English

• 活性氧物质(ROS)是一系列含氧自由基和氧化衍生物的总称。ROS在细胞氧化还原稳态调控中发挥着关键作用，并参与多种生理和病理过程^[1]。在众多的ROS中，次氯酸(HClO)或次氯酸盐因其优异的抗菌能力，在免疫系统中起着至关重要的作用^[2]。然而，次氯酸根(ClO^-)水平异常升高会引起诸多氧化应激相关的疾病^[3]。因此，建立高效可行的方法用于精准监测生物体中的ClO^-具有重要意义。常用的ClO^-检测方法包括高效液相色谱、表面增强拉曼光谱、毛细管电泳法、电化学分析法、紫外可见光谱和荧光光谱等^[4]。其中，以荧光探针为主体的荧光法由于具有优越的时空分辨率和实时无创成像等特点，在可视化生物相关分子方面的应用引起了人们的广泛关注^[5]。目前，已报道了大量荧光探针用于检测和成像活细胞中的ClO^-，这些研究的设计策略通常是以硫族化合物^[5-8]、C=C^[9-11]、螺内酰胺^[12-14]、脲^[15-17]、C=N^[18-20]和硼酸酯^[21-23]等为识别基团，利用ClO^-的强氧化性对识别基团氧化引起的探针荧光变化来实现检测的目的。线粒体被誉为细胞的“能量工厂”，是细胞内ROS产生的主要场所^{[19, 21]}。然而，已报道的探针大多缺乏线粒体靶向能力，且部分探针存在合成方法复杂和响应时间偏长等问题，这限制了它们进一步的应用效果。因此，开发一种能够快速响应线粒体中ClO^-的荧光探针尤为迫切。

  鉴于查尔酮优异的荧光性能，我们设计、合成了一例基于吡啶-查尔酮的荧光探针(1)，并用于荧光检测ClO^-。在包含体积分数(φ_DMSO)为30%的DMSO的磷酸盐缓冲溶液(PBS，20 mmol·L^-1，pH 7.4)中，探针1的荧光微弱。ClO^-可特异性地增强探针1在550 nm处的荧光发射，且30 s内作用完全。光谱和密度泛函理论(DFT)计算结果证明了ClO^-促进的苯硼酸酯氧化机理及伴随的1，6-重排消除机理。由于吡啶鎓片段的存在，探针1被成功用于RAW264.7细胞线粒体和斑马鱼体内ClO^-的荧光成像。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  用于合成的原料和溶剂均购自上海麦克林生化科技有限公司，未经处理直接使用。化合物1a(图 1)参考文献^[24]方法合成。光谱性质测试中，所有溶剂均为光谱纯试剂，水为超纯水。¹H NMR在Bruker AV400 NMR核磁共振仪上室温测试得到；电喷雾电离质谱(ESI-MS)在Bruker Daltonics Esquire 6000质谱仪上获得；荧光光谱在Varian CARY Eclipse分光光度计上测定；UV-Vis吸收光谱在Purkinje General TU-1800分光光度计上测定；pH值用上海雷磁pHS‑3C型pH计测定；细胞和斑马鱼成像在蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微仪上完成。荧光光谱数据用Origin软件包处理。

  图 1

  

  图 1.  探针1的合成路线

  Figure 1.  Synthetic route of probe 1

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  1.2   探针1的合成

  将化合物1a(237 mg，1 mmol)与4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯(297 mg，1 mmol)加入到20 mL乙腈中回流13 h。减压旋蒸去除溶剂，然后用5 mL DMF与乙醇的混合溶剂(4∶1，V/V)重结晶得到亮黄色固体，即为探针1(68%)。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 10.99(s，1H，OH)，9.17~9.19(d，2H，Ar-H)，8.39~8.40(d，2H，Ar-H)，7.71~7.76(t，3H，Ar-H)，7.54~7.56(d，3H，Ar-H)，6.90~6.96(t，3H，Ar-H)，5.89(s，2H，CH₂)，4.19(s，2H，CH₂)，1.28(s，12H，4CH₃)。由于探针溶解性不佳，未获得满意的¹³C NMR谱图。ESI-MS[C₂₈H₂₉BNO₄⁺]：m/z=454.218 4(计算值)，454.222 7(实测值)。

  1.3   探针1的光谱性质测试

  首先用DMSO将探针1配成1 mmol·L^-1的储备液。测试前使用PBS(20 mmol·L^-1，pH 7.4，φ_DMSO=30%)稀释原液，配制成10 μmol·L^-1的探针1溶液。选择性和竞争性响应测试中所用潜在干扰分析物参考文献^[21]配制。荧光光谱测试中激发波长为420 nm，激发和发射狭缝宽度均为10 nm。

  1.4   生物成像实验

  细胞成像实验选用巨噬细胞(RAW264.7)为研究对象。在RAW264.7细胞的培养皿中加入探针1的DMSO溶液，体系中探针的最终浓度分别为0、10、20、30和40 μmol·L^-1。37 ℃下培养细胞24 h后，通过噻唑蓝(MTT)染色法评价探针的细胞毒性^[10]。使用包含探针1(10 μmol·L^-1)的培养基孵化细胞30 min，然后进行激光共聚焦成像。随后向培养基中加入ClO^-(40 μmol·L^-1)孵化30 min后，再次进行成像。另外，将细胞用脂多糖(LPS，2 μg·mL^-1)孵化30 min，然后与10 μmol·L^-1探针1一起孵化30 min，再进行激光共聚焦成像。激发波长为405 nm，绿色通道光谱波长范围为490~571 nm。

  采用斑马鱼进行活体成像实验，以考察探针1对ClO^-的识别能力。在2日龄斑马鱼培养液中加入探针1(10 μmol·L^-1)孵化30 min，进行激光共聚焦成像。将探针1(10 μmol·L^-1)孵化的斑马鱼用ClO^-(40 μmol·L^-1)孵化30 min，再次进行成像。另外，将斑马鱼用LPS(2 μg·mL^-1)孵化30 min，然后与10 μmol·L^-1探针1一起孵化30 min，再进行激光共聚焦成像。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针1对ClO^-的荧光识别

  利用荧光光谱研究探针对ClO^-的特异性识别。如图 2a所示，在420 nm激发下，10 μmol·L^-1探针1溶液在550 nm处的荧光微弱；ClO^-(100 μmol·L^-1)的加入引起了550 nm处荧光发射强度的显著增强。同时，在365 nm紫外灯下，加入ClO^-前后探针1的溶液颜色呈现肉眼可见的由暗到黄的明显变化(图 2a插图)。1+ClO^-体系的最大吸收波长为420 nm，斯托克斯位移达到130 nm(图S1，Supporting information)。另外，我们研究了加入其他物质对探针1荧光强度的影响。结果表明，除过氧化亚硝酰(OONO^-)引起探针1荧光发射强度的轻微增强外(不足ClO^-效果的20%)，其它代表性阳离子(Ag⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)、阴离子[OAc^-、ClO₄^-、H₂PO₄^-、PO₄^3-、HPO₄^2-、SO₄^2-、HSO₄^-、Br^-、SO₃^2-、HSO₃^-、焦磷酸根(PPi)、I^-]、生物硫醇[半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)]和ROS(ROO^-、NO、H₂O₂、·OH)加入后，探针1荧光几乎保持不变。同时，其它潜在共存干扰物(150 μmol·L^-1)的加入对1+ClO^-体系的荧光发射强度无明显影响(图 2b)，表明探针1对ClO^-识别的优异选择性。

  图 2

  

  图 2.  (a) 探针1和加入100 μmol·L^-1不同分析物后体系的荧光光谱; (b) 150 μmol·L^-1共存潜在干扰物对探针1和1+ClO^-在550 nm处荧光强度的影响; (c) 不同浓度ClO^-存在时探针1的荧光光谱; (d) 探针1在550 nm处荧光强度与ClO^-浓度的线性关系

  Figure 2.  (a) Fluorescence spectra of probe 1 before and after addition of different analytes (100 μmol·L^-1); (b) Influence of co-existence of potential competitive analytes (150 μmol·L^-1) on the emission intensity of probe 1 and 1+ClO^- at 550 nm; (c) Fluorescence spectra of probe 1 in the presence of different concentrations of ClO^-; (d) Linearity relationship between fluorescence intensity of probe 1 at 550 nm with the concentration of ClO^-

  Inset in a: fluorescence color changes of probe 1 solution with and without ClO^-; In b: 1: probe 1; 2: 1+ClO^-; 3: 1+ClO^-+ROO^-; 4: 1+ClO^-+ONOO^-; 5: 1+ClO^-+NO; 6: 1+ClO^-+H₂O₂; 7: 1+ClO^-+·OH; 8: 1+ClO^-+Ag⁺; 9: 1+ClO^-+Ca²⁺; 10: 1+ClO^-+Cd²⁺; 11: 1+ClO^-+Co²⁺; 12: 1+ClO^-+Cr³⁺; 13: 1+ClO^-+Cu²⁺; 14: 1+ClO^-+Fe³⁺; 15: 1+ClO^-+K⁺; 16: 1+ClO^-+Mg²⁺; 17: 1+ClO^-+Mn²⁺; 18: 1+ClO^-+Na⁺; 19: 1+ClO^-+Ni²⁺; 20: 1+ClO^-+Pb²⁺; 21: 1+ClO^-+Zn²⁺; 22: 1+ClO^-+Cys; 23: 1+ClO^-+Hcy; 24: 1+ClO^-+GSH; 25: 1+ClO^-+OAc^-; 26: 1+ClO^-+ClO₄^-; 27: 1+ClO^-+H₂PO₄^-; 28: 1+ClO^-+PO₄^3-; 29: 1+ClO^-+HPO₄^2-; 30: 1+ClO^-+SO₄^2-; 31: 1+ClO^-+HSO₄^-; 32: 1+ClO^-+Br^-; 33: 1+ClO^-+SO₃^2-; 34: 1+ClO^-+HSO₃^-; 35: 1+ClO^-+PPi; 36: 1+ClO^-+I^-.

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  随后考察了不同浓度ClO^-对探针1荧光光谱的影响。如图 2c所示，探针1在550 nm处的荧光强度与ClO^-浓度正相关。当ClO^-加入量达到100 μmol·L^-1时体系荧光发射强度趋于稳定。数据拟合结果表明(图 2d)，探针在550 nm处的荧光强度和ClO^-在0~100.0 μmol·L^-1范围内线性相关，根据公式LOD=3σ/k(其中σ为标准差，k为斜率)得出检出限(LOD)为0.4 μmol·L^{-1 [16]}。此外，探究了体系pH对探针1荧光稳定性的影响。由图 3a可知，探针1的有效工作pH范围为7.0~14.0。由图 3b可知，探针1在30 s内即可与ClO^-反应完全。结果表明，探针1对ClO^-的定量检测具有快速、灵敏、工作pH范围宽和斯托克斯位移大的特点，有望用于复杂生物样品中ClO^-的荧光成像。

  图 3

  

  图 3.  (a) pH对探针1和1+ClO^-在550 nm处荧光强度的影响; (b) 加入ClO^-后探针1的荧光强度-时间响应曲线

  Figure 3.  (a) Effect of pH on the fluorescence intensity of probe 1 and 1+ClO^- at 550 nm; (b) Fluorescence intensity-time response curve of probe 1 after adding ClO^-

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  2.2   探针1与ClO^-的作用机理

  利用ESI-MS研究探针1对ClO^-的识别机制。如图 4a所示，在加入ClO^-后，m/z=454.222 7处归属于[1+H]⁺的峰基本消失；m/z=259.057 7处出现了一个新的峰，归属于[1a-H+Na]⁺(理论值：259.060 9)。结合文献^[25]，我们推测ClO^-促进了探针苯硼酸酯的氧化和水解，并进一步发生了羟基苯基亚甲基的1，6-重排消除，进而得到化合物1a，并发射其特征黄色荧光。

  图 4

  

  图 4.  (a) 化合物1a及探针1加入ClO^-前后的ESI-MS谱图; (b) DFT优化的探针1和化合物1a的结构及HOMO/LUMO

  Figure 4.  (a) ESI-MS spectra of compound 1a and probe 1 before and after adding ClO^-; (b) Optimized structures and HOMO/LUMO of probe 1 and compound 1a by DFT

  Inset: possible reaction mechanism between probe 1 and ClO^-; C: gray ball; N: blue ball; O: red ball; H: green ball; B: cyan ball.

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  利用DFT计算优化了1和1a的结构，从理论上研究了ClO^-对1的荧光开启过程。如图 4b所示，1和1a的最高占据分子轨道(HOMO)都集中在茚酮部分，而最低未占据分子轨道(LUMO)则主要集中在吡啶部分，这清楚地表明了分子内电荷转移(ICT)过程。然而，探针1中的硼原子空轨道可能接受激发态电子，即潜在的给电子光诱导电子转移(d-PET)过程猝灭了探针1的荧光。此外，1的HOMO与LUMO能级差(2.71 eV)小于1a(4.18 eV)，与探针1加入ClO^-后最大吸收峰的蓝移结果一致(从460到420 nm，图S1)。上述结果有力证实了图 4a插图所示的检测机理。

  2.3   探针1的生物成像应用

  通过MTT法测定了探针1对RAW264.7细胞的毒性。高浓度探针1(40 μmol·L^-1)孵化24 h后细胞存活率超过85%(图S2)，表明该探针的细胞毒性较低。使用激光共聚焦显微镜测试了探针1对细胞内ClO^-的荧光成像。如图 5所示，孵化探针1(10 μmol·L^-1)的RAW264.7细胞在绿色通道呈现微弱荧光；加入ClO^-(40 μmol·L^-1)继续孵化后，细胞内绿色通道的荧光明显增强；先孵化LPS(2 μg·mL^-1，内源性ClO^-刺激剂)的细胞再孵化探针1后，绿色通道荧光信号显著增强。上述结果有效证实了探针可以检测活RAW264.7细胞中的外源性和内源性ClO^-。

  图 5

  

  图 5.  RAW264.7细胞的共聚焦荧光图像: (a) 对照组; (b) 37 ℃下10 μmol·L^-1探针1孵化细胞30 min; (c) 探针1孵化的细胞加入40 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化30 min; (d) LPS (2 μg·mL^-1)孵化细胞30 min后再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min

  Figure 5.  Confocal fluorescence images of RAW264.7 cells: (a) control group; (b) cells incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 37 ℃; (c) cells incubated with probe 1, and then with 40 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min; (d) cells incubated with LPS (2 μg·mL^-1) for 30 min, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 30 min

  Scale bar: 10 μm.

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  使用1+ClO^-(40 μmol·L^-1)和Mito-Tracker Blue(一种商用线粒体染料)对RAW264.7细胞共染，以评估探针1的亚细胞器靶向能力。如图S3所示，绿色和蓝色通道的强度变化几乎同步，Pearson系数为0.86，显著高于溶酶体、高尔基体和内质网的共染系数(图S4)，表明探针1主要靶向细胞线粒体。

  斑马鱼成像结果表明(图 6)，探针1(10 μmol·L^-1)孵化的斑马鱼腹腔荧光微弱；继续ClO^-(40 μmol·L^-1)孵化，或先LPS(2 μg·mL^-1)孵化再探针孵化的斑马鱼腹腔发射强绿色荧光。因此，探针1能够检测斑马鱼体内ClO^-浓度的变化。上述成像结果表明，探针1可用于多种生物样本中ClO^-浓度变化的监测。

  图 6

  

  图 6.  斑马鱼共聚焦荧光图像: (a) 对照组; (b) 28 ℃下10 μmol·L^-1探针1孵化斑马鱼30 min; (c) 探针孵化的斑马鱼加入40 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化30 min; (d) LPS (2 μg·mL^-1)孵化斑马鱼30 min后再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min

  Figure 6.  Confocal fluorescence images of zebrafish: (a) control group; (b) zebrafish incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 28 ℃; (c) zebrafish incubated with probe 1, and then with 40 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min; (d) zebrafish incubated with LPS (2 μg·mL^-1) for 30 min, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 30 min

  Scale bar: 200 μm.

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  3.   结论

  我们设计、合成了一例吡啶鎓-查尔酮荧光探针。探针在富水体系中荧光微弱，其选择性地与ClO^-作用后绿色荧光显著增强，可用于ClO^-的荧光开启检测。通过质谱和理论计算验证了ClO^-介导的探针的氧化-消除反应机理。此外，探针1主要靶向线粒体，并能够实时监测RAW264.7细胞和活体斑马鱼中内源性和外源性ClO^-的浓度变化，具有潜在广泛的应用前景。

  
  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn
  
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  图 1  探针1的合成路线

  Figure 1  Synthetic route of probe 1

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  图 2  (a) 探针1和加入100 μmol·L^-1不同分析物后体系的荧光光谱; (b) 150 μmol·L^-1共存潜在干扰物对探针1和1+ClO^-在550 nm处荧光强度的影响; (c) 不同浓度ClO^-存在时探针1的荧光光谱; (d) 探针1在550 nm处荧光强度与ClO^-浓度的线性关系

  Figure 2  (a) Fluorescence spectra of probe 1 before and after addition of different analytes (100 μmol·L^-1); (b) Influence of co-existence of potential competitive analytes (150 μmol·L^-1) on the emission intensity of probe 1 and 1+ClO^- at 550 nm; (c) Fluorescence spectra of probe 1 in the presence of different concentrations of ClO^-; (d) Linearity relationship between fluorescence intensity of probe 1 at 550 nm with the concentration of ClO^-

  Inset in a: fluorescence color changes of probe 1 solution with and without ClO^-; In b: 1: probe 1; 2: 1+ClO^-; 3: 1+ClO^-+ROO^-; 4: 1+ClO^-+ONOO^-; 5: 1+ClO^-+NO; 6: 1+ClO^-+H₂O₂; 7: 1+ClO^-+·OH; 8: 1+ClO^-+Ag⁺; 9: 1+ClO^-+Ca²⁺; 10: 1+ClO^-+Cd²⁺; 11: 1+ClO^-+Co²⁺; 12: 1+ClO^-+Cr³⁺; 13: 1+ClO^-+Cu²⁺; 14: 1+ClO^-+Fe³⁺; 15: 1+ClO^-+K⁺; 16: 1+ClO^-+Mg²⁺; 17: 1+ClO^-+Mn²⁺; 18: 1+ClO^-+Na⁺; 19: 1+ClO^-+Ni²⁺; 20: 1+ClO^-+Pb²⁺; 21: 1+ClO^-+Zn²⁺; 22: 1+ClO^-+Cys; 23: 1+ClO^-+Hcy; 24: 1+ClO^-+GSH; 25: 1+ClO^-+OAc^-; 26: 1+ClO^-+ClO₄^-; 27: 1+ClO^-+H₂PO₄^-; 28: 1+ClO^-+PO₄^3-; 29: 1+ClO^-+HPO₄^2-; 30: 1+ClO^-+SO₄^2-; 31: 1+ClO^-+HSO₄^-; 32: 1+ClO^-+Br^-; 33: 1+ClO^-+SO₃^2-; 34: 1+ClO^-+HSO₃^-; 35: 1+ClO^-+PPi; 36: 1+ClO^-+I^-.

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  图 3  (a) pH对探针1和1+ClO^-在550 nm处荧光强度的影响; (b) 加入ClO^-后探针1的荧光强度-时间响应曲线

  Figure 3  (a) Effect of pH on the fluorescence intensity of probe 1 and 1+ClO^- at 550 nm; (b) Fluorescence intensity-time response curve of probe 1 after adding ClO^-

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  图 4  (a) 化合物1a及探针1加入ClO^-前后的ESI-MS谱图; (b) DFT优化的探针1和化合物1a的结构及HOMO/LUMO

  Figure 4  (a) ESI-MS spectra of compound 1a and probe 1 before and after adding ClO^-; (b) Optimized structures and HOMO/LUMO of probe 1 and compound 1a by DFT

  Inset: possible reaction mechanism between probe 1 and ClO^-; C: gray ball; N: blue ball; O: red ball; H: green ball; B: cyan ball.

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  图 5  RAW264.7细胞的共聚焦荧光图像: (a) 对照组; (b) 37 ℃下10 μmol·L^-1探针1孵化细胞30 min; (c) 探针1孵化的细胞加入40 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化30 min; (d) LPS (2 μg·mL^-1)孵化细胞30 min后再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min

  Figure 5  Confocal fluorescence images of RAW264.7 cells: (a) control group; (b) cells incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 37 ℃; (c) cells incubated with probe 1, and then with 40 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min; (d) cells incubated with LPS (2 μg·mL^-1) for 30 min, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 30 min

  Scale bar: 10 μm.

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  图 6  斑马鱼共聚焦荧光图像: (a) 对照组; (b) 28 ℃下10 μmol·L^-1探针1孵化斑马鱼30 min; (c) 探针孵化的斑马鱼加入40 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化30 min; (d) LPS (2 μg·mL^-1)孵化斑马鱼30 min后再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min

  Figure 6  Confocal fluorescence images of zebrafish: (a) control group; (b) zebrafish incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 28 ℃; (c) zebrafish incubated with probe 1, and then with 40 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min; (d) zebrafish incubated with LPS (2 μg·mL^-1) for 30 min, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 30 min

  Scale bar: 200 μm.

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