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• 乳腺癌作为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，其高度异质性与易转移特性严重威胁着女性的生命健康与生活质量^[1-3]。尽管早期诊断与综合治疗手段日益精进，传统疗法(如手术、化疗及放疗)仍受限于创伤大、系统性毒副作用显著及易复发等临床瓶颈^[4]。此外，肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)的复杂性，特别是乏氧与高浓度谷胱甘肽(GSH)的协同作用，不仅驱动了肿瘤的侵袭与转移，还通过清除活性氧(ROS)诱导肿瘤细胞产生耐药性，从而极大削弱了基于ROS机制的治疗手段[如光动力治疗、声动力治疗(sonodynamic therapy，SDT)]的疗效^[5-7]。因此，开发一种集成精准成像引导、主动靶向递送及智能微环境调控功能的诊疗一体化平台，已成为乳腺癌研究领域的迫切需求^[8-9]。

  SDT利用超声作为激发源，凭借其组织穿透深度深、无创性及可聚焦激活等优势，在肿瘤精准治疗领域展现出巨大潜力^[10-13]。声敏剂是SDT过程的关键^[14-16]，在SDT过程中，声敏剂响应超声刺激产生大量ROS，通过氧化损伤破坏细胞膜、DNA等生物大分子，诱导肿瘤细胞凋亡^[17-18]。然而，传统声敏剂普遍存在水溶性差、体内半衰期短、肿瘤靶向蓄积能力差及乏氧微环境适应性不足等缺陷，难以满足临床精准治疗的需求^[19-20]。此外，TME的乏氧状态导致ROS生成效率低，加之高浓度GSH对ROS的快速清除作用，导致SDT疗效不佳^[21]。因此，开发一种兼具高稳定性、主动靶向性、优异生物相容性，且能有效逆转乏氧并耗竭GSH的新型纳米声敏剂，对于突破SDT的疗效瓶颈具有重要的临床意义与应用前景。

  金属有机框架(metal-organic frameworks，MOFs)因其高比表面积、可调的孔隙结构以及金属节点/有机配体的多样性，已成为构建纳米诊疗平台的理想载体^{[22, 24]}。在众多MOFs中，以锰(Mn)为中心的卟啉基MOF(Mn-MOF)备受关注：该材料不仅保留了卟啉配体优异的声敏/光敏特性，而且顺磁性的锰离子还可作为高效的T₁加权磁共振成像(MRI)造影剂；更重要的是，锰离子可通过类芬顿反应消耗内源性过氧化氢(H₂O₂)产生O₂，从而缓解肿瘤乏氧并耗竭GSH^[25-28]。然而，裸露的Mn-MOF在生理环境中易聚集，且缺乏主动靶向能力。为提高Mn-MOF的生物相容性和靶向性，表面功能化修饰是一种有效的策略。透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种天然的生物相容性高分子，能够特异性识别并结合乳腺癌细胞表面过表达的CD44受体^[29-30]。利用HA对MOF进行表面修饰，不仅可以提高纳米粒子的胶体稳定性并延长其血液循环时间，还能赋予其主动靶向肿瘤的能力，从而实现药物在肿瘤部位的富集。

  基于此，我们成功构建了一种HA修饰的Mn-MOF多功能纳米诊疗探针(HA-Mn-MOF)。该探针通过HA-CD44介导的内吞作用实现对4T1乳腺癌细胞的特异性摄取，并利用卟啉的荧光特性与锰离子的顺磁性，实现了荧光成像与T₁加权MRI的双模态精准定位。在超声触发下，HA-Mn-MOF不仅能高效产生ROS直接杀伤肿瘤细胞，还能利用其类酶活性改善乏氧微环境并消耗GSH，从而瓦解肿瘤的抗氧化防御系统。我们系统评估了HA-Mn-MOF的理化性质、成像性能、ROS生成能力及体外抗肿瘤效果，旨在为乳腺癌的高效、精准诊疗提供一种集成像引导与微环境调控于一体的新策略。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  内消旋-四(4-羧基苯基)卟啉(H₂TCPP)购自Innochem公司；三醋酸锰二水合物、HA(M_w=10 kDa)均购自上海麦克林生化科技有限公司；2，2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(AIPH)购自Sigma-Aldrich公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、冰醋酸(HAc)均购自国药集团化学试剂有限公司。

  实验中所用仪器包括超声辐照仪(Chattanooga，美国DJO公司)、LS55荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司)、Sigma 3-30KS高速离心机(德国Sigma公司)、Tecnai G2 F30透射电子显微镜(TEM，工作电压为200 kV，美国FEI公司)、Nano ZS90 zeta电位仪(英国马尔文仪器有限公司)、UH4150紫外可见(UV-Vis)分光光度计[日立科学仪器(北京)有限公司]、Optima 5300DV电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，美国PerkinElmer公司)、GE Discovery 3.0T磁共振成像设备(美国GE公司)、电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)、荧光倒置显微镜(DMI3000B，上海Leica公司)、Incubator 311二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)。

  1.2   HA-Mn-MOF的制备

  参照文献中的方法制备Mn-MOF^[31]并加以改进。将10 mL新鲜配制的Mn(OAc)₃的DMF溶液(10.4 mmol·L^-1)加入到25 mL的HAc/DMF(V/V，1∶4)混合溶液中。搅拌5 min后，缓慢滴加10 mL H₂TCPP的DMF溶液(1.3 mmol·L^-1)。混合溶液颜色逐渐由棕黄色变为深紫色，最后转变为浅紫色。室温下反应12 h后，离心(11 000 r·min^-1，15 min)收集紫色沉淀，并用DMF洗涤数次，得到Mn-MOF。

  随后进行HA表面修饰：将上述制得的Mn-MOF(5 mg)分散于去离子水(5 mL)中，加入HA (5 mg)，超声处理30 min。最后，离心后弃上清液，得到HA-Mn-MOF固体沉淀。

  1.3   类芬顿反应活性评估

  采用亚甲蓝(MB)降解法评估HA-Mn-MOF在模拟TME下的羟基自由基(·OH)的生成能力。实验分为反应条件对比和时间依赖性降解实验两部分。在反应条件对比实验中，共设置4组平行体系，反应体系总体积为1 mL，将以下组分混合后，用去离子水定容至1 mL。各体系中均含MB水溶液(20 μL，1 mg·mL^-1)；其他组分包括HA-Mn-MOF(100 μL，1 mg·mL^-1)、H₂O₂(100 μL，10 mmol·L^-1)和GSH(50 μL，5 mmol·L^-1)。具体分组及添加物如下：Control组(H₂O₂+GSH)、HA-Mn-MOF+GSH组、HA-Mn-MOF+H₂O₂组和HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH组。各组在37 ℃条件下培养60 min后，使用UV-Vis分光光度计测定体系在550~750 nm范围内的吸收光谱，同时拍照记录溶液颜色变化。

  在时间依赖性实验中，将上述HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH组在37 ℃条件下培养。分别在反应0、5、10、15、30和60 min时取样，通过UV-Vis分光光度计测定溶液在663 nm处的吸光度。根据吸光度随时间衰减的动力学特征，评价HA-Mn-MOF的·OH生成效率及类芬顿催化活性，同时拍照记录溶液颜色变化。将上述Control组作为对照组，培养60 min，用以评估MB的背景稳定性。

  1.4   GSH消耗能力验证

  利用5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)显色反应检测GSH残留量，以评估HA-Mn-MOF对GSH的消耗能力。在微量离心管中加入2 μL GSH(0.1 mol·L^-1)与2 mL HA-Mn-MOF(37.5 mg·L^-1)，于37 ℃分别培养不同时间(0、15、30、45、60 min)。同时设置GSH对照组(2 μL GSH+2 mL去离子水)，于37 ℃分别培养0和60 min。培养结束后，向各管中加入50 μL DTNB溶液(溶于DMSO，3 mg·mL^-1)，振荡混匀后于室温避光培养5 min。通过UV-Vis分光光度计测定溶液在425 nm处的吸光度，评估材料对GSH的消耗效率。

  1.5   声动力性能评价

  以单线态氧探针(SOSG)为指示剂，评估材料的ROS生成能力。首先，将1 mg SOSG溶于1 mL DMSO中，配制成质量浓度为1 mg·mL^-1的储备液；取适量储备液，用DMSO稀释至50 μg·mL^-1，作为工作液备用。随后，分别配制H₂TCPP和HA-Mn-MOF的DMSO分散液(1 mg·mL^-1)。在石英比色皿中，加入1 mL样品分散液和20 μL SOSG工作液(终浓度约为1 μg·mL^-1)，混匀后，置于超声辐照条件下(功率密度为1.5 W·cm^-2，占空比为50%)处理，并在不同时间点(0、10、20、30、60、120、180 s)取样。取样后立即测定其在500~600 nm波长范围内的UV-Vis吸收光谱，通过监测525 nm处吸光度的动态变化来评价ROS生成效率。所有数据均采用Origin软件进行统计分析与作图。

  1.6   类过氧化氢酶活性检测

  采用溶解氧测定仪评价材料的类过氧化氢酶活性。将HA-Mn-MOF分散于磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)中，配制成1 mg·mL^-1的分散液。取2.0 mL该分散液置于溶解氧测定仪测量杯中，加入20 μL 100 mmol·mL^-1 H₂O₂溶液(终浓度约为1 mmol·mL^-1)，迅速混匀。实验组在超声条件下(功率密度为1.5 W·cm^-2，占空比为50%)处理，并实时记录不同时间点(0、60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 s)溶解氧浓度的变化。以等体积纯PBS为空白对照。根据溶解氧生成速率计算类酶活性，所有实验均重复3次，结果取平均值。

  1.7   MRI性能表征

  采用ICP-MS测定锰元素含量。为评估HA-Mn-MOF在不同微环境下的弛豫性能，配制一系列浓度梯度的HA-Mn-MOF水溶液(Mn浓度分别为0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mmol·L^-1)，分别分散于PBS(pH=7.4)、PBS(pH=5.0)、PBS+5 mmol·L^-1 GSH(pH=7.4)和PBS+5 mmol·L^-1 GSH(pH=5.0)四种体系中，利用3.0 T MRI系统进行T₁加权成像(T₁ WI)。扫描参数：重复时间(t_R)为425 ms，回波时间(t_E)为Min Full，反转时间(t_I)为200~800 ms，矩阵为384×224，视野为18 cm×18 cm，层厚为3.0 mm，层间距为1.5 mm。原始图像经GE AW 4.6工作站处理，计算T₁弛豫率(r₁)。

  1.8   细胞摄取

  取对数生长期的4T1细胞和NIH-3T3细胞，分别接种于共聚焦专用培养皿中。细胞贴壁过夜后，加入含HA-Mn-MOF(50 μg·mL^-1)的完全培养基，分别培养0、0.5、1、2、4 h，以纯培养基培养的细胞为对照组。培养结束后，吸去培养基，用预冷PBS洗涤3次，以去除游离纳米颗粒。加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤后，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液进行核染色。最后使用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察并采集荧光图像。

  1.9   细胞毒性检测

  将4T1及NIH-3T3细胞接种于96孔板(每孔100 μL)，边缘孔加入PBS以防止蒸发。细胞贴壁过夜后，吸弃旧培养基，分别加入含不同质量浓度(0、20、40、60、80、100 μg·mL^-1)的Mn-MOF或HA-Mn-MOF完全培养基，同时设置不含细胞仅加培养基的空白对照组，每组设5个复孔。继续培养24 h后，吸弃培养基，PBS洗涤3次，每组分为超声(US)处理组(功率密度为1.5 W·cm^-2，占空比为50%，辐照时间为4 min)和非超声组。处理完成后向每孔加入100 μL含3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓盐(MTS)试剂的不完全培养基(按试剂盒说明书比例配制)，培养30 min。使用酶标仪测定490 nm处的吸光度，计算细胞相对存活率。

  1.10   细胞内ROS水平测定

  将4T1细胞(每孔1×10⁶个)接种于含载玻片的3.5 cm培养皿中。培养24 h后，换用含50 μg·mL^-1纳米颗粒(Mn-MOF、HA-Mn-MOF)的无血清培养基，继续培养4 h。每组分为超声处理组(功率密度为1.5 W·cm^-2，占空比为50%，辐照时间为4 min)和非超声组。随后加入2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针(终质量浓度为1 μg·mL^-1)，培养30 min。用预冷PBS洗涤3次，以去除游离探针，最后使用倒置荧光显微镜观察并采集荧光图像。

  1.11   体外杀伤效率评价

  采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)/碘化丙啶(PI)活死细胞染色试剂盒进行染色，将4T1细胞(每孔1×10⁶个)接种于6孔板中，培养至80%~90%汇合度。实验共设置6组：Control组、Control+US组、Mn-MOF组、Mn-MOF+US组、HA-Mn-MOF组、HA-Mn-MOF+US组。各组加入含50 μg·mL^-1相应纳米材料的培养基，培养4 h后，PBS洗涤3次。超声组使用治疗探头辐照4 min(功率密度为1.5 W·cm^-2，占空比为50%)。随后加入含Calcein-AM和PI的染色工作液(1%)，避光培养30 min。PBS洗涤后，使用倒置荧光显微镜观察细胞死活染色情况(Calcein-AM染活细胞呈绿色，PI染死细胞呈红色)。

  1.12   体外MRI

  将4T1细胞(每孔1×10⁸个)接种于10 cm培养皿中，过夜培养至细胞铺满皿底。弃去培养基，PBS洗涤后，加入含不同质量浓度(20、40、60、80、100 μg·mL^-1)HA-Mn-MOF的培养基，培养4 h。消化并收集细胞，离心后用PBS洗涤3次，以去除未被摄入的纳米颗粒。将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，转移至EP管。采用3.0 T Discovery 750W MRI扫描仪进行冠状位T₁加权成像。扫描参数：t_E=13.40 ms，t_R=425 ms，t_I=28 ms，视野为24 cm×24 cm，矩阵为384×224，层厚为3 mm，层间距为1.5 mm。分析T₁弛豫时间的变化。

  2.   结果与讨论

  2.1   HA-Mn-MOF的表征

  采用TEM和DLS(动态光散射)对Mn-MOF及HA-Mn-MOF的形貌与粒径进行系统表征。如图 1a、1b所示，二者均呈现出均匀的长梭形形貌，具有良好的尺寸均一性及单分散性。进一步地，通过TEM考察了HA-Mn-MOF的胶体稳定性。如图 1c所示，该纳米探针在室温下放置7 d后仍保持完整的长梭形形貌，未见明显聚集或破碎，表明其具有良好的稳定性。DLS结果显示，Mn-MOF与HA-Mn-MOF的水合粒径分别为(425.4±2.1) nm和(487.6±2.1) nm(图 1d、1e)。经HA修饰后，纳米颗粒的表面电位发生显著变化：Mn-MOF的ζ电位为-25.2 mV，而HA-Mn-MOF的ζ电位降低至-30.9 mV(图 1f)。这一结果证实了HA的成功包覆，并显著增强了颗粒表面的负电性。同样，傅里叶变换红外(FTIR)光谱结果也证明其成功包覆(Supporting information)。UV-Vis吸收光谱(图 1g)表明，HA-Mn-MOF在350~650 nm范围内呈现多个特征吸收峰，其Soret带位于427 nm，相较于游离配体H₂TCPP(420 nm)红移了7 nm，提示在MOF形成过程中卟啉配体的电子环境发生了改变。此外，HA-Mn-MOF在427 nm激发下表现出显著的近红外荧光发射(发射峰位于650和710 nm)，且荧光强度与浓度呈正相关(图 1h)，这为后续利用荧光成像技术追踪纳米颗粒在细胞及体内的分布奠定了基础。同时，荧光强度(660 nm)在7 d内的变化亦可忽略不计(图 1i)，进一步佐证了该探针的结构稳定性。

  图 1

  

  图 1.  新鲜制备的(a) Mn-MOF和(b) HA-Mn-MOF的TEM图像; (c) HA-Mn-MOF放置7 d后的TEM图像; (d) Mn-MOF和(e) HA-Mn-MOF的DLS粒径分布图; (f) Mn-MOF和HA-Mn-MOF的ζ电位; (g) HA-Mn-MOF和H₂TCPP的UV-Vis吸收光谱图; (h) 不同质量浓度HA-Mn-MOF的荧光光谱图; (i) HA-Mn-MOF水溶液放置7 d过程中荧光强度(660 nm)随时间的变化

  Figure 1.  TEM images of as-prepared (a) Mn-MOF and (b) HA-Mn-MOF; (c) TEM image of HA-Mn-MOF after 7 d storage; DLS diameter distributions of (d) Mn-MOF and (e) HA-Mn-MOF; (f) ζ potentials of Mn-MOF and HA-Mn-MOF; (g) UV-Vis absorption spectra of HA-Mn-MOF and H₂TCPP; (h) Fluorescence spectra of HA-Mn-MOF at different concentrations; (i) Time-dependent fluorescence intensity changes of HA-Mn-MOF aqueous solutions (660 nm) over 7 d

  Inset: photographs taken under UV light (365 nm) at corresponding time points.

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  2.2   HA-Mn-MOF的类芬顿反应与类酶催化性能

  2.2.1   类芬顿反应活性评估

  通过MB降解实验，评估HA-Mn-MOF的类芬顿催化活性及其在TME关键组分(GSH、H₂O₂)调控下的催化行为。如图 2a所示，在550~750 nm的扫描范围内，Control组与HA-Mn-MOF+GSH组在663 nm处的吸光度未见明显下降，证实了MB在该条件下具有良好的稳定性且不发生自发降解。HA-Mn-MOF+H₂O₂组的吸光度显著低于二者，表明H₂O₂是触发类芬顿反应生成·OH的必要底物。值得注意的是，HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH组的吸光度较HA-Mn-MOF+H₂O₂组进一步降低，且溶液褪色更为彻底(图 2a插图)。这一结果表明，GSH的引入显著增强了HA-Mn-MOF的类芬顿催化活性。

  图 2

  

  图 2.  (a) 不同反应条件下MB在663 nm处的吸光度对比(孵育60 min)及对应溶液的颜色变化(插图); (b) Control、HA-Mn-MOF+GSH、HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH组与MB共孵育不同时间的UV-Vis吸收光谱图及对应溶液的颜色变化(插图); (c) 不同体系的类过氧化氢酶活性检测结果; (d) 不同时间点GSH和HA-Mn-MOF+GSH的UV-Vis吸收光谱图及(e) 相应420 nm处的吸光度强度变化; (f) SOSG、(g) H₂TCPP+SOSG、(h) HA-Mn-MOF+SOSG组的声动力性能评估; (i) 不同材料的声动力性能定量对比

  Figure 2.  (a) Comparison of MB absorbance at 663 nm under different reaction conditions (incubated for 60 min) and the corresponding solution color changes (inset); (b) UV-Vis absorption spectra of Control, HA-Mn-MOF+GSH, and HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH group incubated with MB for different time periods and the corresponding solution color changes (inset); (c) Detection results of catalase-like activity in different systems; (d) UV-Vis absorption spectra at different time points and (e) the corresponding absorbance intensity changes at 420 nm of GSH and HA-Mn-MOF+GSH; Sonodynamic performance evaluation of (f) SOSG, (g) H₂TCPP+SOSG, and (h) HA-Mn-MOF+SOSG group; (i) Quantitative comparison of sonodynamic performance of different materials

  Inset in panel a: Ⅰ, Control; Ⅱ, HA-Mn-MOF+GSH; Ⅲ, HA-Mn-MOF+H₂O₂; Ⅳ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH; Inset in panel b: Ⅰ, Control; Ⅱ, HA-Mn-MOF+GSH; Ⅲ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (0 min); Ⅳ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (5 min); Ⅴ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (10 min); Ⅵ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (15 min); Ⅶ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (30 min); Ⅷ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (60 min).

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  为了探究催化反应的动力学过程，进行了时间依赖性实验(图 2b)。在HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH组中，MB在663 nm处的吸光度随反应时间延长呈显著的时间依赖性下降，溶液颜色由深蓝色逐渐褪至浅色(图 2b插图)。该现象直观证实了HA-Mn-MOF能够在模拟TME中持续、高效地生成·OH，从而实现对MB的持续降解。该结果归因于GSH与材料中的Mn(Ⅲ)发生氧化还原反应，GSH作为还原剂将其还原为Mn(Ⅱ)，同时消耗GSH自身，进而促进H₂O₂分解生成·OH。以上证明HA-Mn-MOF在TME中具有良好的响应性，为肿瘤化学动力学治疗(CDT)提供了实验依据。

  2.2.2   类过氧化氢酶性能检测

  为评估HA-Mn-MOF的类过氧化氢酶催化性能，我们通过溶解氧测定实验对其在超声辐照下的产氧能力进行了系统分析(图 2c)。实验结果显示，与PBS+H₂O₂组及PBS+H₂O₂+US组相比，HA-Mn-MOF+PBS+H₂O₂+US组的溶氧量显著提升，产氧量可达14.86 mg·mL^-1，这些结果充分证明HA-Mn-MOF不仅具有高效的类过氧化氢酶特性，其催化活性还具有超声响应性。该特性使其能够有效分解TME中的H₂O₂并释放O₂，从而改善肿瘤组织的乏氧状态，为克服肿瘤缺氧导致的SDT抵抗提供新的解决方案。

  2.2.3   GSH耗竭性能检测

  肿瘤细胞内高浓度的GSH会消耗ROS，从而降低SDT的效果。因此，通过消耗GSH来增强SDT疗效已成为肿瘤治疗领域的研究热点之一。我们利用DTNB显色法评估了HA-Mn-MOF的GSH耗竭能力。基于GSH与DTNB反应生成的5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)在420 nm处具有特征吸收，该方法可以通过TNB吸光度的变化定量分析GSH的浓度。如图 2d所示，向GSH溶液中加入HA-Mn-MOF后，420 nm处的吸光度迅速下降，表明该材料具有快速消耗GSH的能力。随着反应时间的延长，GSH的消耗量逐渐增加，呈现明显的时间依赖性(图 2e)。上述结果表明，HA-Mn-MOF能够有效分解GSH，从而解除GSH对ROS的清除作用，为增强SDT效果提供了新策略。

  2.3   体外声动力性能

  采用SOSG评估HA-Mn-MOF材料在超声辐照下的ROS产生能力。SOSG探针本身不具有荧光，但在与单线态氧发生特异性反应后，可在525 nm处产生显著的绿色荧光信号。通过监测该波长处的荧光强度变化，实现对单线态氧生成量的定性分析。实验结果表明，随着超声时间的延长，各组溶液的荧光强度均呈现明显上升趋势(图 2f~2h)；在相同超声时间条件下，H₂TCPP+SOSG和HA-Mn-MOF+SOSG组的荧光强度均显著高于SOSG组(不添加纳米粒子)。值得注意的是，HA-Mn-MOF+SOSG组的荧光增强效应尤为突出，其荧光强度始终高于H₂TCPP+SOSG组。此外，HA-Mn-MOF诱导的ROS生成量表现出时间依赖性(图 2i)。上述结果表明，HA-Mn-MOF纳米材料具有优异的声动力性能，能够高效促进ROS的生成。

  2.4   MRI性能

  Mn-MOF独特的锰配位结构赋予了其优异的T₁加权MRI能力。如图 3a所示，MRI信号强度随探针浓度的增加而增强。通过定量分析T₁弛豫率发现，HA-Mn-MOF的T₁弛豫率具有显著的环境响应性：在pH=7.4时，r₁=1.54 L·mmol^-1·s^-1；pH=5.0时，r₁提升至1.88 L·mmol^-1·s^-1；而在含有GSH(5 mmol·L^-1)的条件下，其r₁值在pH=7.4和5.0时分别进一步升至3.34和4.16 L·mmol^-1·s^-1(图 3b)。这些结果表明，HA-Mn-MOF在模拟TME(酸性、高浓度GSH)中表现出显著增强的弛豫率，这一特性为实现肿瘤特异性MRI成像提供了有力保障。

  图 3

  

  图 3.  HA-Mn-MOF(a) 在不同条件下的T₁ WI及相应的T₁图、(b) 1/T₁和c_Mn2+的线性拟合图

  Figure 3.  (a) T₁ WI and corresponding T₁ mapping under different conditions, (b) linear fitting plots of 1/T₁ vs c_Mn2+ of HA-Mn-MOF

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  2.5   细胞实验

  2.5.1   细胞摄取

  采用CLSM观察4T1乳腺癌细胞与HA-Mn-MOF纳米材料共培养不同时间(0、0.5、1、2、4 h)后的摄取行为。结果显示，随着培养时间延长，4T1细胞内的荧光强度逐渐增强；而正常NIH-3T3细胞即使在与HA-Mn-MOF共培养4 h后，细胞内荧光信号仍非常微弱(图 4a)，表明HA-Mn-MOF能够被肿瘤细胞有效内化，具有良好的肿瘤细胞摄取选择性。

  图 4

  

  图 4.  (a) 4T1和NIH-3T3细胞分别与HA-Mn-MOF (50 μg·mL^-1)共孵育不同时间后的细胞内荧光图像; (b) NIH-3T3及(c) 4T1细胞经不同处理后的细胞存活率(**P < 0.01、***P < 0.001)

  Figure 4.  (a) Fluorescence images of 4T1 and NIH-3T3 cells after cultivation with HA-Mn-MOF (50 μg·mL^-1) for different cultivation times; Viability of (b) NIH-3T3 and (c) 4T1 cells after various treatments (**P < 0.01, ***P < 0.001)

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  2.5.2   细胞毒性实验

  MTS法评估了材料的体外生物安全性及治疗效果。在无超声条件下，0~100 μg·mL^-1的Mn-MOF和HA-Mn-MOF对NIH-3T3细胞无明显毒性(存活率 > 90%)(图 4b)。然而，在4T1细胞内，材料本身的类芬顿催化活性使其在细胞内持续产生ROS，造成一定氧化损伤。在超声辐照4 min后，HA-Mn-MOF表现出卓越的SDT/CDT协同杀伤效果：4T1细胞存活率下降至35%以下，且在质量浓度为100 ug·mL^-1时的杀伤效果显著优于未修饰的Mn-MOF(P < 0.001)(图 4c)。上述结果证实，超声辐照能显著增强HA-Mn-MOF的肿瘤细胞杀伤效果，这种协同增效机制为开发新型SDT制剂提供了实验依据。

  2.5.3   细胞内ROS生成效果评估

  为了评估HA-Mn-MOF在细胞内产生ROS的能力，实验采用荧光探针DCFH-DA进行检测。DCFH-DA本身无荧光，但进入细胞后可被酯酶水解生成DCFH，DCFH与ROS反应后产生强绿色荧光的DCF分子。通过荧光显微镜观察，可以定性与半定量分析细胞内ROS水平的变化。如图 5a所示，在超声辐照条件下，经HA-Mn-MOF处理的4T1细胞内荧光强度显著增强，表明细胞内ROS水平明显升高。相比之下，未加超声或未添加HA-Mn-MOF的其他组细胞荧光信号较弱，说明ROS生成主要依赖于材料的声动力效应。此外，如图 5b所示，HA-Mn-MOF+US组的荧光强度较Mn-MOF+US组明显提高(P < 0.000 1)，表明HA受体介导的靶向摄取可进一步促进ROS生成。上述结果说明，HA-Mn-MOF能够在超声触发下诱导肿瘤细胞内ROS的生成，为实现高效的SDT奠定了基础。

  图 5

  

  图 5.  不同处理组诱导4T1细胞内ROS生成的(a) 荧光图像和(b) 荧光染色强度半定量对比(****P < 0.000 1);(c) 4T1乳腺癌细胞经不同处理后的代表性活/死双染图像

  Figure 5.  (a) Fluorescence images and (b) semi-quantitative comparison of fluorescence staining intensity of ROS generation in 4T1 cells triggered by different treatment groups (****P < 0.000 1); (c) Representative live/dead staining images of 4T1 breast cancer cells following various treatments

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  2.5.4   Calcein-AM/PI双染法检测体外协同杀伤能力

  为直观评价HA-Mn-MOF的体外治疗效果，采用Calcein-AM/PI双染法进行死活细胞染色(活细胞呈绿色，死细胞呈红色)。如图 5c所示，由于类芬顿反应引起的氧化应激，Mn-MOF组和HA-Mn-MOF组中均观察到少量红色荧光；Mn-MOF+US组虽有红色荧光出现，但信号较弱，提示单纯SDT效果有限。相比之下，HA-Mn-MOF+US组的视野中几乎被红色荧光覆盖，绿色荧光极少，表明其通过SDT/CDT协同作用实现了肿瘤细胞的近乎完全清除，治疗效果显著优于无HA靶向修饰组。综上所述，HA-Mn-MOF纳米诊疗剂凭借HA的靶向识别能力与SDT/CDT的协同增效作用，能够更精准、高效地杀伤肿瘤细胞，为肿瘤靶向治疗提供了有力的实验依据。

  2.6   HA-Mn-MOF的细胞MRI性能

  在细胞水平上，HA-Mn-MOF展现出了优异的T₁加权MRI性能。通过将4T1细胞与不同浓度的HA-Mn-MOF共培养，然后进行T₁ WI扫描，结果显示，细胞内的MRI信号强度随材料浓度增加而增强，且在相同浓度下，其信号强度高于Mn-MOF非靶向组。而NIH-3T3细胞组的信号强度与PBS对照组无显著差异，证实了HA修饰赋予材料的肿瘤靶向特异性。定量感兴趣区域(ROI)分析进一步验证了信号强度与材料质量浓度的正相关性(图 6d)。上述结果表明，HA-Mn-MOF能够特异性地被肿瘤细胞摄取，并在细胞内展现出显著增强的T₁ WI能力，展示了其在肿瘤诊断及引导SDT/CDT精准治疗中的应用前景。

  图 6

  

  图 6.  (a) HA-Mn-MOF和NIH-3T3细胞、(b) Mn-MOF和4T1细胞、(c) HA-Mn-MOF和4T1细胞共孵育后的T₁ WI及T₁图; (d) ROI分析

  Figure 6.  T₁ WI and corresponding T₁ mapping after cultivation of (a) HA-Mn-MOF and NIH-3T3 cells, (b) Mn-MOF and 4T1 cells, (c) HA-Mn-MOF and 4T1 cells; (d) ROI analysis

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  3.   结论

  成功制备了一种基于HA修饰锰卟啉MOF的多功能纳米诊疗剂，其具有优异的MRI性能与SDT/CDT协同治疗效果。实验结果表明，HA-Mn-MOF不仅具有优异的类芬顿反应活性和SDT性能，还能有效消耗GSH，改善乏氧状态。在超声触发下，HA-Mn-MOF能够产生大量ROS，与CDT效应协同作用，实现了对肿瘤细胞的高效杀伤。同时，鉴于锰配位结构的独特性质，该材料表现出pH和GSH双重响应的T₁加权MRI能力，在模拟TME中表现出显著增强的弛豫率，为实现精准的影像引导治疗提供了可能。细胞实验进一步证实，HA的修饰显著提高了肿瘤细胞对材料的选择性摄取，而在正常细胞中摄取量极少，体现了良好的生物安全性。这些发现表明，HA-Mn-MOF凭借其精准的靶向能力、显著的协同治疗效果及灵敏的成像性能，在肿瘤的精准诊断和协同治疗领域展现出巨大的应用潜力。

  
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  图 1  新鲜制备的(a) Mn-MOF和(b) HA-Mn-MOF的TEM图像; (c) HA-Mn-MOF放置7 d后的TEM图像; (d) Mn-MOF和(e) HA-Mn-MOF的DLS粒径分布图; (f) Mn-MOF和HA-Mn-MOF的ζ电位; (g) HA-Mn-MOF和H₂TCPP的UV-Vis吸收光谱图; (h) 不同质量浓度HA-Mn-MOF的荧光光谱图; (i) HA-Mn-MOF水溶液放置7 d过程中荧光强度(660 nm)随时间的变化

  Figure 1  TEM images of as-prepared (a) Mn-MOF and (b) HA-Mn-MOF; (c) TEM image of HA-Mn-MOF after 7 d storage; DLS diameter distributions of (d) Mn-MOF and (e) HA-Mn-MOF; (f) ζ potentials of Mn-MOF and HA-Mn-MOF; (g) UV-Vis absorption spectra of HA-Mn-MOF and H₂TCPP; (h) Fluorescence spectra of HA-Mn-MOF at different concentrations; (i) Time-dependent fluorescence intensity changes of HA-Mn-MOF aqueous solutions (660 nm) over 7 d

  Inset: photographs taken under UV light (365 nm) at corresponding time points.

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  图 2  (a) 不同反应条件下MB在663 nm处的吸光度对比(孵育60 min)及对应溶液的颜色变化(插图); (b) Control、HA-Mn-MOF+GSH、HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH组与MB共孵育不同时间的UV-Vis吸收光谱图及对应溶液的颜色变化(插图); (c) 不同体系的类过氧化氢酶活性检测结果; (d) 不同时间点GSH和HA-Mn-MOF+GSH的UV-Vis吸收光谱图及(e) 相应420 nm处的吸光度强度变化; (f) SOSG、(g) H₂TCPP+SOSG、(h) HA-Mn-MOF+SOSG组的声动力性能评估; (i) 不同材料的声动力性能定量对比

  Figure 2  (a) Comparison of MB absorbance at 663 nm under different reaction conditions (incubated for 60 min) and the corresponding solution color changes (inset); (b) UV-Vis absorption spectra of Control, HA-Mn-MOF+GSH, and HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH group incubated with MB for different time periods and the corresponding solution color changes (inset); (c) Detection results of catalase-like activity in different systems; (d) UV-Vis absorption spectra at different time points and (e) the corresponding absorbance intensity changes at 420 nm of GSH and HA-Mn-MOF+GSH; Sonodynamic performance evaluation of (f) SOSG, (g) H₂TCPP+SOSG, and (h) HA-Mn-MOF+SOSG group; (i) Quantitative comparison of sonodynamic performance of different materials

  Inset in panel a: Ⅰ, Control; Ⅱ, HA-Mn-MOF+GSH; Ⅲ, HA-Mn-MOF+H₂O₂; Ⅳ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH; Inset in panel b: Ⅰ, Control; Ⅱ, HA-Mn-MOF+GSH; Ⅲ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (0 min); Ⅳ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (5 min); Ⅴ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (10 min); Ⅵ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (15 min); Ⅶ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (30 min); Ⅷ, HA-Mn-MOF+H₂O₂+GSH (60 min).

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  图 3  HA-Mn-MOF(a) 在不同条件下的T₁ WI及相应的T₁图、(b) 1/T₁和c_Mn2+的线性拟合图

  Figure 3  (a) T₁ WI and corresponding T₁ mapping under different conditions, (b) linear fitting plots of 1/T₁ vs c_Mn2+ of HA-Mn-MOF

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  图 4  (a) 4T1和NIH-3T3细胞分别与HA-Mn-MOF (50 μg·mL^-1)共孵育不同时间后的细胞内荧光图像; (b) NIH-3T3及(c) 4T1细胞经不同处理后的细胞存活率(**P < 0.01、***P < 0.001)

  Figure 4  (a) Fluorescence images of 4T1 and NIH-3T3 cells after cultivation with HA-Mn-MOF (50 μg·mL^-1) for different cultivation times; Viability of (b) NIH-3T3 and (c) 4T1 cells after various treatments (**P < 0.01, ***P < 0.001)

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  图 5  不同处理组诱导4T1细胞内ROS生成的(a) 荧光图像和(b) 荧光染色强度半定量对比(****P < 0.000 1);(c) 4T1乳腺癌细胞经不同处理后的代表性活/死双染图像

  Figure 5  (a) Fluorescence images and (b) semi-quantitative comparison of fluorescence staining intensity of ROS generation in 4T1 cells triggered by different treatment groups (****P < 0.000 1); (c) Representative live/dead staining images of 4T1 breast cancer cells following various treatments

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  图 6  (a) HA-Mn-MOF和NIH-3T3细胞、(b) Mn-MOF和4T1细胞、(c) HA-Mn-MOF和4T1细胞共孵育后的T₁ WI及T₁图; (d) ROI分析

  Figure 6  T₁ WI and corresponding T₁ mapping after cultivation of (a) HA-Mn-MOF and NIH-3T3 cells, (b) Mn-MOF and 4T1 cells, (c) HA-Mn-MOF and 4T1 cells; (d) ROI analysis

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