English

• 0.   引言

  以铂类药物为代表的金属药物广泛应用于癌症的治疗研究中^[1]。然而，铂类金属药物具有自身无法克服的先天局限性，如剂量毒性、选择性低、容易产生耐药性等^[2]，为了克服这些缺点，非铂类抗癌金属药物的探索逐渐成为一个研究热点。目前，非铂类抗癌金属药物的研究主要集中在钌、铱、锇、铑等金属配合物^[3]。除此以外，银^[4]和金^[5]配合物的抗癌活性也逐渐引起了人们的关注。与铂类金属药物主要作用于细胞核酸的机制不同，银、金配合物通常通过其他作用模式发挥其生物活性。在细胞膜上，银、金离子可以去除细胞膜中的电子来破坏细胞膜的完整性和渗透性；在细胞内，银、金离子可通过线粒体膜电位的去极化和活性氧(ROS)的过度产生导致线粒体功能障碍，从而诱导细胞死亡^[6]。而且，银、金离子可快速从组织内清除，相对于铂配合物具有较低的生物累积毒性^[7]。此外，在实践中也很少观察到癌细胞对银、金配合物产生耐药性^[8]。鉴于以上这些优点，银、金配合物在癌症治疗上具有重要的研究价值。

  目前，基于银、金配合物抗癌活性的研究主要集中在同核配合物上，关于异核银/金配合物的性质了解仍然较少。异核银/金配合物结合了银和金2种金属的特性，可能带来协同效应。例如，银和金的不同电子结构和化学性质可以互补，从而增强药物的生物活性或选择性；银和金的不同配位环境可以使药物在抗癌过程中的作用机制更加复杂和多样。在本文中，通过菲咯啉官能化的氮杂环卡宾(NHC)配体，分别合成了一个双核氮杂环卡宾银配合物(NHC-Ag₂)和一个异核氮杂环卡宾银/金配合物(NHC-Ag/Au)。杂环官能化的NHC配体容易构建多核金属配合物，这种多核设计有助于优化药物的稳定性、毒性和抗癌效能^[9]。同时，氮杂环卡宾配体较强的配位能力可以提高金属离子在复杂生理环境中的稳定性，从而发挥其药效作用^[10]。在体外细胞实验中，NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au在不同癌细胞系中都表现出了较好的抗癌活性。机制研究表明，NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au主要作用于LoVo细胞的线粒体，引起细胞内ROS增加和线粒体功能障碍，诱导细胞死亡。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  实验所用溶剂、试剂均购于安耐吉试剂公司，线粒体膜电位检测试剂盒、ROS检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术公司，2-(咪唑-1-基)-1，10-菲咯啉按照文献方法合成^[11]。¹H NMR和¹³C NMR使用Bruker Avance-400核磁共振波谱仪测定。元素分析使用Thermo Fisher EA 1112元素分析仪测定。其他仪器包括酶标分析仪(赛默飞世尔Multiskan FC)、倒置光学显微镜(奥林巴斯IX72)、流式细胞仪(贝克曼Cytoflex)。

  1.2   菲咯啉官能化咪唑盐配体((HL)PF₆)的制备

  将2-(咪唑-1-基)-1，10-菲咯啉(492 mg，2.0 mmol)、苄基氯(252 mg，2.0 mmol)置于30 mL乙腈中，加热至回流。反应6 h后，冷却、除去乙腈溶剂，加入50 mL去离子水充分溶解反应瓶中固体物质，过滤，收集滤液。在滤液中滴加饱和六氟磷酸铵水溶液，立即析出大量白色固体。抽滤，收集固体配合物，用去离子水洗涤3次后干燥，得到白色菲咯啉官能化的咪唑盐配体((HL)PF₆) 832 mg，产率86.3%。元素分析理论值(C₂₂H₁₇N₄PF₆，%)：C 54.78，H 3.55，N 11.62；测试值(%)：C 53.90，H 3.51，N 11.60。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 9.92(s，1H)，9.09(d，J=4 Hz，1H)，8.67(d，J=8 Hz，1H)，8.43(d，J=8 Hz，1H)，8.34(s，1H)，8.02~7.96(m，3H)，7.78~7.75(dd，J=8，4 Hz，1H)，7.65(s，1H)，7.52~7.46(m，5H)，5.52(s，CH₂，2H)。¹³C NMR(101 MHz，DMSO)：δ 148.88，146.09，141.86，141.54，140.97, 136.38, 134.86, 130.21, 129.58，129.49，129.46，129.31, 129.05, 128.04, 127.57, 125.29，124.23，120.70，115.59，53.29。

  1.3   双核氮杂环卡宾银配合物的制备

  将菲咯啉官能化咪唑盐配体(HL)PF₆(241 mg，0.5 mmol)、氧化银(60 mg，0.25 mmol)混合于15 mL乙腈溶剂中，加热至50 ℃，避光反应6 h。黑色氧化银粉末基本消失后，溶液用短硅胶柱过滤，收集澄清滤液。将滤液转移至试管中，通过乙醚缓慢挥发重结晶，析出氮杂环卡宾双核银配合物NHC-Ag₂，分离干燥后得白色粉末203 mg，产率69.0%。元素分析理论值(C₄₄H₃₂Ag₂F₁₂N₈P₂，%)：C 44.85，H 2.74，N 9.51；测试值(%)：C 45.11，H 2.65，N 9.40。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 9.16(d，J=8 Hz，2H)，8.77(d，J=8 Hz, 2H), 8.51~8.32(m，10H)，7.87~7.80(m，4H)，6.69~6.62(m，6H)，6.37(s，4H)，5.14(s，4H)。¹³C NMR(101 MHz，DMSO-d₆)：δ 181.54(Ag—C)，151.77，149.90，142.51, 141.94, 141.30, 139.47, 136.21，130.24，129.44，128.18, 128.04, 127.85, 127.72, 127.40，125.41，124.69，123.01，120.46，55.20。

  1.4   异核氮杂环卡宾银/金配合物的制备

  将菲咯啉官能化咪唑盐配体(HL)PF₆(241 mg，0.5 mmol)、氧化银(60 mg，0.25 mmol)混合于15 mL乙腈溶剂中，加热至50 ℃，避光反应6 h后加入Au(Et₂S)Cl(89 mg，0.25 mmol)，继续室温搅拌2 h。反应结束后，溶液离心，用短硅胶柱过滤后收集澄清滤液。将滤液转移至试管中，通过乙醚重结晶析出异核银/金配合物NHC-Ag/Au，分离干燥后得到白色粉末193 mg，产率60.1%。元素分析理论值(C₄₄H₃₂AgAuF₁₂N₈P₂，%)：C 41.69，H 2.54，N 8.84；测试值(%)：C 41.11，H 2.59，N 8.90。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 9.17(d，J=8 Hz，2H)，8.81(d，J=8 Hz，2H)，8.67(d，J=4 Hz，2H)，8.49~8.43(m，6H)，8.39~8.36(m，2H)，7.97(s，2H)，7.86(q，J=4 Hz，2H)，6.65(d，J=8 Hz，4H)，6.51(t，J=8 Hz，2H)，6.16(t，J=8 Hz，4H)，5.28(d，J=48 Hz，4H)。¹³C NMR(101 MHz，DMSO-d₆)：182.03(Au—C), 152.17, 149.25, 142.58, 141.98, 141.22, 139.53，136.09, 130.46, 129.71, 128.42, 127.65，127.51，127.19，125.53，124.75，123.51，120.70，55.33。

  1.5   体外细胞毒性MTT(噻唑蓝)比色法测试

  在96孔板中以每孔4 000~5 000个的密度加入测试细胞，并在5%(体积分数)二氧化碳培养箱中37 ℃孵化过夜，细胞贴壁。将待测药物倍比稀释于1640培养基(10%胎牛血清)中，加入孔板，37 ℃继续孵化48 h。药物作用结束后，每孔加入30 μL MTT的磷酸盐缓冲液(PBS，5 mg·L^-1)，然后在培养箱中放置4 h。待MMT与活细胞产生紫色结晶，除去培养基，加入100 μL的DMSO溶液溶解，使用酶标分析仪测定溶液在490 nm的吸光度，计算药物在各细胞系中的IC₅₀值(半抑制浓度)。

  1.6   细胞凋亡测试

  在6孔板中以每孔10⁶个的密度加入LoVo细胞，在培养箱中孵化过夜使细胞贴壁。然后，加入含有NHC-Ag₂或NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)的培养基中继续孵化24 h。药物作用结束，收集细胞，使用Alexa Fluor 488 annexin V/PI apoptosis(PI：碘化丙啶)染色并在流式细胞仪上检测，使用Flowjo软件分析测试结果。

  1.7   线粒体膜电位测试

  在6孔板中以每孔2×10⁵个的密度加入LoVo细胞，在培养箱中孵化过夜使细胞贴壁。然后，加入含有NHC-Ag₂或NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)的培养基中继续孵化12 h。接着在每孔中加入5 μL的线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)继续孵化30 min。收集细胞，在流式细胞仪上检测，使用Flowjo软件分析测试结果。同时，采用倒置荧光显微镜拍照。

  1.8   细胞内ROS测试

  在6孔板中以每孔2×10⁵个的密度加入LoVo细胞，在培养箱中孵化过夜使细胞贴壁。然后，加入含有NHC-Ag₂或NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)的培养基中继续孵化6 h。收集细胞，将细胞重悬于1 mL含5 μmol·L^-1荧光指示剂(DCFH-DA，2，7-二氯荧光素二乙酸酯)的1640培养液中，37 ℃孵化20 min。离心收集细胞，用PBS洗2次后在流式细胞仪上检测，使用Flowjo软件分析结果。

  1.9   晶体结构解析

  从上述制备的晶体中选取大小适合的NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的单晶进行X射线单晶衍射测试。待测晶体使用Bruker SMART CCD X射线单晶衍射仪在室温下测定，利用Mo靶(Kα，λ=0.071 073 nm)进行X射线检测和数据收集，使用SADABS对所有数据进行吸附校正，采用SHELXTL软件对晶体结构进行解析以及理论加氢，采用最小二乘法精修。NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的主要晶体学数据列于表 1。

  表 1

  

  表 1  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的晶体学数据

  Table 1.  Crystal data of NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au

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  Parameter	NHC-Ag2·CH3CN	NHC-Ag/Au
  Formula	C46H35Ag2F12N9P2	C44H32AgAuF12N8P2
  Formula weight	1 219.51	1 267.55
  Crystal system	Monoclinic	Monoclinic
  Space group	P21/c	P21/c
  a / nm	1.882 4(3)	1.852 47(12)
  b / nm	2.200 9(3)	2.169 03(14)
  c / nm	1.169 70(17)	1.184 20(8)
  β / (°)	102.589(2)	101.735 0(10)
  V / nm3	4.729 4(12)	4.658 7(5)
  Z	4	4
  Dc / (Mg·m-3)	1.713	1.807
  Reflection collected	23 537	23 510
  Independent reflection, Rint	8 306, 0.036 4	8 190, 0.048 7
  Goodness-of-fit on F 2	1.176	1.087
  R1, wR2 [I > 2σ(I)]	0.062 9, 0.151 5	0.043 5, 0.111 8
  R1, wR2 (all data)	0.086 0, 0.171 4	0.077 6, 0.138 7

  2.   结果与讨论

  2.1   配合物的制备与表征

  杂环官能化咪唑盐已广泛用于构建氮杂环卡宾金属配合物^[11]。如图 1所示，2-(咪唑-1-基)-1，10-菲咯啉与苄基氯反应生成盐后在水溶液中进行阴离子交换反应，简便地制备了菲咯啉官能化咪唑盐(HL)PF₆。然后，将(HL)PF₆与Ag₂O在乙腈溶剂中反应，得到了双核氮杂环卡宾银配合物NHC-Ag₂。在双核NHC-Ag₂的乙腈溶剂中，再加入Au(Et₂S)Cl，金属交换后得到了异核氮杂环卡宾银/金配合物NHC-Ag/Au。通过核磁共振和元素分析分别对(HL)PF₆、NHC-Ag₂、NHC-Ag/Au进行表征。在(HL)PF₆的¹H NMR中，咪唑盐C2位酸性特征峰出现在δ=9.92处，说明咪唑盐配体已经形成。菲咯啉杂环、咪唑环和苄基的质子信号出现在δ=9.09~7.46范围内，符合(HL)PF₆的分子结构。在NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的¹H NMR谱图(Supporting information)中，咪唑C2位氢质子信号消失，说明咪唑盐脱质子后形成了卡宾配体并与金属配位。除此之外，菲咯啉杂环、咪唑环和苄基的共振信号位移与前体咪唑盐(HL)PF₆相似。在NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的 ¹³C NMR谱图中，卡宾Ag—C、Au—C共振信号分别出现在δ=181和182处，这与文献报道的Ag和Au氮杂环卡宾配合物类似^[12]。

  图 1

  

  图 1.  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的合成路线

  Figure 1.  Synthetic route of NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au

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  通过X射线单晶衍射对双核NHC-Ag₂和异核NHC-Ag/Au的结构进行了进一步的表征，晶体学数据见表 1。同核NHC-Ag₂的阳离子结构如图 2所示，2个中心Ag(Ⅰ)离子以不同的方式与2个菲咯啉官能化的氮杂环卡宾配体配位。Ag1离子以直线型方式与2个卡宾配体的C原子配位，C—Ag—C键角为172.5°，2个Ag—C键长分别为0.209 2和0.209 4 nm。Ag2离子以四面体构型与2个菲咯啉的4个N原子配位，4个Ag—N键长分别为0.221 9、0.226 0、0.243 8和0.245 7 nm。异核NHC-Ag/Au的阳离子结构如图 3所示，分子中包含2个菲咯啉官能化的氮杂环卡宾配体，即一个Ag(Ⅰ)离子和一个Au(Ⅰ)离子。与NHC-Ag₂相似，在NHC-Ag/Au中Ag(Ⅰ)离子以扭曲四面体构型与4个菲咯啉的4个N原子配位，Au(Ⅰ)以直线型方式与2个卡宾C原子配位，C—Au—C的键角为176.2°，2个Au—C键长分别为0.200 7和0.201 8 nm。此外，在NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au中Ag—Ag、Ag—Au键长分别为0.282 9和0.284 9 nm，表明这2个金属配合物中都存在弱的金属-金属相互作用^[13]。

  图 2

  

  图 2.  配合物NHC-Ag₂椭球率50%的晶体结构图

  Figure 2.  Crystal structure of NHC-Ag₂ with 50% ellipsoid probability

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  图 3

  

  图 3.  配合物NHC-Ag/Au椭球率50%的晶体结构

  Figure 3.  Crystal structure of NHC-Ag/Au with 50% ellipsoid probability

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  2.2   体外细胞毒性

  以临床使用的顺铂(cis-Pt)药物作为参照，采用MTT比色法分别评估了同核NHC-Ag₂、异核NHC-Ag/Au及咪唑盐(HL)PF₆在LoVo、Hela、A2780和A549四种癌细胞和人静脉内皮细胞HUVEC中的体外细胞毒性。如表 2和图 4所示，咪唑盐配体(HL)PF₆在这4种癌细胞中只表现出了很小的抗癌活性，IC₅₀值均在45 μmol·L^-1以上。与(HL)PF₆相比，双核NHC-Ag₂和异核NHC-Ag/Au在所有测试的细胞系中都表现出了相当或优于顺铂的体外抗癌活性。如在结肠癌细胞LoVo中，NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的IC₅₀值分别为(5.6±0.3) μmol·L^-1和(6.4±0.4) μmol·L^-1，小于顺铂的IC₅₀值。另外，NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au在HUVEC中的IC₅₀值分别为(19.2±0.8) μmol·L^-1和(20.5±1.3) μmol·L^-1，接近于癌细胞中的3倍，这表明这2个金属配合物对癌细胞具有一定的选择性毒性。

  表 2

  

  表 2  药物作用48 h后NHC-Ag₂、NHC-Ag/Au、顺铂和(HL)PF₆在四种癌细胞和HUVEC中的IC₅₀值

  Table 2.  IC₅₀ values of NHC-Ag₂, NHC-Ag/Au, cis-Pt, and (HL)PF₆ against four types of cancer cell lines and HUVEC after 48 h of drug exposure μmol·L^-1

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  Sample	LoVo	Hela	A2780	A549	HUVEC
  NHC-Ag2	5.6±0.3	6.2±0.4	6.5±0.4	6.1±0.4	19.2±0.8
  NHC-Ag/Au	6.4±0.4	7.6±0.6	7.7±0.4	6.5±0.3	20.5±1.1
  cis-Pt	7.7±0.4	9.0±0.6	9.3±0.5	8.2±0.5	21.9±1.5
  (HL)PF6	45.2±3.2	61.0±6.9	50.4±4.6	68.6±6.3	> 100

  图 4

  

  图 4.  NHC-Ag₂、NHC-Ag/Au、顺铂和(HL)PF₆在LoVo、Hela、A2780、A549细胞和HUVEC中的体外细胞毒性

  Figure 4.  In vitro cytotoxic activities of NHC-Ag₂, NHC-Ag/Au, cis-Pt, and (HL)PF₆ in LoVo, Hela, A2780, A549 cells, and HUVEC

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  2.3   机制研究

  在被癌细胞摄取后，同核NHC-Ag₂和异核NHC-Ag/Au的阳离子可能部分与带负电的线粒体相互作用，使线粒体膜电位去极化，从而导致线粒体功能失调^[14]。为了确认这一过程，使用JC-1研究了在这2种金属配合物作用下LoVo细胞中线粒体膜电位的变化。如图 5a所示，正常LoVo细胞线粒体基质被JC-1标记后显示为橙色发射的聚集体。NHC-Ag₂、NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)孵化12 h后，LoVo细胞内绿色荧光增加，橙色荧光减少，这说明LoVo细胞的线粒体膜电位已经被金属配合物破坏，JC-1染料无法在线粒体基质中聚集，只能发出绿色荧光。通过流式细胞仪分析(图 5b)可知，正常LoVo细胞的绿色荧光比例只有3.24%，NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)孵化12 h后的LoVo细胞绿色荧光比例分别增加至36.9%和40.2%。

  图 5

  

  图 5.  NHC-Ag₂或NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1)孵化12 h后(a) LoVo细胞的JC-1染色的荧光显微镜图像以及(b) LoVo细胞中绿色荧光含量

  Figure 5.  (a) Fluorescence microscopy images of JC-1 staining and (b) green fluorescence content of LoVo cells after being treated with NHC-Ag₂ or NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1) for 12 h

  FITC-A (green fluorescent, FITC=fluorescein isothiocyanate), PE-A (orange fluorescent, PE=phycoerythrin).

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  线粒体是有氧呼吸和能量产生的主要细胞器。在线粒体功能失调的情况下，电子将从线粒体呼吸链泄漏出来，并在线粒体呼吸过程中产生过多的ROS^[15]。荧光指示剂DCFH-DA(2，7-二氯荧光素二乙酸酯)可以用来评估LoVo细胞中ROS的产生。DCFH-DA被细胞酯酶水解后，在ROS存在的情况下氧化生成绿色荧光的DCF(2，7-二氯荧光素)^[16]。绿色荧光强度与细胞中ROS的水平成正比。如图 6a和6b所示，流式细胞仪分析显示未经处理的LoVo细胞中的ROS平均含量为9.52%。当LoVo细胞用NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)分别孵化6 h后，LoVo细胞中ROS的平均含量显著增加到了63.72%和66.56%。ROS的过度产生也表明了LoVo细胞中线粒体膜电位的破坏。

  图 6

  

  图 6.  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)孵化6 h后(a) LoVo细胞中ROS的变化和(b) LoVo细胞中ROS含量

  Figure 6.  (a) Changes in ROS in LoVo cells and (b) ROS content in LoVo cells after incubating with NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1) for 6 h

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  细胞内线粒体膜电位的破坏和ROS过量增加往往会导致细胞质膜发生变化，最终引起细胞死亡。首先通过显微镜对LoVo细胞在药物作用前后的形态进行了观察。如图 7所示，LoVo活细胞显示出正常的梭形结构。NHC-Ag₂(4 μmol·L^-1)处理24 h后，大多数LoVo细胞浓缩成圆形，并且导致细胞失去质膜的完整性，这通常是细胞坏死的标志。然而在相同浓度NHC-Ag/Au作用下，部分LoVo细胞膨胀成圆形，出现细胞胀亡标志。显然，异核的NHC-Ag/Au配合物在LoVo细胞中产生了复合的作用机制，这可能带来协同效应。采用细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI)进一步分析了LoVo细胞的死亡方式。如图 8a和8b所示，流式分析显示正常LoVo细胞中，晚期凋亡细胞和早期凋亡细胞分别只占1.71%和4.30%。经NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)孵化24 h后，LoVo晚期凋亡细胞率分别增加到23.2%和25.0%，早期凋亡细胞率分别增加到5.8%和9.1%。相比之下，晚期凋亡细胞数量远多于早期凋亡细胞数量，这说明在NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的作用下，LoVo细胞膜通透性增加，核酸染料(PI)进入了细胞内并与核酸结合，细胞膜通透性的增加往往引起细胞坏死^[17]。蛋白质印迹(Western blot)分析进一步验证了NHC-Ag/Au通过非凋亡途径引起细胞死亡。如图 8c所示，经顺铂(4 μmol·L^-1)24 h孵化后，LoVo细胞凋亡相关蛋白(裂解型胱天蛋白酶3，c-caspase 3)的表达显著增加。然而，在相同浓度的NHC-Ag/Au处理后，c-caspase 3的表达仅有轻微增加。这表明，NHC-Ag/Au的细胞毒性作用主要通过非凋亡途径实现。

  图 7

  

  图 7.  药物作用24 h后LoVo细胞形态的变化

  Figure 7.  Changes in the morphology of LoVo cells after drug treatment for 24 h

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  图 8

  

  图 8.  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)作用24 h后(a) LoVo细胞流式凋亡分析和(b) LoVo细胞早凋亡、晚凋亡统计; (c) NHC-Ag/Au和顺铂(4 μmol·L^-1)孵育24 h后LoVo细胞中凋亡相关蛋白c-caspase 3的表达

  Figure 8.  (a) Apoptosis analysis by flow cytometry of LoVo cells and (b) statistics of early and late apoptosis in LoVo cells after treated with NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1) for 24 h; (c) Expression of the apoptosis-related protein c-caspase 3 in LoVo cells after treated with NHC-Ag/Au and cis-Pt (4 μmol·L^-1) for 24 h

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  3.   结论

  我们合成并表征了菲咯啉官能化咪唑盐配体及其相应的双核NHC-银配合物(NHC-Ag₂)和异核NHC-银/金双金属配合物(NHC-Ag/Au)。通过X射线衍射分析确认了NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au配合物的晶体结构，2个金属中心原子分别呈四面体和直线型构型。体外抗癌活性研究表明，NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au在LoVo、Hela、A2780和A549四种癌细胞中均表现出了较强的抗癌活性。在LoVo细胞中的机制研究表明，NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au主要作用于细胞内线粒体，引起细胞内线粒体膜电位变化和ROS过量产生，最终导致LoVo细胞膜通透性增加，引起细胞死亡。

  
  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn
  
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  图 1  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的合成路线

  Figure 1  Synthetic route of NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au

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  图 2  配合物NHC-Ag₂椭球率50%的晶体结构图

  Figure 2  Crystal structure of NHC-Ag₂ with 50% ellipsoid probability

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  图 3  配合物NHC-Ag/Au椭球率50%的晶体结构

  Figure 3  Crystal structure of NHC-Ag/Au with 50% ellipsoid probability

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  图 4  NHC-Ag₂、NHC-Ag/Au、顺铂和(HL)PF₆在LoVo、Hela、A2780、A549细胞和HUVEC中的体外细胞毒性

  Figure 4  In vitro cytotoxic activities of NHC-Ag₂, NHC-Ag/Au, cis-Pt, and (HL)PF₆ in LoVo, Hela, A2780, A549 cells, and HUVEC

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  图 5  NHC-Ag₂或NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1)孵化12 h后(a) LoVo细胞的JC-1染色的荧光显微镜图像以及(b) LoVo细胞中绿色荧光含量

  Figure 5  (a) Fluorescence microscopy images of JC-1 staining and (b) green fluorescence content of LoVo cells after being treated with NHC-Ag₂ or NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1) for 12 h

  FITC-A (green fluorescent, FITC=fluorescein isothiocyanate), PE-A (orange fluorescent, PE=phycoerythrin).

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  图 6  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)孵化6 h后(a) LoVo细胞中ROS的变化和(b) LoVo细胞中ROS含量

  Figure 6  (a) Changes in ROS in LoVo cells and (b) ROS content in LoVo cells after incubating with NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1) for 6 h

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  图 7  药物作用24 h后LoVo细胞形态的变化

  Figure 7  Changes in the morphology of LoVo cells after drug treatment for 24 h

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  图 8  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au(4 μmol·L^-1)作用24 h后(a) LoVo细胞流式凋亡分析和(b) LoVo细胞早凋亡、晚凋亡统计; (c) NHC-Ag/Au和顺铂(4 μmol·L^-1)孵育24 h后LoVo细胞中凋亡相关蛋白c-caspase 3的表达

  Figure 8  (a) Apoptosis analysis by flow cytometry of LoVo cells and (b) statistics of early and late apoptosis in LoVo cells after treated with NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au (4 μmol·L^-1) for 24 h; (c) Expression of the apoptosis-related protein c-caspase 3 in LoVo cells after treated with NHC-Ag/Au and cis-Pt (4 μmol·L^-1) for 24 h

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  表 1  NHC-Ag₂和NHC-Ag/Au的晶体学数据

  Table 1.  Crystal data of NHC-Ag₂ and NHC-Ag/Au

  Parameter	NHC-Ag2·CH3CN	NHC-Ag/Au
  Formula	C46H35Ag2F12N9P2	C44H32AgAuF12N8P2
  Formula weight	1 219.51	1 267.55
  Crystal system	Monoclinic	Monoclinic
  Space group	P21/c	P21/c
  a / nm	1.882 4(3)	1.852 47(12)
  b / nm	2.200 9(3)	2.169 03(14)
  c / nm	1.169 70(17)	1.184 20(8)
  β / (°)	102.589(2)	101.735 0(10)
  V / nm3	4.729 4(12)	4.658 7(5)
  Z	4	4
  Dc / (Mg·m-3)	1.713	1.807
  Reflection collected	23 537	23 510
  Independent reflection, Rint	8 306, 0.036 4	8 190, 0.048 7
  Goodness-of-fit on F 2	1.176	1.087
  R1, wR2 [I > 2σ(I)]	0.062 9, 0.151 5	0.043 5, 0.111 8
  R1, wR2 (all data)	0.086 0, 0.171 4	0.077 6, 0.138 7

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  表 2  药物作用48 h后NHC-Ag₂、NHC-Ag/Au、顺铂和(HL)PF₆在四种癌细胞和HUVEC中的IC₅₀值

  Table 2.  IC₅₀ values of NHC-Ag₂, NHC-Ag/Au, cis-Pt, and (HL)PF₆ against four types of cancer cell lines and HUVEC after 48 h of drug exposure μmol·L^-1

  Sample	LoVo	Hela	A2780	A549	HUVEC
  NHC-Ag2	5.6±0.3	6.2±0.4	6.5±0.4	6.1±0.4	19.2±0.8
  NHC-Ag/Au	6.4±0.4	7.6±0.6	7.7±0.4	6.5±0.3	20.5±1.1
  cis-Pt	7.7±0.4	9.0±0.6	9.3±0.5	8.2±0.5	21.9±1.5
  (HL)PF6	45.2±3.2	61.0±6.9	50.4±4.6	68.6±6.3	> 100

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