损伤。以上结果共同表明，Cu-IR808 NPs具有良好的细胞相容性与血液相容性。

  图 4

  

  图 4.  不同质量浓度Cu-IR808与(a) HUVEC和(b) B16-F10分别培养24 h后细胞的存活率; 不同质量浓度Cu-IR808组和对照组的(c) 溶血率、(d) 离心上清液的照片和(e) 细胞形态

  Figure 4.  Cell viabilities of (a) HUVEC and (b) B16-F10 cells after 24 h of incubation with different mass concentrations of Cu-IR808, respectively; (c) Hemolysis rates, (d) photographs of the centrifuged supernatant, and (e) cell morphologies of different Cu-IR808 mass concentration groups and control groups

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  为验证Cu-IR808 NPs的化学动力学疗效，以B16-F10细胞为模型，首先检测了不同处理条件下细胞内的ROS水平。实验分组包括对照组、H₂O₂组(100 μmol·L^-1)、Cu-IR808组(200.00 μg·mL^-1)以及Cu-IR808+H₂O₂联合处理组，采用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针检测细胞内总ROS的生成。ROS荧光结果表明，前3组均未出现明显绿色荧光，而Cu-IR808与H₂O₂共处理组则显示出显著绿色荧光(图 5a)，表明Cu-IR808具备介导CDT的潜力^[47]。为进一步定量评价其化学动力学效应，通过CCK-8法分析了不同条件下B16-F10细胞的存活率。结果如图 5b所示，在仅含有Cu-IR808(0~200.00 μg·mL^-1)的培养液中处理24 h后，细胞存活率均高于85.0%；而在同时存在Cu-IR808与H₂O₂(100 μmol·L^-1)的情况下，细胞存活率随Cu-IR808浓度的升高而明显下降，在200.00 μg·mL^-1时降至64.3%。以上结果表明，Cu-IR808可通过类芬顿反应产生ROS从而实现对肿瘤细胞的杀伤，展现出良好的CDT前景。

  图 5

  

  图 5.  (a) 不同处理后B16-F10细胞内ROS水平的DCFH-DA荧光染色图像; (b) 有无H₂O₂的条件下, B16-F10细胞与不同质量浓度Cu-IR808培养后的细胞存活率(n=4)

  Figure 5.  (a) DCFH-DA fluorescence staining images of intracellular ROS levels in B16-F10 cells after different treatments; (b) Cell viability of B16-F10 cells after incubation with different mass concentrations of Cu-IR808 in the presence or absence of H₂O₂ (n=4)

  Data are expressed as mean±SD from n=4 independent experiments. Statistical comparisons between two groups were analyzed using Student′s two-tailed t-test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

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  为验证Cu-IR808 NPs在NIR光照射下的光动力学产生ROS效果，检测了不同处理条件下细胞内的ROS水平。ROS荧光结果表明，前3组均未出现明显绿色荧光，而Cu-IR808与NIR共处理组则显示出绿色荧光(图S14)，表明Cu-IR808具备介导PDT的潜力。为系统评估Cu-IR808 NPs的联合光疗抗肿瘤效果，首先进行了细胞划痕实验(图 6a)。实验分为对照组、Cu-IR808组及Cu-IR808+NIR组。结果如图 6a所示，培养24 h后，对照组与Cu-IR808组的细胞迁移明显，至36 h划痕已基本闭合；而Cu-IR808+NIR组的细胞划痕闭合速度明显减慢。进一步通过细胞克隆形成实验评价了Cu-IR808+NIR光对肿瘤细胞长期增殖的影响(图 6b)。结果显示对照组与Cu-IR808组细胞增殖旺盛，形成大量密集克隆；相比之下，Cu-IR808+NIR处理组的克隆数目显著减少，且克隆形态松散，说明该策略可有效抑制肿瘤细胞增殖。为定量评估Cu-IR808 NPs的联合光疗效果，采用CCK-8法检测了不同条件下B16-F10细胞的存活率。如图 6c所示，在不加NIR光照射时，即使Cu-IR808的质量浓度高达200.00 μg·mL^-1，细胞存活率仍保持在85.0%以上；而在Cu-IR808+NIR联合处理下，细胞存活率随Cu-IR808质量浓度升高而显著下降，在200.00 μg·mL^-1时仅为47.6%，表明在NIR照射下Cu-IR808具有良好的肿瘤细胞杀伤潜力。

  图 6

  

  图 6.  B16-F10细胞经不同处理后的(a) 细胞迁移能力、(b) 细胞增殖、(c) 在有无808 nm激光照射的条件下的细胞存活率和(d) 活/死细胞染色后的荧光图像

  Figure 6.  (a) Cell migration ability, (b) cell proliferation, (c) cell viability with or without 808 nm laser irradiation, and (d) fluorescence images of stained live/dead cells of B16-F10 cells after different treatments

  Data are expressed as mean ±SD from n=4 independent experiments. Statistical comparisons between two groups were analyzed using Student′s two-tailed t-test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

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  接下来，我们通过CCK-8法评估了Cu-IR808 NPs(200.00 μg·mL^-1)的体外多模式联合治疗效果(图S15)。实验设置6组：对照组、Cu-IR808组、NIR组、Cu-IR808+H₂O₂组、Cu-IR808+NIR组、Cu-IR808+H₂O₂+NIR组。结果显示前3组细胞存活率均维持在较高水平(> 95.0%)，表明单纯的Cu-IR808 NPs或NIR激光对细胞无明显毒性。第4组细胞存活率降至67.8%，显示出CDT的单独疗效；Cu-IR808+NIR激光组存活率进一步降至44.6%，表明在此条件下PTT+PDT具有强大的杀伤力。而联合激光与H₂O₂的处理组(Cu-IR808+H₂O₂+NIR)细胞存活率最低，仅为14.3%，显著优于CDT或联合光疗效果，说明联合CDT与光疗具有更优异的治疗效果。为直观反映细胞存活状态，我们进一步采用Calcein-AM和PI对6组细胞进行活死染色(图 6d)。荧光图像显示，对照组、Cu-IR808组及NIR组均以绿色荧光(活细胞)为主；Cu-IR808+H₂O₂组可见部分红色荧光(死细胞)，提示CDT可诱导一定细胞死亡；Cu-IR808+NIR组红色荧光显著增强，绿色荧光减弱，说明光疗能有效杀伤肿瘤细胞；而Cu-IR808+H₂O₂+NIR组视野中几乎全为红色荧光，表明联合治疗具有最佳的肿瘤杀伤效果。综上所述，Cu-IR808 NPs在NIR光照下展现出良好的抗增殖及直接杀伤能力，具有优异的联合治疗应用前景。

  3.   结论

  采用一步超声辅助配位自组装方法制备PVP-K30修饰的Cu-IR808配位NPs，实现了PTT、PDT和CDT的联合抗肿瘤作用。该体系具有以下突出特点：(1) 制备工艺简单，提高了合成效率与重现性；(2) 具备强NIR吸收与优异的光热稳定性，为高效、可控的PDT/PTT提供了坚实基础；(3) 核心Cu²⁺不仅自身发挥CDT作用，更能在光热激活下加速·OH的生成；(4) 系统的体外细胞及溶血实验证实其具有良好的生物相容性。本研究为“一体化”型多功能纳米药物的开发提供了新思路，也为构建结构简易的多模式抗肿瘤纳米材料提供了基础研究依据。

  
  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn
  
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  图 1  Cu-IR808的(a) SEM图像、(c) 高分辨Cu2p XPS谱图和(e) 水动力学粒径; Cu-IR808和IR808的(b) XPS全谱图、(d) FTIR谱图和(f) UV-Vis-NIR吸收谱图

  Figure 1  (a) SEM image, (c) high-resolution Cu2p XPS spectrum, and (e) hydrodynamic size of Cu-IR808; (b) XPS survey spectra, (d) FTIR spectra, and (f) UV-Vis-NIR absorption spectra of Cu-IR808 and IR808

  Inset in panel a : high-magnification SEM image.

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  图 2  (a) 不同浓度Cu-IR808和纯水在808 nm激光照射下的升温曲线; (b) Cu-IR808在不同激光功率密度下的温度变化; (c) Cu-IR808与纯水激光开-关循环下的温度响应曲线; (d) Cu-IR808通过冷却阶段数据拟合得到的时间-温度线性关系(θ为归一化过余温度)

  Figure 2  (a) Temperature rise curves of Cu-IR808 with different concentrations and water under 808 nm laser irradiation; (b) Temperature variation of Cu-IR808 under different laser power densities; (c) Temperature response curves under laser on-off cycles of Cu-IR808 and water; (d) Time-temperature linear relationship obtained by fitting the cooling stage data of Cu-IR808 (θ is defined as the normalized excess temperature)

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  图 3  (a) Cu-IR808在NIR照射下产生ROS的示意图; (b) 在Cu-IR808存在下，DPBF特征吸收峰随照射时间的变化; (c) 25 ℃下MB与Cu-IR808和H₂O₂作用的时间依赖吸收光谱图; (d) 不同条件下MB降解的比较

  Figure 3  (a) Schematic diagram of ROS generation by Cu-IR808 under NIR irradiation; (b) Changes in the characteristic absorption peak of DPBF with irradiation time in the presence of Cu-IR808; (c) Time-dependent absorption spectra of MB with Cu-IR808 and H₂O₂ at 25 ℃; (d) Comparison of MB degradation under different conditions

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  图 4  不同质量浓度Cu-IR808与(a) HUVEC和(b) B16-F10分别培养24 h后细胞的存活率; 不同质量浓度Cu-IR808组和对照组的(c) 溶血率、(d) 离心上清液的照片和(e) 细胞形态

  Figure 4  Cell viabilities of (a) HUVEC and (b) B16-F10 cells after 24 h of incubation with different mass concentrations of Cu-IR808, respectively; (c) Hemolysis rates, (d) photographs of the centrifuged supernatant, and (e) cell morphologies of different Cu-IR808 mass concentration groups and control groups

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  图 5  (a) 不同处理后B16-F10细胞内ROS水平的DCFH-DA荧光染色图像; (b) 有无H₂O₂的条件下, B16-F10细胞与不同质量浓度Cu-IR808培养后的细胞存活率(n=4)

  Figure 5  (a) DCFH-DA fluorescence staining images of intracellular ROS levels in B16-F10 cells after different treatments; (b) Cell viability of B16-F10 cells after incubation with different mass concentrations of Cu-IR808 in the presence or absence of H₂O₂ (n=4)

  Data are expressed as mean±SD from n=4 independent experiments. Statistical comparisons between two groups were analyzed using Student′s two-tailed t-test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

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  图 6  B16-F10细胞经不同处理后的(a) 细胞迁移能力、(b) 细胞增殖、(c) 在有无808 nm激光照射的条件下的细胞存活率和(d) 活/死细胞染色后的荧光图像

  Figure 6  (a) Cell migration ability, (b) cell proliferation, (c) cell viability with or without 808 nm laser irradiation, and (d) fluorescence images of stained live/dead cells of B16-F10 cells after different treatments

  Data are expressed as mean ±SD from n=4 independent experiments. Statistical comparisons between two groups were analyzed using Student′s two-tailed t-test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

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