English

• 0.   引言

  根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的GLOBOCAN 2022数据^[1]，2022年全球癌症新发病例为有将近2000万，其中乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，据统计，2022年新发病例约230万例(在全部癌症中发病率占11.5%)，发病率仅次于肺癌(12.4%)，死亡病例约67万例(占女性癌症死亡的6.9%)，排名第五。目前乳腺肿瘤标志物包括组织标志物[激素受体、人表皮生长因子受体2(HER2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、p53蛋白和组织蛋白酶D]、遗传标志物[BRAC1、br2和潜在标志物(基因表达芯片技术发现)等]、血清标志物(CA15.3、BR27.29、MCA、CA549、癌胚抗原、癌蛋白和细胞角蛋白)^[2]，利用这些标志物诊断乳腺癌的主要缺陷为缺乏早期阶段的敏感性和特异性^[3]。目前研究表明，ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)、HER2、uPA和PAI-1等是乳腺癌中最有效的标志物，然而，这些生物标志物在临床上难以有效应用^[4-5]。因此，相较于传统的放射诊断(包括多相对比计算机断层扫描或磁共振成像)，寻找与乳腺癌细胞相关且可通过体液或组织检测的可靠标志物^[6]是提高诊断准确性和克服放射诊断策略(如频繁监测和辐射暴露)缺点的最有希望的方法^[7]。

  脂肪酶作为羧酸酯酶的一种，有望成为乳腺癌细胞新的生物标志物候选^[8-12]。另一方面，荧光探针可以通过体内外成像实现对研究目标的可视化检测，因其高选择性^[13-14]、高灵敏度^[15-18]、生物友好性^[19]、以及原位实时^[20]等优势，成为生物科学中一种非常有效的技术^[21]。迄今为止，酶探针的经典设计方法一般是基于“抑制剂衍生”的方法，该策略将经典酶抑制剂的活性部分或整个结构引入荧光发色团，并将其偶联到荧光发色团上，以调节荧光的释放^[22]。脂肪酶可以催化具有脂酰甘油酯键的底物水解，如氯吡格雷、普拉格雷等^[23]。早在2012年，Ma团队就引入羧酸酯键作为脂肪酶的响应位点，开发了一种基于间苯二酚的脂肪酶荧光开关探针^[21]。迄今为止，脂肪酶的检测仍然是研究热点。2025年，Fan等以花青氨酸为基础，通过加入不同链长的脂肪酸增强荧光探针的特异性。通过体外和体内实验，证实该探针具有较高的特异性和灵敏度，可有效监测各种生物样品中的胰脂肪酶活性^[24]。

  聚集诱导发光(AIE)的概念是Tang的研究小组提出的^[25-26]，该研究小组发现1-甲基-1，2，3，4，5-五苯基硅烷(HPS)在乙腈溶液中的荧光可忽略不计，但在该体系中加水后荧光显著增强^[27]，该现象与聚集导致猝灭(ACQ)现象形成鲜明对比，从而引起了AIE的飞速发展。从本质上讲，AIE描述了一种荧光现象，与单个分子相比，处于聚集状态的分子表现出更强的荧光发射^[28]，这是由于聚集后分子自由内旋转受到限制。AIE分子由于具有较高的生物相容性及聚集态发光的特点，在荧光传感、生物传感和细胞成像领域得到了广泛的应用^[29]。此外，AIE分子因聚集而形成的独有的微小界面使其对脂肪酶具有更高的选择性，相比于在分子设计上进行改进可以节省很大的成本。

  结合AIE聚集形成微界面的特点及优异的光学性能，我们开发了一种基于三苯胺的荧光探针 BTPA，该探针具有优异的AIE性能(Scheme 1)。该探针中含有酯键作为脂肪酶的识别位点，在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中通过自身聚集形成AIE分子并发出蓝色荧光。AIE分子独有的微小界面可快速激活脂肪酶的活性，从而被脂肪酶水解，水解产物Pro-2仍具有AIE性能，使脂肪酶在562 nm表现出“点亮BTPA”的现象。该分子对脂肪酶具有较低的检出限，同时由于其良好的生物相容性和较低的生物毒性，该分子可以应用于活体细胞的原位成像中。本研究为脂肪酶检测提供了新的思路，有望促进乳腺癌细胞准确诊断的进展。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Schematic representation of lipase recognition mechanism utilizing probe BPTA

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  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  主要仪器有TWCL-T-500恒温磁力搅拌仪(郑州科创仪器有限公司)、RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、SHZ-Ⅲ真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)、真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)、T-A 1204B分析天平(上海精科天美科学仪器)、AVANCE Ⅲ HD 600 MHz核磁共振仪，F-2700日立荧光光谱仪(日本株式会社)、Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪(英国马尔文帕纳科公司)、低电压透射电镜(TEM，美国FEI Tecnai 12，120 kV)、HFclean 1300垂直流超净工作台(力康精密科技有限公司)、SC3616低速离心机(安徽中佳中科仪器有限公司)、HF240二氧化碳培养箱(上海力康精密科技有限公司)、Agilent 6520质谱仪(安捷伦科技公司)、SpectraMax iD多功能微孔读板机(美谷分子仪器有限公司)、LSM880+airyscan激光共聚焦显微镜(德国蔡司ZEISS)。

  猪胰脂肪酶购自Sigma生物试剂有限公司。5-溴-水杨醛、2-氨基苯硫酚、过氧化氢、无水碳酸铯、碳酸钾、二苯氨基苯硼酸、双三苯基磷二氯化钯均购自阿拉丁生物试剂有限公司。盐酸和乙酸酐购自北京化工厂。乙腈、二氯甲烷、石油醚、无水乙醇、1，4-二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、无水硫酸钠均购自天津市大茂化学试剂厂。氯化钠购自天津市北辰化工试剂厂。氘代试剂购自宁波旋光医药科技有限公司。柱层析硅胶购自烟台江友硅胶开发有限公司。PBS即用型干粉购自塞维尔生物科技有限公司。

  1.2   荧光探针BTPA的合成

  1.2.1   化合物Pro-1的合成

  如Scheme 2所示，将5-溴-水杨醛和2-氨基苯硫酚以1∶1的物质的量之比溶于无水乙醇中，加热搅拌回流，随后依次加入H₂O₂和浓盐酸各200 μL。继续搅拌回流直至析出固体，该固体即为反应产物。反应结束后趁热过滤并用乙醇洗涤固体，得到产物Pro-1。其¹H NMR谱如图 1a所示。

  Scheme 2

  

  Scheme 2.  Synthesis route of probe BTPA

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  图 1

  

  图 1.  (a) Pro-1在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图; (b) Pro-2在CDCl₃中的¹H NMR谱图

  Figure 1.  (a) ¹H NMR spectrum of Pro-1 in DMSO-d₆; (b) ¹H NMR spectrum of Pro-2 in CDCl₃

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  1.2.2   化合物Pro-2的合成

  将2 mol·L^-1的碳酸钾溶液和1，4-二氧六环的混合物(体积比3∶7)作为反应溶剂，以化合物Pro-1和二氨基苯硼酸作为反应物溶于上述反应溶剂中，在氮气保护的条件下加入双(三苯基磷)二氯化钯(Pb(PPh₃)₂Cl₂)，继续回流12 h(120 ℃)至反应完成。减压蒸馏除去溶剂(可残余少部分水)后以二氯甲烷为萃取剂萃取出产物的粗产品。用柱色谱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯，体积比10∶1)分离出最终产物。¹H NMR谱如图 1b所示。

  1.2.3   化合物BTPA的合成

  将化合物Pro-2溶于乙腈中，回流，在碳酸铯的催化下逐滴加入乙酸酐(化合物Pro-2的7倍)，继续加热搅拌回流4 h后反应结束。减压蒸馏除去溶剂后溶于乙酸乙酯中，随后用蒸馏水多次萃取除去产物中的乙酸酐，得到产物粗产品，最后利用柱色谱分离出最终产物。¹H NMR谱、¹³C NMR谱、ESI-MS谱表征数据如图 2所示。

  图 2

  

  图 2.  (a) BTPA在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图; (b) BTPA在DMSO-d₆中的¹³C NMR谱图; (c) BTPA的ESI-MS谱图

  Figure 2.  (a) ¹H NMR spectrum of BTPA in DMSO-d₆; (b) ¹³C NMR spectrum of BTPA in DMSO-d₆; (c) ESI-MS spectrum of BTPA

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  1.3   光谱实验

  用DMSO配置1 mmol·L^-1的BTPA溶液作为母液，冷藏备用。实验中所用的缓冲溶液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制的pH=7.4的PBS(10 mmol·L^-1)。

  1.4   激光共聚焦成像实验

  细胞在含有双抗的10%胎牛血清培养基中培养，二氧化碳体积分数为5%，培养温度为37 ℃，在共聚焦成像之前，用探针BTPA预处理细胞2 h，随后移去原有的培养液，更换为新的培养液，空白组则不做任何处理。

  2.   结果与讨论

  2.1   BTPA及Pro-2的AIE性质

  为确保探针可以在H₂O体系中发出荧光，并顺利地应用于细胞内脂肪酶地检测，首先采用荧光光谱法探究了探针BTPA及Pro-2在H₂O/DMSO中的光谱性质，实验结果如图 3所示。由图 3a可知，BTPA的DMSO溶液在405 nm处有很弱的荧光发射，随着混合溶剂中H₂O含量(体积分数)由0%增加至20%，BTPA的荧光强度有轻微的减弱。随着H₂O含量的继续增加，溶液的发射波长逐渐红移，荧光发射也逐渐增强。当DMSO和H₂O比例达到6∶4时，BTPA的波长明显红移至450 nm，随后随着H₂O比例的继续增加，荧光强度出现明显增强。当混合溶剂中DMSO和H₂O比例达到2∶8时，溶液具有最强的荧光发射。继续增加H₂O含量，荧光强度有轻微下降，这是由于BTPA分子在不良溶剂(H₂O)中发生明显聚集，对发出的荧光产生自吸收而导致的，表明BTPA具有AIE效应。图 3b展示了荧光强度比I_{450 nm}/I_{409 nm}随H₂O含量的变化趋势，可以直观地看出，I_{450 nm}/I_{409 nm}随H₂O含量的增加而增加，这证明探针BTPA具有很好的AIE性能。同样地，在图 3c和3d中显示了Pro-2的AIE性质。Pro-2的DMSO溶液在507 nm处有较强的荧光发射，随着H₂O含量的增加，溶液在507 nm的荧光强度逐渐减弱，随后在562 nm出现新的荧光，这同样证明Pro-2也是很好的AIE分子。BTPA的AIE性能保证了该探针在PBS中发出荧光，同时可以发生聚集并与外界溶液形成微小界面。这为激活界面催化的脂肪酶活性提供了可能。Pro-2的AIE性能确保了探针的水解产物(见2.3 BTPA检测脂肪酶的机理)仍能在水体系中发出荧光。

  图 3

  

  图 3.  (a) BTPA (10.0 μmol·L^-1)在不同比例的H₂O/DMSO混合物中的荧光光谱; (b) BTPA的I_{450 nm}/I_{409 nm}随H₂O体积分数的变化; (c) Pro-2 (10.0 μmol·L^-1)在不同比例的H₂O/DMSO混合物中的荧光光谱; (d) I_{562 nm}/I_{507 nm}随H₂O体积分数的变化

  Figure 3.  (a) Fluorescence spectra of BTPA (10.0 μmol·L^-1) in the H₂O/DMSO mixtures with different proportions; (b) Variation of I_{450 nm}/I_{409 nm} of BTPA with the volume fraction of H₂O; (c) Fluorescence spectra of Pro-2 (10.0 μmol·L^-1) in the H₂O/DMSO mixtures with different proportions; (d) Variation of I_{562 nm}/I_{507 nm} of Pro-2 with the volume fraction of H₂O

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  2.2   探针对脂肪酶的响应

  2.2.1   脂肪酶对探针BTPA的滴定

  为探究探针BTPA对脂肪酶的检测性能，我们研究了在不同活性的猪胰脂肪酶(PPL)存在下，BTPA溶液的荧光强度的变化。在37 ℃的水浴条件下，BTPA(10.0 μmol·L^-1)在pH=7.4的PBS(10.0 mmol·L^-1)中分别被不同活性的PPL处理30 min，测定其荧光强度。实验结果如图 4a所示，在340 nm的激发波长下，BTPA溶液的荧光强度几乎为零，随着PPL活性的增加，荧光强度逐渐增加，当PPL活性达到4.5×10^-4 U·mL^-1时，荧光强度基本达到稳定水平，此时，BTPA的荧光强度不再随PPL活性的增加而改变。在探针对PPL响应的荧光发射波长中，选择最大发射波长处(557 nm)的荧光强度作为纵坐标对PPL的活性作图，所得结果图 4b所示，在5.0×10^-5~4.5×10^-4 U·mL^-1范围内进行线性拟合，R²=0.98，这表明通过直线拟合得到的标准曲线具有很高的可信度。由标准曲线可知，BTPA在5.0×10^-5~4.5×10^-4 U·mL^-1范围内的荧光发射强度与脂肪酶的活性呈线性相关，根据检出限(LOD)公式LOD=3σ_blank/k(σ_blank：空白样本多次测量的信号标准偏差，k：校准曲线的斜率)进行计算，探针BTPA对PPL的检出限为4.94×10^-6 U·mL^-1。

  图 4

  

  图 4.  (a) 不同活性的PPL存在下, 探针BTPA(10.0 μmol·L^-1)的荧光强度; (b) 557 nm处PPL活性依赖的BTPA荧光强度

  Figure 4.  (a) Fluorescence intensities of BTPA (10.0 μmol·L^-1) in the presence of PPL with different activities; (b) Fluorescence intensity of BTPA at 557 nm dependent on PPL activity

  λ_ex=340 nm.

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  2.2.2   探针与脂肪酶反应的动态监测

  为探究探针BTPA与脂肪酶反应的有效时间，在BTPA的PBS中分别加入不同活性(0~5.0×10^-4 U·mL^-1)的PPL，每2 min测一次溶液在557 nm处的荧光强度，得到探针BTPA在脂肪酶的存在下荧光强度随时间的变化趋势(图 5)。如图所示，随着PPL活性的增加，反应达到平衡所需时间缩短，且溶液的荧光强度逐渐增加。当脂肪酶活达到4.5×10^-4 U·mL^-1时，溶液的荧光强度达到最大且反应在17 min达到平衡。若脂肪酶活性不变，则随着反应时间的进行荧光强度逐渐增强直至不再发生变化。

  图 5

  

  图 5.  加入不同活性的PPL后, BTPA在557 nm处的荧光强度随时间的变化

  Figure 5.  Change in fluorescence intensity of BTPA at 557 nm over time after adding PPL with different activities

  λ_ex=340 nm.

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  2.2.3   探针BTPA对脂肪酶响应的选择性与干扰性实验

  为证明该探针可以特异性检测脂肪酶，采用光谱法探究了探针对脂肪酶的选择性和干扰性。首先进行了探针对脂肪酶的选择性实验，在10.0 μmol·L^-1的BTPA溶液中分别加入20倍生物体内常见的金属离子或氨基酸，在37 ℃水浴条件下处理30 min，检测其荧光强度。选取最大发射波长557 nm处的荧光强度作纵坐标得到图 6a。实验结果表明BTPA只有与脂肪酶(PPL)混合后有荧光的“点亮”，而与其它物质混合后没有明显的荧光变化，所以探针BTPA可以选择性检测脂肪酶。随后模拟了探针BTPA对脂肪酶的抗干扰性实验，在10.0 μmol·L^-1的BTPA溶液和10倍脂肪酶共存的条件下，分别加入20倍的生物体内常见的金属离子或氨基酸，同样在37 ℃水浴条件下处理后测得557 nm的荧光强度(图 6b)。由图可知其它离子的存在并不会影响探针对脂肪酶的“点亮”，因此BTPA具有很强的抗干扰性。综上所述，探针BTPA可以在复杂体系中选择性检测脂肪酶。

  图 6

  

  图 6.  (a) 金属离子/氨基酸/20倍PPL处理BTPA溶液后在557 nm的荧光强度; (b) 金属离子/氨基酸处理BTPA溶液与PPL(10倍)混合物后在557 nm的荧光强度

  Figure 6.  (a) Fluorescence intensity at 557 nm after treating BTPA solution with metal ions/amino acids/20-fold PPL; (b) Fluorescence intensity at 557 nm after treating the mixture of BTPA solution and PPL (10-fold) with metal ions/amino acids

  Treatment conditions: 37 ℃, 30 min, c_BTPA=10.0 μmol·L^-1, 20-fold metal ions or amino acids.

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  2.3   BTPA检测脂肪酶的机理

  2.3.1   BTPA与PPL的反应产物

  为探究探针BTPA对脂肪酶响应后是否发生水解反应，采用电喷雾质谱对探针及响应后的混合物进行了分析。图 7a为37 ℃下脂肪酶处理BTPA后产物的电喷雾质谱，产物的电喷雾质谱实验值为m/z=471.152 9。如图 7b所示，Pro-2在m/z=471.153 2出现强峰(计算值：[Pro-2+H]⁺，m/z=471.152 6)。处理产物与Pro-2的m/z值一致，可以证明BTPA对脂肪酶响应后发生了水解反应，且水解产物为Pro-2，同时这一探究明确了探针BTPA被脂肪酶“点亮”的发光来源为Pro-2。

  图 7

  

  图 7.  (a) PPL处理BTPA后的电喷雾质谱; (b) Pro-2的电喷雾质谱

  Figure 7.  (a) ESI-MS spectrum of BTPA after PPL treatment; (b) ESI-MS spectrum of Pro-2

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  2.3.2   脂肪酶特异性水解BTPA的机理

  脂肪酶作为界面催化的酶，在界面上的催化水解底物效果更好，因此提供界面用于脂肪酶催化至关重要。若BTPA为颗粒或者胶束时，则BTPA在溶液中形成微小界面，因而可以被脂肪酶特异性催化水解，从而使得荧光被“点亮”。

  AIE性质已初步证明BTPA在水溶液中发生了聚集。为进一步探究探针在水溶液中是否形成微界面，首先，利用动态光散射测定了BTPA、Pro-2以及BTPA和脂肪酶混合产物的粒径，实验结果如图 8所示。图 8a显示了探针BTPA在DMSO溶液中的平均粒径为32.95 nm，而在PBS中的平均粒径为468.26 nm，因此探针在PBS中发生了聚集。该聚集态在水溶液中充当了微界面，便于被脂肪酶界面催化。其次，为进一步了解探针在DMSO和PBS中的尺寸相对大小，进行了TEM实验。如图 8插图所示，探针在DMSO溶液中的尺寸较小，而在PBS中的尺寸较大，这进一步证明了动态光散射数据的可靠性，验证了探针在PBS中有明显的聚集。随后进一步探究了探针被脂肪酶水解后产物的粒径及Pro-2的粒径，实验结果如图 8b所示。Pro-2在PBS中的平均粒径为754.40 nm，探针被脂肪酶水解后混合物的平均粒径为750.04 nm，这也进一步验证了BTPA被脂肪酶水解后的产物为Pro-2，Pro-2在PBS中形成了新的聚集体，从而发出Pro-2聚集态的荧光。这一实验结果表明，探针BTPA可以选择性检测脂肪酶的主要原因是该探针通过聚集与外界溶液形成了适合于脂肪酶特异性水解的微界面。

  图 8

  

  图 8.  (a) 探针BTPA(10.0 μmol·L^-1)在PBS及DMSO溶液中的粒径分布(插图: BTPA在PBS及DMSO溶液中的TEM图); (b) Pro-2在PBS及DMSO溶液中的粒径分布(上)和BTPA与脂肪酶的混合物在PBS中的粒径分布(下)

  Figure 8.  (a) Particle size distribution of probe BTPA (10.0 μmol·L^-1) in PBS and DMSO solutions (Inset: TEM images of BTPA in PBS and DMSO solutions); (b) Particle size distribution of Pro-2 in PBS and DMSO solutions (top) and the particle size distribution of the mixture of BTPA and lipase in PBS (bottom)

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  2.4   细胞成像

  2.4.1   MTT比色法

  在进行探针BTPA在活体细胞中的脂肪酶特异性成像前，首先利用MTT比色法对该探针的安全性进行了评估。如图 9所示，使用不同浓度的(0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、20.0 μmol·L^-1)探针分别培养细胞10 h后，发现细胞的最低存活率仍高于85.7%。这表明探针BTPA具有良好的生物相容性。

  图 9

  

  图 9.  探针BTPA对HeLa细胞的毒性

  Figure 9.  Toxicity of probe BTPA on HeLa cells

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  2.4.2   细胞的激光共聚焦成像

  为探究探针BTPA能否在细胞中对脂肪酶进行原位成像，采用激光共聚焦成像实验对探针BTPA处理HeLa细胞的结果进行了探究。在细胞的自发荧光未被激发的条件下，以探针BTPA(10.0 μmol·L^-1)处理细胞30 min后，置于显微镜下放大60倍观察细胞质中的荧光(图 10)。如图 10d~10f所示，被探针处理30 min后的细胞在黄色通道中发出强烈的荧光，结果证实了探针BTPA可用于活细胞内脂肪酶荧光成像检测。

  图 10

  

  图 10.  细胞的激光共聚焦成像图: (a~c) 没有任何处理的HeLa细胞; (d~f) 被BTPA处理30 min后的HeLa细胞; (g~i) 被BTPA处理30 min后的MPC5细胞

  Figure 10.  Confocal laser scanning microscopy images of the cells: (a-c) untreated HeLa cells; (d-f) HeLa cells treated with BTPA for 30 min; (g-i) MPC5 cells treated with BTPA for 30 min

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  为探究探针在正常细胞中荧光强度与在肿瘤细胞中的差距，同样以探针BTPA处理正常细胞——小鼠肾足细胞(MPC5)30 min，之后在相同条件下利用激光共聚焦显微镜观察探针在MPC5中的荧光强度，实验结果如图 10g~10i所示，探针处理30 min后的细胞在黄色通道中发出微弱的黄色荧光。实验结果表明，探针可以基本实现在肿瘤细胞中的选择性成像。

  3.   结论

  利用AIE分子易于形成微小界面的特点，构建了一种用于脂肪酶检测“点亮”型的AIE荧光探针BTPA。由于脂肪酶是界面催化的酶，因而探针聚集所形成的微界面可用于特异性激活脂肪酶并被其水解。该探针对脂肪酶的检测表现出选择性高和检出限低的特点。良好的生物相容性更有利于探针在细胞内的原位成像，进一步表明探针可用于脂肪酶的特异性检测。本研究为羧酸脂肪酶检测提供了新的思路，有望促进乳腺癌细胞准确诊断的进展。

  
  
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  Scheme 1  Schematic representation of lipase recognition mechanism utilizing probe BPTA

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  Scheme 2  Synthesis route of probe BTPA

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  图 1  (a) Pro-1在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图; (b) Pro-2在CDCl₃中的¹H NMR谱图

  Figure 1  (a) ¹H NMR spectrum of Pro-1 in DMSO-d₆; (b) ¹H NMR spectrum of Pro-2 in CDCl₃

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  图 2  (a) BTPA在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图; (b) BTPA在DMSO-d₆中的¹³C NMR谱图; (c) BTPA的ESI-MS谱图

  Figure 2  (a) ¹H NMR spectrum of BTPA in DMSO-d₆; (b) ¹³C NMR spectrum of BTPA in DMSO-d₆; (c) ESI-MS spectrum of BTPA

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  图 3  (a) BTPA (10.0 μmol·L^-1)在不同比例的H₂O/DMSO混合物中的荧光光谱; (b) BTPA的I_{450 nm}/I_{409 nm}随H₂O体积分数的变化; (c) Pro-2 (10.0 μmol·L^-1)在不同比例的H₂O/DMSO混合物中的荧光光谱; (d) I_{562 nm}/I_{507 nm}随H₂O体积分数的变化

  Figure 3  (a) Fluorescence spectra of BTPA (10.0 μmol·L^-1) in the H₂O/DMSO mixtures with different proportions; (b) Variation of I_{450 nm}/I_{409 nm} of BTPA with the volume fraction of H₂O; (c) Fluorescence spectra of Pro-2 (10.0 μmol·L^-1) in the H₂O/DMSO mixtures with different proportions; (d) Variation of I_{562 nm}/I_{507 nm} of Pro-2 with the volume fraction of H₂O

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  图 4  (a) 不同活性的PPL存在下, 探针BTPA(10.0 μmol·L^-1)的荧光强度; (b) 557 nm处PPL活性依赖的BTPA荧光强度

  Figure 4  (a) Fluorescence intensities of BTPA (10.0 μmol·L^-1) in the presence of PPL with different activities; (b) Fluorescence intensity of BTPA at 557 nm dependent on PPL activity

  λ_ex=340 nm.

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  图 5  加入不同活性的PPL后, BTPA在557 nm处的荧光强度随时间的变化

  Figure 5  Change in fluorescence intensity of BTPA at 557 nm over time after adding PPL with different activities

  λ_ex=340 nm.

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  图 6  (a) 金属离子/氨基酸/20倍PPL处理BTPA溶液后在557 nm的荧光强度; (b) 金属离子/氨基酸处理BTPA溶液与PPL(10倍)混合物后在557 nm的荧光强度

  Figure 6  (a) Fluorescence intensity at 557 nm after treating BTPA solution with metal ions/amino acids/20-fold PPL; (b) Fluorescence intensity at 557 nm after treating the mixture of BTPA solution and PPL (10-fold) with metal ions/amino acids

  Treatment conditions: 37 ℃, 30 min, c_BTPA=10.0 μmol·L^-1, 20-fold metal ions or amino acids.

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  图 7  (a) PPL处理BTPA后的电喷雾质谱; (b) Pro-2的电喷雾质谱

  Figure 7  (a) ESI-MS spectrum of BTPA after PPL treatment; (b) ESI-MS spectrum of Pro-2

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  图 8  (a) 探针BTPA(10.0 μmol·L^-1)在PBS及DMSO溶液中的粒径分布(插图: BTPA在PBS及DMSO溶液中的TEM图); (b) Pro-2在PBS及DMSO溶液中的粒径分布(上)和BTPA与脂肪酶的混合物在PBS中的粒径分布(下)

  Figure 8  (a) Particle size distribution of probe BTPA (10.0 μmol·L^-1) in PBS and DMSO solutions (Inset: TEM images of BTPA in PBS and DMSO solutions); (b) Particle size distribution of Pro-2 in PBS and DMSO solutions (top) and the particle size distribution of the mixture of BTPA and lipase in PBS (bottom)

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  图 9  探针BTPA对HeLa细胞的毒性

  Figure 9  Toxicity of probe BTPA on HeLa cells

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  图 10  细胞的激光共聚焦成像图: (a~c) 没有任何处理的HeLa细胞; (d~f) 被BTPA处理30 min后的HeLa细胞; (g~i) 被BTPA处理30 min后的MPC5细胞

  Figure 10  Confocal laser scanning microscopy images of the cells: (a-c) untreated HeLa cells; (d-f) HeLa cells treated with BTPA for 30 min; (g-i) MPC5 cells treated with BTPA for 30 min

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