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• 疫苗作为最强有力的技术平台，极大地降低了传染性病毒在世界范围内的传播率和致死率^[1]。其中，佐剂作为疫苗中不可或缺的关键成分，其开发备受人们的关注^[2]。铝盐佐剂最早被美国食品药品监督管理局(FDA)批准使用并沿用至今。然而传统铝盐佐剂也面临着诸多问题，如抗原吸附能力低、细胞免疫能力弱等缺点^[3]。为了解决此类问题，许多新型纳米佐剂被研制和开发^[4]。纳米颗粒在维度上与微生物相当，能够更好地被抗原递呈细胞(APCs)吞噬，把抗原更多地带入到细胞中，从而使抗原诱导免疫响应^[5]。大量的研究表明，纳米粒子的组成结构、形貌、表面电荷和尺寸等在疫苗递送和免疫应答过程中起着十分重要的作用^[6-8]。

  氧化石墨烯量子点(GOQDs)作为一种新型零维碳材料在生物药学领域应用广泛，其尺寸在1~10 nm之间，富含羟基、羰基和羧基等官能团^[9]，且具有良好的生物相容性等特点^[10]。Zhao等^[11]合成了两性离子型石墨烯量子点(GQDs)并形成稳定的pH响应Pickering乳液。Huang等^[12]将GOQDs与肌肽、雷喹莫特和Zn²⁺离子复合，构建了H1N1流感疫苗，显著增强了疫苗抗病毒效价。Qin等^[13]发现石墨烯量子点(GQDs) 能通过p38蛋白/丝裂原活化蛋白激酶(p38/MAPK)和核因子-κB(NF-κB)介导的信号通路，将人髓系白血病单核细胞(THP-1)激活成巨噬细胞并诱导活性氧自由基(ROS)的产生、细胞凋亡、自噬和炎症反应。Du等^[14]利用聚乙二醇(PEG)和维生素C混合制备GQDs，发现可以通过激活Ⅰ型干扰素达到抑制病毒增殖能力的目的。大量文献证明，合成方法的不同会导致GQDs的组成、结构、表面积和水溶性的不同，从而导致其理化性质以及生物活性度的不同^[15-16]。

  基于此，我们利用鳞片石墨作原料，采用改进的Hummers法^[17]获得GOQDs。反应过程中，通过增加搅拌速度来增强剪切力、调高反应温度并同时延长反应时间提高氧化程度，获得尺度更小、含羟基和羧酸基更多的GOQDs。所得的GOQDs经过一系列表征，确定其表面含有富氧功能团，尺寸约2.55 nm，可以长期在水相中维持高度分散的悬浮液状态。采用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)作为模式抗原，直接将GOQDs水溶液与OVA简单混合，制备了GOQDs/OVA纳米疫苗。研究结果表明，GOQDs可以负载大量的OVA并通过pH响应能力缓释OVA，具有良好的生物相容性，并能促进细胞摄入OVA。在清洁级(ICR)雌性小鼠体内考察GOQDs/OVA纳米疫苗的免疫效价，研究结果表明，GOQDs能激活髓样分化因子88(MyD88)/NF-κB信号通路，促进大量炎症细胞因子的分泌，显著提高特异性免疫球蛋白G(IgG)抗体水平，并且趋向于辅助性细胞免疫(Th1)应答，可用于抗病毒和抗感染疫苗佐剂。

  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  雌性6~8周龄ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心。小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)(美国菌种保藏中心，ATCC)购自南京卡柏欧生物科技有限公司。1% 红细胞(RBCs)源于无特定病原(SPF)鸡。所有动物实验在中国动物保护委员会的指导方针政策和江苏省农业科学院动物福利委员会规定的原则指导下进行，其动物使用许可证号为No. SYXK (Jiangsu) 2020—0024。

  实验所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。300目鳞片石墨粉、硝酸钠、高锰酸钾、硫酸(98%)、硝酸(68%)、盐酸(37%)、双氧水(30%)等均购自国药集团化学试剂有限公司；OVA购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；OVA-fluorescein isothiocya-nate(OVA-FITC)、2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自兰杰柯生物科技有限公司；细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)、鼠抗β肌动蛋白(β-actin)抗体、鼠抗NF-κB p65抗体购自碧云天生物科技有限公司；细胞/组织总核糖核酸(RNA)提取及实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测试剂盒购于诺唯赞生物科技股份有限公司；抗小鼠CD3-FITC、CD4-allophycocyanin(CD4-APC)、CD8-phycoerythrin(CD8a-PE)流式抗体购于伊莱瑞特(武汉)生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体购自华安生物科技有限公司；HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；兔抗MyD88抗体购自贝朗新创(北京)生物科技有限公司；鼠抗磷酸化NF-κB p65(p-p65)抗体购自亲科生物研究中心有限公司；所有引物设计来自北京擎科生物科技有限公司。

  使用透射电子显微镜(TEM，JOEL JEM-2100F) 观测样品的形貌及尺寸大小，工作电压为200 kV。用X射线衍射仪(XRD，Bruker AXS D8 Advance)对GOQDs晶体结构进行表征用X射线衍射仪(XRD, Bruker AXS D8 Advance)对GOQDs晶体结构进行表征，Cu Kα射线，λ=0.154 18 nm，2θ=5°~50°，工作电压和工作电流分别为40 kV和40 mA，扫描速率为3 (°)·min^-1。用激光共聚焦拉曼(Raman) 光谱(inVia-Reflex，Renishaw公司)表征GOQDs的D峰和G峰，激光波长为488 nm。采用ALPHA红外光谱仪(布鲁克公司)获得样品的红外(IR)光谱，扫描范围为500~4 000 cm^-1。为了验证GOQDs及GOQDs/OVA纳米疫苗的长期稳定性，使用纳米粒度电位仪(Zeta-sizer Nano ZSE，英国马尔文帕纳科公司)进行ζ电位、水合粒径及多分散系数(PDI)检测。疫苗的理化性质及免疫研究利用全波长酶标仪(Epoch，美国伯乐公司)、流式细胞仪(AccuriC6 Plus，美国BD公司)、光学显微镜(DP73，日本奥林巴斯公司)、实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480 Ⅱ，瑞士罗氏公司)及化学发光成像仪(Tanon5200，上海天能)检测。

  1.2   GOQDs的制备及表征

  根据改进的Hummer’s法制备GOQDs。在三颈烧瓶中加入115 mL浓硫酸，在冰浴条件下加入5 g鳞片石墨和2.5 g硝酸钾磁力搅拌30 min(转速700 r·min^-1)；随后分批加入15 g高锰酸钾，继续反应30 min后缓慢升温至45 ℃后反应4 h；继续缓慢加入250 mL去离子水，升温至98 ℃维持1.5 h，再加入700 mL去离子水和30 mL 30% 双氧水；反应2 h后，冷却、静置、离心、洗涤并冷冻干燥得到褐色固体产物GOQDs。利用TEM、XRD及IR检测其理化性质。

  1.3   GOQDs/OVA疫苗的配制及稳定性评估

  直接将GOQDs与OVA进行简单混合便可配制成疫苗(表 1)。具体方法如下：分别配制1 mg·mL^-1的GOQDs磷酸盐缓冲液(PBS)和OVA的PBS。随后将二者以相应的质量比混合，使其GOQDs最终免疫质量分别为50 μg (GOQDs/OVA-L，低剂量)、100 μg (GOQDs/OVA-M，中剂量)、150 μg (GOQDs/OVA-H，高剂量)，其中OVA质量为50 μg。

  表 1

  

  表 1  GOQDs/OVA纳米疫苗的配制方式及免疫途径

  Table 1.  Preparation methods and immunization pathways of GOQDs/OVA nano-vaccine

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  Group	mGOQDs/μg	mOVA/μg	VPBS/μL	VDosage/μL	Immunization pathway
  Control			200	200	s.c. injection
  OVA		50	150	200	s.c. injection
  GOQDs/OVA-L	50	50	100	200	s.c. injection
  GOQDs/OVA-M	100	50	50	200	s.c. injection
  GOQDs/OVA-H	150	50		200	s.c. injection
  *s.c. represent subcutaneous.

  使用马尔文纳米粒度仪测定GOQDs/OVA疫苗在不同条件(如温度)下储存期的ζ电位、水合粒径和PDI，并观察其外观变化。

  1.4   安全性评价

  1.4.1   体外安全性评价

  细胞毒性检测：分别将RAW264.7、小鼠原代脾细胞、小鼠原代骨髓来源树突状细胞(BMDCs)以每孔2×10⁵个的密度接种至96孔板并培养24 h。随后，以细胞换液的形式分别加入不同浓度的GOQDs的达尔伯克必需基本培养基(DMEM)与细胞共同孵育24 h后，弃去培养基，向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液和90 μL不含血清的培养基，继续孵育2 h。最后，通过酶标仪测定450 nm处的吸光度。细胞活力(cell viability，R_cv)按以下公式计算：

  $ R_{\mathrm{cv}}=\frac{A_{\mathrm{s}}-A_{\mathrm{b}}}{A_{\mathrm{c}}-A_{\mathrm{b}}} \times 100 \% $

  其中，A_s代表含有细胞、培养基和样品的孔的吸光度，A_b代表不含细胞的孔的吸光度，A_c代表仅含有细胞和培养基的孔的吸光度。

  溶血实验：采集SPF鸡血，分离RBCs。将1 mL RBCs加入99 mL PBS溶液中制备成体积分数1% 的RBCs悬浮液。将等体积的1% RBCs悬浮液与GOQDs/OVA-L、GOQDs/OVA-M和GOQDs/OVA-H疫苗混合振荡30 s，放置在37 ℃恒温箱中2 h。随后，在1 000 r·min^-1离心10 min。使用酶标仪在300~700 nm波段对上清液进行扫描。同时，用PBS将重悬RBCs重新制备成悬浮液后制作血涂片，光学显微镜下观察RBCs形态是否发生改变。此外，分别用去离子水和PBS作为阳性对照和阴性对照。溶血率(HR)利用以下公式计算：

  $ \mathrm{HR}=\frac{A_{\mathrm{s}}-A_{\mathrm{n}}}{A_{\mathrm{p}}-A_{\mathrm{n}}} \times 100 \% $

  其中，A_s代表RBCs和样品作用后的上清液的吸光度，A_n代表RBCs和PBS作用后的上清液的吸光度，A_p代表RBCs和纯水作用后的上清液的吸光度。

  1.4.2   体内安全性评价

  按照每只200 μL的注射剂量分别对小鼠(n=3)进行皮下接种GOQDs的PBS(1 mg·mL^-1)及GOQDs/OVA-H疫苗。以仅免疫PBS的小鼠作为阴性对照，定时监测小鼠饮食、睡眠及精神状态。28 d后，利用眼眶静脉丛采血方法获取全血，分离血清，进行血生化检测，分析天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素氮(BUN)指标的变化情况。随后安乐死处死小鼠，取出GOQDs/OVA-H组和空白组小鼠的心、肝、脾等主要脏器于4% 多聚甲醛(PFA)溶液中固定后，制作石蜡切片，进行苏木精-伊红(H&E)染色，光学显微镜下观察组织学变化。

  1.5   GOQDs对OVA的吸附和释放能力

  分别配制100 μg·mL^-1~2 mg·mL^-1的GOQDs和OVA的PBS，分别取1 mL的GOQDs和OVA的PBS按照表 2根据不同的质量比等体积充分混匀，在常温环境中静置1 h后，以12 000 r·min^-1离心10 min，取20 μL上清液，使用BCA蛋白测定试剂盒检测上清液中剩余的OVA含量，并计算其OVA蛋白吸附率。

  表 2

  

  表 2  不同结合比例下GOQDs与OVA的用量

  Table 2.  Dosages of GOQDs and OVA in different combination ratios

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  mOVA:mGOQDs	ρOVA/(μg·mL-1)	ρGOQDs/(μg·mL-1)
  20:1	2 000	100
  10:1	1 000	100
  9:1	900	100
  8:1	800	100
  7:1	700	100
  6:1	600	100
  5:1	500	100
  4:1	400	100
  3:1	300	100
  2:1	200	100
  1:1	100	100
  1:2	100	200
  1:3	100	300
  1:4	100	400
  1:5	100	500
  1:6	100	600
  1:7	100	700
  1:8	100	800
  1:9	100	900
  1:10	100	1 000

  筛选出完全吸附的GOQDs/OVA悬浮液(OVA与GOQDs的质量比为2∶1，如无特别指出，后文均指该比例对应的疫苗)并离心去除上清液；随后，分别取2 mL pH=7.4和5.5的PBS重悬，涡旋振荡2 min后，置于摇床中37 ℃、100 r·min^-1下恒温振荡。定期取上清液，利用BCA蛋白测定试剂盒检测上清液中OVA含量，计算其释放量。

  另外，利用12.5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)再次检测不同OVA与GOQDs质量比的混合物的吸附及释放能力。

  1.6   GOQDs增强细胞对抗原的吞噬能力

  将RAW264.7细胞以每孔1×10⁶个的密度接种至24孔板中培养24 h，弃去原有培养基，添加培养基作为空白对照(MOCK，阴性对照)、纯抗原组(OVA-FITC，阳性对照)和GOQDs/OVA-FITC组，继续孵育24 h后用PBS洗涤2次，最后用1.5 mL离心管收集并利用流式细胞术(FACS)检测细胞对抗原的摄取情况。

  同样将RAW264.7细胞接种至共聚焦小皿中，按照相同培养方式孵育细胞，弃去培养基并用PBS洗涤2次，用4% PFA固定10 min并用PBS清洗2次，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI，细胞核染料)避光染色15 min，用PBS清洗2次，在激光共聚焦荧光显微镜(CLSM)下观察抗原的摄入情况。

  1.7   体内动物免疫水平评价

  1.7.1   小鼠免疫方案

  将25只小鼠随机分成5组，每组5只，根据表 2对小鼠进行皮下注射。如图 1所示，在免疫后第14 d对各组小鼠进行加强免疫，同时在免疫后第14、28 d，利用眼眶静脉丛采血方法获取全血，分离血清，保存备用。

  图 1

  

  图 1.  小鼠免疫方案

  Figure 1.  Immunization protocol of mice

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  1.7.2   小鼠血清抗体及抗体亚型水平测定

  采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中OVA特异性IgG(14、28 d)、IgG1(28 d)、IgG2a(28 d)的抗体效价水平。向96孔板内每孔加入100 μL用PBS稀释的浓度为1 μg·mL^-1的OVA抗原，4 ℃下过夜包被。使用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗板3次，拍干，加入100 μL的1% 牛血清蛋白(BSA)封闭液，37 ℃下封闭2 h。洗板3次，拍干，加入待测血清用PBST以1∶100的体积稀释比加入孔内后进行倍比稀释，同时设立阴性对照、阳性对照，37 ℃下孵育1 h。洗板3次，拍干，分别加入100 μL HRP标记羊抗鼠IgG(稀释比1∶20 000，采用PBST溶液进行稀释，下同)、IgG1(1∶20 000)、IgG2a(1∶20 000) 抗体，37 ℃下孵育1 h。洗板3次，拍干，每孔加入50 μL四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，避光显色15 min后加入50 μL终止液(2% 硫酸溶液)。通过酶标仪测定450 nm处的吸光度。

  1.7.3   脾细胞中T淋巴细胞的表面标志分子检测

  免疫后第28 d，安乐死处死小鼠，收集脾细胞并对其进行细胞计数，保证每取150 μL有1×10⁶个细胞的密度进行细胞表面染色，分别用抗小鼠CD3-FITC、CD4-APC、CD8a-PE流式抗体进行脾淋巴T细胞表面标记，于4 ℃避光孵育30 min。采用PBS漂洗2次，使用流式细胞仪检测上述表面标志物的表达水平，采用FlowJo 10.8.1软件分析CD3⁺、CD4⁺及CD8⁺ T淋巴细胞的数量和比例。

  1.7.4   小鼠脾淋巴细胞中细胞因子的表达mRNA转录水平检测

  分离脾淋巴细胞并将其以每孔2×10⁶个的密度接种至6孔板中培养24 h，设定PBS组(空白对照)、OVA组及GOQDs/OVA-H组，使用培养基将体积补足至2 mL，继续培养24 h后收集细胞。利用细胞总RNA提取试剂盒提取总RNA，收集RNA溶液；根据反转录试剂盒说明书将各组总RNA反转录为单链脱氧核糖核酸(cDNA)，采用RT-qPCR对细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ表达水平进行检测，引物序列见表 3，读取每个样本的Ct值，采用相对定量法，以β-actin mRNA表达量为内参。荧光定量(qPCR)反应体系(20 μL)：10 μL ChamQ Univer-sal SYBR qPCR Master Mix、7.2 μL dd H₂O、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物和2 μL cDNA。

  表 3

  

  表 3  相关细胞因子及趋化因子受体的RT-qPCR引物序列

  Table 3.  RT-qPCR primer sequences of cytokines and chemokine receptors

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  Primer	Sequences
  β-actin	F: CCAGAGCAAGAGAGGCATCC
  	R: CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG
  IL-1β	F: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT
  	R: ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT
  TNF-α	F: TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG
  	R: GGTCTGGGCCATAGAACTGA
  IFN-γ	F: GGAACTGGCAAAAGGATGGTGAC
  	R: GCTGGACCTGTGGGTTGTTGGAC
  IL-2	F: TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG
  	R: GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC
  IL-4	F: GGTCTCAACCCCCAGCTAGT
  	R: GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT
  IL-6	F: CTCTGGGAAATCGTGGAAATG
  	R: AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA

  1.8   蛋白印迹(Western blot) 法检测MyD88/NF-κB p65信号通路相关蛋白水平

  将细胞RAW264.7以每孔2×10⁶个的密度接种至6孔板中，设定PBS组(空白对照)、OVA组及GOQDs/OVA-H组，使用培养基将体积补足至2 mL，培养24 h后加入蛋白裂解液(已加入1 mmol·L^-1蛋白酶/磷酸酶抑制剂(PMSF))裂解并收集细胞，并用BCA法测定蛋白浓度。使用等量的蛋白质与上样缓冲液混匀煮沸(100 ℃，10 min)制成蛋白电泳样品。采用12.5% SDS-PAGE电泳进行蛋白分离并将蛋白转印(400 mA，30 min)至聚偏氟乙烯膜，5% BSA室温封闭2 h后，加入一抗β-actin、MyD88、NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次，二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，PBST洗涤3次，滴加化学发光液(ECL)显影液检测蛋白质印迹，分析目标蛋白灰度值。

  1.9   统计学分析

  采用Graphpad Prism 9.0软件进行数据分析和图形绘制，数据用X±SD表示，采用单因素方差分析。组间差异不限制用ns表示(P > 0.05)；组间显著性差异用*、**、***表示，当P < 0.05用*表示，当P < 0.01用**表示，当P < 0.001用***表示。

  2.   结果与讨论

  2.1   GOQDs及GOQDs/OVA疫苗的理化性质

  为了直接观察GOQDS及GOQDs/OVA纳米疫苗的形貌和大小，利用TEM进行表征。从图 2a可以看到，GOQDs粒子分散均匀，粒径为(2.55±0.64) nm。当与OVA配制成疫苗后，粒子直径有小幅度的增加，说明OVA被负载在GOQDs的表面。此外，从GOQDs/OVA纳米疫苗的TEM图中发现，随着GOQDs剂量的增加，纳米粒子分散更加均匀，但粒子的直径略微下降，分别为(5.02±1.45) nm、(4.17± 1.13) nm和(4.03±0.70) nm。由此推测GOQDs可以作为“抗原储库”。

  图 2

  

  图 2.  GOQDs及GOQDs/OVA纳米疫苗的(a) TEM图、(c) IR谱图以及(e) 外观变化的图像; GOQDs的(b) XRD图和(d) 拉曼谱图

  Figure 2.  (a) TEM images, (c) IR spectra, and (e) appearance changes of GOQDs and GOQDs/OVA nano-vaccines; (b) XRD pattern and (d) Raman spectrum of GOQDs

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  如图 2b所示，在2θ=10.19°处出现一个较尖锐的特征衍射峰，对应氧化石墨烯(GO)的(002)晶面特征峰^[18-19]；在2θ=20.25°处出现一个弱的宽特征衍射峰，对应GO的(001)晶面峰^[20]，证实石墨已被氧化成GOQDs。IR光谱表明(图 2c)，GOQDs/OVA-H纳米疫苗展现出GOQDs和OVA重叠的特征峰^[21-22]。绿色区域内的振动吸收峰均来自OVA，2 924和2 962 cm^-1来自sp³ C—H伸缩振动，1 640和1 522 cm^-1分别来自酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带，而粉红色区域的振动吸收峰(1 715 cm^-1) 和肩峰(976 cm^-1) 分别来自GOQDs中的羧酸碳基伸缩振动和环氧键。此外，GOQDs的拉曼光谱(图 2d)也显示了GO经典的D峰(1 340 cm^-1)、G峰(1 597 cm^-1)、2D峰(2 700 cm^-1)、D+G峰(2 944 cm^-1)和2G峰(3 185 cm^-1)。其中，G峰与石墨的sp²碳有关，D峰与结构缺陷或部分无序的石墨结构域有关。计算可知D峰和G峰的强度比为1.11，说明氧化程度高，与IR光谱结果一致，证实了GOQDs富含大量官能团。

  长效稳定性是衡量疫苗质量的重要指标之一，能够为未来疫苗的生产、储存、运输等提供依据^[23]。将不同质量的GOQDs与OVA配伍成疫苗，并在4 ℃下放置30 d。从直观图中(图 2e) 看出GOQDs和GOQDs/OVA均呈现为稳定的悬浮液，与初期状态基本保持一致。我们推测小粒子的GOQDs含有多个亲水的羟基和羧酸基，它们能与水分子通过分子间的氢键相互作用，稳定地分散在水中。如表 4所示，ζ电位仍然维持在-14.67~-19.67 mV，平均水合粒径为315.48~368.83 nm，PDI保持在0.31~0.3之间。特别的是，GOQDs及GOQDs/OVA展现出较负的ζ电位，同样也能证实其稳定分散于水中。

  表 4

  

  表 4  GOQDS和GOQDs/OVA纳米疫苗的ζ电位、水合粒径和PDI的变化

  Table 4.  Changes of ζ potential, hydrated particle size, and PDI of GOQDs and GOQDs/OVA nano-vaccines

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  Time/d	Material	ζ potential/mV	Size/nm	PDI
  1	GOQDs	-2.03±0.21	225.37±11.16	0.21±0.04
  	GOQDs/OVA-L	-14.67±1.21	368.83±24.87	0.33±0.03
  	GOQDs/OVA-M	-17.22±1.67	322.62±12.14	0.31±0.05
  	GOQDs/OVA-H	-18.67±1.42	315.48±15.29	0.31±0.03
  30	GOQDs	-1.83±0.41	234.69±13.87	0.23±0.06
  	GOQDs/OVA-L	-16.35±0.82	347.83±15.39	0.31±0.04
  	GOQDs/OVA-M	-16.95±0.67	324.62±13.62	0.29±0.03
  	GOQDs/OVA-H	-19.67±1.05	333.21±14.52	0.28±0.06

  2.2   GOQDs/OVA纳米疫苗的安全性

  安全性是疫苗研发及应用的首要前提^[24]，因此对GOQDs/OVA纳米疫苗进行体内外安全性检测。首先，通过CCK-8检测GOQDs/OVA纳米疫苗对小鼠RAW264.7细胞、原代脾细胞和小鼠BMDCs三种细胞的细胞毒性。结果如图 3a所示，GOQDs的浓度在500 μg·mL^-1以下时，3种细胞的细胞活性均在80%以上；当浓度高达1 000 μg·mL^-1时，3种细胞的存活率分别为65.18%、59.61% 和55.32%。由此可以推测，GOQDs具有良好的体外细胞相容性。另外，在体外溶血实验中观察到，与阳性对照组相比，GOQDs/OVA-H纳米疫苗的上清液在425、542和579 nm处均未出现特征吸收峰，其HR仅为0.13%，未发生溶血现象。从光学图中可以看到红细胞均沉降在EP(electropolished pipe)管底部，上清液清澈且透明(图 3b1)。此外，从光学显微镜中进一步观察红细胞状态发现细胞形态正常，呈椭圆形，没有产生萎缩褶皱等不良现象，且细胞膜完整(图 3b2)。因此，体外安全性实验证实GOQDs/OVA疫苗无毒且生物相容性好，可以用于注射。

  图 3

  

  图 3.  (a) GOQDs在体外不同细胞中的毒性实验; GOQDs/OVA纳米疫苗的(b) 溶血实验结果以及免疫后28 d后小鼠的(c) 血生化检测和(d) 病理组织学检查结果

  OD: optical density; (b1) UV-Vis spectra (Inset: photos under daylight); (b2) Photographs of RBCs.

  Figure 3.  (a) Cytotoxicity test for GOQDs in different cells in vitro; (b) Hemolysis test, (c) blood biochemical test and (d) pathological examination of mice after 28 d immunization of GOQDs/OVA nano-vaccine

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  进一步在体内评估疫苗安全性，使用GOQDs和GOQDs/OVA-H纳米疫苗对小鼠免疫后连续7 d观察发现，小鼠饮水、进食等生理及精神状态正常。由于纳米颗粒或其降解产物会随着APCs的迁移及其他相关途径的转运进入肝脏、心脏及肾脏等器官^[25-26]，因此需要检测AST、ALP、ALT、LDH和BUN相关指标。其中AST、ALP和ALT通常用于评价肝功能，LDH能够辅助诊断心肌疾病，BUN能反映肾功能^[27]。免疫7 d后(图 3c)各组间血生化各项指标无明显差异(P > 0.05)，参考小鼠血生化指标正常值^[28]可知，各项指标均在正常范围。结果说明GOQDs以及GOQDs/OVA-H纳米疫苗对小鼠肝、肾功能以及心脏没有明显损害。其中，肝、肾作为机体主要的代谢、排泄、调节体液平衡的器官。相关文献也证实体内的中性粒细胞释放的髓过氧化物酶会将石墨烯分解成小的碎片，这些碎片被吞噬细胞完全吞噬^[29]。我们推测，拟合成的小粒径的GOQDs可以直接被吞噬细胞吞噬后通过体内代谢排出体外，没有诱导ALT、BUN等生化指标的上升或降低，从而不影响肝、肾组织；小粒径的GOQDs可以通过体内代谢排出体外，从未影响肝、肾组织。同时，对GOQDs/OVA-H组小鼠的心、肝、脾、肺和肾进行组织病理学检查，如图 3d所示，与空白组对比，各组织器官镜检结果表明其均未发现病变，细胞形态正常，组织结构清晰，未见明显炎性改变。综上，GOQDs及GOQDs/OVA纳米疫苗通过注射接种实验动物后，不会造成不良反应，生物安全性良好，是潜在的佐剂材料。

  2.3   GOQDs对抗原的吸附和缓释能力

  理想的佐剂应该具备“抗原储存”能力，并缓慢释放抗原，实现长效免疫刺激^[30]。由于碳量子点表面存在大量官能团，如羧基、羟基等，其能通过分子间相互作用力吸附蛋白抗原。如图 4a所示，随着GOQDs使用剂量的增加，其对OVA的吸附量随之增加。当OVA、GOQDs的质量比大于1∶2时，GOQDs对OVA的负载率(R_ab)达到100%，可以完全吸附所有OVA，其最大吸附量为500 mg·g^-1。由此可知，GOQDs可以作为“抗原储库”进行载体递送。另外，模拟体内微环境的抗原释放曲线是评价佐剂具有缓释效果的重要参数，如图 4b所示，在pH=7.4的生理微环境中，OVA在24 h内快速释放且释放率(R_re)为56.95%，20 d后释放率接近100%，可以推测GOQDs在生理环境中可以缓慢释放抗原，从而持久刺激机体的免疫应答。在pH=5.5的酸性微环境中GOQDs的释放速度增加，3 d内可以全部释放OVA。由此可知GOQDs具有pH响应释放能力。我们猜测GOQDs中富含的羧基、羟基等可以与OVA通过分子间氢键进行结合。但随着pH值的降低，羧基或羟基中的氧原子中孤对电子与氢离子优先结合，破坏了原先GOQDs与OVA之间的氢键作用，从而使得OVA游离释放出来。

  图 4

  

  图 4.  (a) 不同质量比下的GOQDs对OVA的累积吸附率; (b) 不同pH下GOQDs/OVA中OVA的累计释放率; (c)GOQDs释放OVA的SDS-PAGE条带

  Figure 4.  Cumulative adsorption ratios of GOQDs for OVA (a) in PBS with different mass ratios; (b) Controlled release curves of cumulative release rate with time at different pH values; (c) SDS-PAGE image of GOQDs released OVA

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  另外，从SDS-PAGE电泳结果中发现(图 4c)，吸附上清液中仅在OVA、GOQDs质量比为1∶1时能看到较浅的蛋白条带，质量比为1∶2~1∶10时的吸附上清液已无蛋白条带，与BCA法测定结果一致，说明GOQDs已将抗原完全吸附。而沉淀上清液的电泳分离结果表明，同一时间点的GOQDs含量越高所释放的蛋白量也越多，与OVA的蛋白条带相比，OVA、GOQDs质量比为1∶10时蛋白基本完全释放。因此，将GOQDs与抗原按一定的比例混合，GOQDs可以表现出高负载率和缓释作用，可以作为有效的抗原递送载体控制抗原在免疫系统中的时空呈现，从而促进疫苗的持续释放和靶向性，低剂量的弱免疫原也可以有效地刺激免疫^[31-32]。

  2.4   GOQDs/OVA纳米疫苗的体外细胞摄入情况

  细胞吞噬是疫苗能否进行抗原递呈作用的先决条件。将RAW264.7细胞分别与纯OVA、GOQDs/OVA-H共孵育，观察细胞的吞噬情况。如图 5a所示，利用CLSM分析，在OVA组的RAW264.7细胞内观察到弱的绿色荧光信号，说明细胞对游离的OVA的摄取效率极低。但是，GOQDs/OVA-H组比单一的OVA组展现出更强烈的绿色荧光。利用Image J软件分析可知，其GOQDs/OVA的绿色平均荧光强度提高了约1.3倍(图 5b)，推测GOQDs更容易携带OVA进入胞内。另外，利用流式细胞术(FACS)分析GOQDs在RAW264.7细胞上提高抗原摄入能力的影响，结果如图 5c所示。与单一的OVA相比，GOQDs/OVA-H组曲线向右偏移，抗原绿色荧光强度增加，GOQDs可以携带更多的OVA进入细胞，该结果与CLSM结果一致，说明GOQDs是优良的递送载体。我们推测GOQDs较高的比表面积和静电吸附能力可以吸附大量抗原，同时零维结构可以与细胞膜发生横向平面摩擦作用，轻易地将GOQDs嵌入细胞膜内，诱导产生大量的炎症因子，从而触发动物机体产生强烈的细胞免疫应答。

  图 5

  

  图 5.  (a) OVA、GOQDs/OVA-H被RAW264.7细胞摄入的CLSM图(细胞核: DAPI, 蓝色荧光; 抗原: OVA-FITC，绿色); (b)OVA与GOQDs/OVA纳米疫苗在RAW264.7细胞内的绿色荧光平均强度; (c) RAW264.7细胞分别与OVA、GOQDs/OVA-H纳米疫苗共孵育后的FACS图

  Figure 5.  (a) CLSM images of the cell uptake of OVA, GOQDs/OVA nano-vaccine in RAW264.7 (Nucleus: DAPI, blue; Antigen: OVA-FITC, green); (b) Mean fluorescence intensities of OVA and GOQDs/OVA nano-vaccine in RAW264.7 cells; (c) FACS curves of RAW264.7 cells after co-incubation with OVA and GOQDs/OVA nano-vaccine

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  2.5   体内免疫效力评价

  免疫效力的评估是疫苗发挥作用的关键。采用ELSIA方法进行特异性抗体滴度检测。所有血清均稀释3 200倍后进行检测。免疫后第14和28 d检测发现(图 6a)，PBS组不产生抗体，阴性对照成立。与OVA对照组相比，添加不同剂量的GOQDs均能诱导较高水平的特异性IgG的表达(P < 0.05)，尤其是GOQDs中剂量组(P < 0.01)和高剂量组(P < 0.001)。特别是GOQDs/OVA-H组的抗体滴度是OVA组的6倍。另外，随着GOQDs剂量的增加，IgG抗体水平也呈正相关的提升。由此可知，GOQDs可以持续诱导机体产生较高水平的IgG分泌。

  图 6

  

  图 6.  GOQDs/OVA纳米疫苗免疫小鼠的免疫应答: (a) 特异性OVA-IgG抗体效价; (b) IgG亚型水平变化; (c) IgG亚型中IgG1/IgG2a的浓度比

  Figure 6.  Immune responses of mice immunized with GOQDs/OVA nano-vaccine in serum: (a) specific OVA-IgG antibody titer; (b) IgG subtype levels; (c) concentration ratio of IgG1/IgG2a

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  理想的佐剂应该能同时诱导Th1和Th2反应，Th1反应可以介导细胞免疫，Th2反应可以激活B细胞的增殖和活化，诱导体液免疫应答，从而在病毒感染时发挥防治作用。其中，IgG1抗体的产生与Th2相关，IgG2a抗体的产生与Th1相关。免疫后28 d，IgG亚型抗体水平如图 6b所示，与OVA组相比，GOQDs/OVA组诱导的血清IgG1均有显著性上调(P < 0.05)。但中剂量组与高剂量组却没有显著性差异(P > 0.05)。另外，添加不同剂量的GOQDs均能刺激IgG2a的分泌，并且随着剂量的提升呈现正相关趋势。所有GOQDs/OVA组的IgG2a水平均略低于IgG1水平。另外，IgG1/IgG2a的比值同样代表着免疫应答方式。如图 6c所示，OVA、GOQDs/OVA-L、GOQDs/OVA-M和GOQDs/OVA-H组的IgG1、IgG2a浓度比分别为1.64、1.69、1.49和1.15，OVA组与GOQDs/OVA-L和GOQDs/OVA-M组没有显著差异(P > 0.05)，GOQDs/OVA-H组有一定幅度的降低(P < 0.05)，可以推测GOQDs偏向于Th1免疫途径。

  2.6   GOQDs对脾T淋巴细胞亚群的分化情况的影响

  脾脏是机体最大的淋巴组织，检测疫苗佐剂免疫后对T淋巴细胞亚群的影响及相关细胞因子的分泌对进一步研究佐剂诱导的免疫反应类型及作用机理具有重要意义^[33]。T淋巴细胞的表面标志蛋白CD3分化成CD4和CD8会直接影响免疫途径。CD4⁺ T细胞能够参与Th细胞TCR识别抗原的信号转导，在免疫反应过程中通常发挥辅助机体产生体液免疫和细胞免疫应答的功能，CD8⁺ T细胞则是重要的效应细胞，具有杀伤靶细胞的功能。通过FACS分析各组小鼠脾细胞中T细胞亚群的含量以及CD8⁺、CD4⁺ T细胞数量的比值，分析GOQDs对小鼠脾T细胞亚群的影响。研究发现(图 7a~7f)，与PBS组和OVA组相比，GOQDs低剂量和中剂量组的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8a⁺ T细胞百分比均显著提高。高剂量组的CD3⁺CD8a⁺ T细胞百分比最高(28.6%)，但CD3⁺CD4⁺的比例却有所下降(52.5%)。由实验结果可以推测GOQDs可以通过诱导T淋巴细胞的分化，从而激活免疫响应。CD8⁺、CD4⁺的比值直接说明机体的免疫情况。与GOQDs低剂量及中剂量组相比，GOQDs/OVA-H组大大提高了CD4⁺、CD8⁺的比值(P < 0.01)，推断GOQDs可以同时刺激体液和细胞双重免疫，更偏向于Th1型细胞免疫。

  图 7

  

  图 7.  (a~e) 疫苗免疫小鼠后的脾细胞中CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8a⁺ T淋巴细胞比例及(f) CD3⁺ T淋巴细胞中CD8a⁺、CD4⁺的比值; (g) OVA和GOQDs/OVA-H疫苗免疫后脾细胞分泌相关细胞因子的情况

  Figure 7.  (a-e) Proportion of CD3+ CD4+ and CD3+CD8a+ T lymphocytes in splenocytes after vaccination with vaccines, and (f) ratio of CD8a+ to CD4+ in CD3+ T lymphocytes; (g) Cytokine secretion of spleen cells in immunized mice with OVA and GOQDs/OVA nano-vaccine

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  同时，细胞因子分泌是细胞参与免疫应答的重要表现。Th1途径主要产生IFN-γ和IL-2的分泌^[34]，而IL-4是一种重要的抗炎性细胞因子，由Th2细胞分泌，主要作用为活化B细胞增殖和产生抗体^[35]。通过RT-qPCR检测脾淋巴细胞的相关细胞因子mRNA转录水平，结果显示(图 7g)，与OVA组相比，GOQDs/OVA-H组IL-1β(P < 0.05)、IL-2(P < 0.001)、IL-4 (P < 0.01)、IL-6(P < 0.05)、IFN-γ(P < 0.01)TNF-α(P < 0.05)转录水平均明显升高。由于IL-1β和TNF-α是促炎症因子^[36]，推测在GOQDs被细胞内吞过程中，诱导炎症反应，产生大量炎症因子，促进抗原递呈作用。

  2.7   GOQDs激活MyD88/NF-κB p65信号通路

  外源性或/和内源性配体通过跨膜蛋白与胞内MyD88相互作用后，可经过多个因子的转化最终激活核转录因子NF-κB，诱导细胞因子和趋化因子的分泌，启动快速的先天免疫应答，从而引起炎症反应，发挥重要的免疫防御作用^[37]。我们研究发现，OVA可以激活巨噬细胞的髓样细胞分化因子(MyD88)和NF-κB p65蛋白表达增加，而磷酸化NF-κB p65蛋白表达无显著差异(P > 0.05)，单一的GOQDs和GOQDs/OVA-H纳米疫苗可以提高MyD88、NF-κB p65和NF-κB p-p65蛋白表达，特别是GOQDs/OVA-H组的NF-κb p-p65蛋白表达显著提升(P < 0.001)(图 8)。同时，MyD88/NF-κB信号通路会激活IL-1、IL-6、IFN-γ的分泌，与细胞因子的mRNA转录水平结果一致，推测GOQDs/NF-κB OVA纳米疫苗是通过激活MyD88/NF-κB p65信号通路，从而增强机体的免疫应答，最终针对疫苗抗原产生特异性抗体。

  图 8

  

  图 8.  OVA、GOQDs及GOQDs/OVA-H刺激后RAW264.7细胞中MyD88、p65和p-p65的蛋白表达: (a)Western blot法分析和(b) Image J分析

  Figure 8.  Expressions of MyD88, p65, and p-p65 protein in cells stimulated by OVA, GOQDs GOQDs/OVA-H nano-vaccine: (a) Western blot and (b) Image J software analysis

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  3.   结论

  利用鳞片石墨作为原料，经改进的Hummers法获得富氧功能团(如羟基、羧酸基和环氧基)的GOQDs，其形貌和结构经TEM、XRD、IR和Raman光谱表征。这些含氧官能团赋予GOQDs高度的水溶性和稳定性。通过分子间氢键的相互作用，GOQDs能高效负载模型抗原蛋白OVA，并表现出pH响应缓释OVA性能。CCK-8、溶血实验及H&E结果表明，GOQDs具有良好的生物相容性。通过简单的混合，我们构筑了GOQDs/OVA纳米疫苗。研究表明，GOQDs能促进细胞对抗原的摄入，引起炎性细胞因子的分泌，最终有效地诱发高水平IgG、IgG1及IgG2a的表达，体现出体液和细胞双重免疫应答。因此，GOQDs适合用于抗病毒、抗感染和抗肿瘤疫苗佐剂。

  
  
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      Lam J H, Baumgarth N. Toll-like receptor mediated inflammation directs B cells towards protective antiviral extrafollicular responses[J]. Nat. Commun., 2023, 14(1):  3979.

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  图 1  小鼠免疫方案

  Figure 1  Immunization protocol of mice

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  图 2  GOQDs及GOQDs/OVA纳米疫苗的(a) TEM图、(c) IR谱图以及(e) 外观变化的图像; GOQDs的(b) XRD图和(d) 拉曼谱图

  Figure 2  (a) TEM images, (c) IR spectra, and (e) appearance changes of GOQDs and GOQDs/OVA nano-vaccines; (b) XRD pattern and (d) Raman spectrum of GOQDs

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  图 3  (a) GOQDs在体外不同细胞中的毒性实验; GOQDs/OVA纳米疫苗的(b) 溶血实验结果以及免疫后28 d后小鼠的(c) 血生化检测和(d) 病理组织学检查结果

  Figure 3  (a) Cytotoxicity test for GOQDs in different cells in vitro; (b) Hemolysis test, (c) blood biochemical test and (d) pathological examination of mice after 28 d immunization of GOQDs/OVA nano-vaccine

  OD: optical density; (b1) UV-Vis spectra (Inset: photos under daylight); (b2) Photographs of RBCs.

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  图 4  (a) 不同质量比下的GOQDs对OVA的累积吸附率; (b) 不同pH下GOQDs/OVA中OVA的累计释放率; (c)GOQDs释放OVA的SDS-PAGE条带

  Figure 4  Cumulative adsorption ratios of GOQDs for OVA (a) in PBS with different mass ratios; (b) Controlled release curves of cumulative release rate with time at different pH values; (c) SDS-PAGE image of GOQDs released OVA

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  图 5  (a) OVA、GOQDs/OVA-H被RAW264.7细胞摄入的CLSM图(细胞核: DAPI, 蓝色荧光; 抗原: OVA-FITC，绿色); (b)OVA与GOQDs/OVA纳米疫苗在RAW264.7细胞内的绿色荧光平均强度; (c) RAW264.7细胞分别与OVA、GOQDs/OVA-H纳米疫苗共孵育后的FACS图

  Figure 5  (a) CLSM images of the cell uptake of OVA, GOQDs/OVA nano-vaccine in RAW264.7 (Nucleus: DAPI, blue; Antigen: OVA-FITC, green); (b) Mean fluorescence intensities of OVA and GOQDs/OVA nano-vaccine in RAW264.7 cells; (c) FACS curves of RAW264.7 cells after co-incubation with OVA and GOQDs/OVA nano-vaccine

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  图 6  GOQDs/OVA纳米疫苗免疫小鼠的免疫应答: (a) 特异性OVA-IgG抗体效价; (b) IgG亚型水平变化; (c) IgG亚型中IgG1/IgG2a的浓度比

  Figure 6  Immune responses of mice immunized with GOQDs/OVA nano-vaccine in serum: (a) specific OVA-IgG antibody titer; (b) IgG subtype levels; (c) concentration ratio of IgG1/IgG2a

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  图 7  (a~e) 疫苗免疫小鼠后的脾细胞中CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8a⁺ T淋巴细胞比例及(f) CD3⁺ T淋巴细胞中CD8a⁺、CD4⁺的比值; (g) OVA和GOQDs/OVA-H疫苗免疫后脾细胞分泌相关细胞因子的情况

  Figure 7  (a-e) Proportion of CD3+ CD4+ and CD3+CD8a+ T lymphocytes in splenocytes after vaccination with vaccines, and (f) ratio of CD8a+ to CD4+ in CD3+ T lymphocytes; (g) Cytokine secretion of spleen cells in immunized mice with OVA and GOQDs/OVA nano-vaccine

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  图 8  OVA、GOQDs及GOQDs/OVA-H刺激后RAW264.7细胞中MyD88、p65和p-p65的蛋白表达: (a)Western blot法分析和(b) Image J分析

  Figure 8  Expressions of MyD88, p65, and p-p65 protein in cells stimulated by OVA, GOQDs GOQDs/OVA-H nano-vaccine: (a) Western blot and (b) Image J software analysis

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  表 1  GOQDs/OVA纳米疫苗的配制方式及免疫途径

  Table 1.  Preparation methods and immunization pathways of GOQDs/OVA nano-vaccine

  Group	mGOQDs/μg	mOVA/μg	VPBS/μL	VDosage/μL	Immunization pathway
  Control			200	200	s.c. injection
  OVA		50	150	200	s.c. injection
  GOQDs/OVA-L	50	50	100	200	s.c. injection
  GOQDs/OVA-M	100	50	50	200	s.c. injection
  GOQDs/OVA-H	150	50		200	s.c. injection
  *s.c. represent subcutaneous.

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  表 2  不同结合比例下GOQDs与OVA的用量

  Table 2.  Dosages of GOQDs and OVA in different combination ratios

  mOVA:mGOQDs	ρOVA/(μg·mL-1)	ρGOQDs/(μg·mL-1)
  20:1	2 000	100
  10:1	1 000	100
  9:1	900	100
  8:1	800	100
  7:1	700	100
  6:1	600	100
  5:1	500	100
  4:1	400	100
  3:1	300	100
  2:1	200	100
  1:1	100	100
  1:2	100	200
  1:3	100	300
  1:4	100	400
  1:5	100	500
  1:6	100	600
  1:7	100	700
  1:8	100	800
  1:9	100	900
  1:10	100	1 000

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  表 3  相关细胞因子及趋化因子受体的RT-qPCR引物序列

  Table 3.  RT-qPCR primer sequences of cytokines and chemokine receptors

  Primer	Sequences
  β-actin	F: CCAGAGCAAGAGAGGCATCC
  	R: CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG
  IL-1β	F: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT
  	R: ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT
  TNF-α	F: TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG
  	R: GGTCTGGGCCATAGAACTGA
  IFN-γ	F: GGAACTGGCAAAAGGATGGTGAC
  	R: GCTGGACCTGTGGGTTGTTGGAC
  IL-2	F: TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG
  	R: GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC
  IL-4	F: GGTCTCAACCCCCAGCTAGT
  	R: GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT
  IL-6	F: CTCTGGGAAATCGTGGAAATG
  	R: AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA

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  表 4  GOQDS和GOQDs/OVA纳米疫苗的ζ电位、水合粒径和PDI的变化

  Table 4.  Changes of ζ potential, hydrated particle size, and PDI of GOQDs and GOQDs/OVA nano-vaccines

  Time/d	Material	ζ potential/mV	Size/nm	PDI
  1	GOQDs	-2.03±0.21	225.37±11.16	0.21±0.04
  	GOQDs/OVA-L	-14.67±1.21	368.83±24.87	0.33±0.03
  	GOQDs/OVA-M	-17.22±1.67	322.62±12.14	0.31±0.05
  	GOQDs/OVA-H	-18.67±1.42	315.48±15.29	0.31±0.03
  30	GOQDs	-1.83±0.41	234.69±13.87	0.23±0.06
  	GOQDs/OVA-L	-16.35±0.82	347.83±15.39	0.31±0.04
  	GOQDs/OVA-M	-16.95±0.67	324.62±13.62	0.29±0.03
  	GOQDs/OVA-H	-19.67±1.05	333.21±14.52	0.28±0.06

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