English

• 0.   引言

  骨组织是一种天然的压电材料，能将所受应力转化为电信号，在骨代谢、发育、生长、重塑及修复过程中起着至关重要的作用^[1]。通过局部递送电信号或电刺激能够加速骨折愈合与骨修复过程^[2]。受骨组织的压电效应和电刺激促成骨的启发，利用压电材料产生电信号刺激细胞响应和促进骨再生受到了广泛的关注^[3]。

  纳米酶是一类具有类似天然酶活性的纳米材料，在抗菌和组织修复等生物医学领域显示出巨大的应用潜力^[4]。具有过氧化物酶(POD)类酶活性的纳米酶可以产生羟基自由基(·OH)，杀死细菌，因而可用于治疗耐药性细菌感染^[5]；而具有过氧化氢酶(CAT)类酶活性的纳米酶可以清除病区过量的过氧化氢(H₂O₂)，缓解细胞氧化应激，避免过度的炎症反应，因而可用于促进组织修复^[6]。然而，大多数纳米酶的类酶活性不高，影响了感染治疗和组织修复的效果^[7]。

  超声介导的声动力治疗(SDT)是基于超声波(US)触发声敏剂产生活性氧(ROS)，引起细菌氧化损伤和死亡的非侵入性治疗策略^[8]。在US触发下，声敏剂产生的电子-空穴对与周围分子(如氧气和水)发生氧化还原反应，产生如单线态氧(¹O₂)、超氧阴离子(·O₂^-)和·OH等ROS杀死细菌/破坏生物膜^[9]。由于声动力具有组织穿透力深、可控性强，以及产生的ROS不会导致耐药性等优点，因此能实现空间/时间选择的精准感染治疗^[10]。然而，目前大多数报道的声敏剂由于电子-空穴对分离后的快速复合导致ROS的产率低下，声动力效果不佳^[11]。最近，压电材料作为声敏剂用于声动力引起了人们的兴趣，超声触发压电材料形成内置压电场，显著地促进了电荷的分离和迁移，产生更多的ROS，从而提高声动力的效果^[12]。然而，常规压电材料的压电性能低，因而声动力效果欠佳。

  铌酸钠(NaNbO₃)是一种常规的压电材料，也是一种骨修复材料^[13]。铋(Bi)元素具有很好的生物安全性，作为多种药物的成分，广泛应用于治疗胃肠等疾病^[14]。研究显示，在压电材料中掺杂Bi离子可以提高压电性能^[15]。锰(Mn)是人体必不可少的微量元素之一，多价态转变使其具有类酶活性(如POD)^[16]。掺杂Mn离子可以提高或赋予生物材料类酶活性^[17]。为此，我们通过水热法制备了Mn、Bi离子共掺杂铌酸钠，目的是设计一种具有优良压电性能和类酶活性的骨修复材料，通过压电效应促进细胞响应和骨再生，并增强声动力和类酶活性产生ROS，协同抗菌/清除生物膜，为高效治疗深层感染骨组织疾病提供了一种新的途径。

  1.   实验部分

  1.1   实验试剂

  五氧化二铌(Nb₂O₅，99.99%)购自南通飞宇生物科技有限公司；氢氧化钠(NaOH，98%)、硝酸铋(Bi(NO₃)₃，99.9%)、硝酸锰(Mn(NO₃)₂，99.9%)、5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO，97%)购自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；罗丹明B(RhB，99%)，亚甲基蓝(MB，90%)和1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF，97%)购自上海麦克林生化科技股份有限公司。所有试剂直接使用，没有进一步纯化处理。

  1.2   材料制备

  将1 g Nb₂O₅溶解于50 mL(2 mol·L^-1)NaOH溶液中，再加入不同物质的量分数的Mn(NO₃)₂和Bi(NO₃)₃，搅拌均匀后加入水热釜中，置入烘箱(160 ℃)水热反应12 h，所得沉淀分别用水和乙醇洗涤3次，干燥后于马弗炉(400 ℃)煅烧1 h，得到Mn、Bi共掺杂NaNbO₃(mbNO)粉末样品，包括Mn、Bi共掺杂2%(2mbNO)，4%(4mbNO)和6%(6mbNO)，以及未掺杂的NaNbO₃(NO)。

  1.3   材料表征

  通过扫描电子显微镜、能量分析光谱仪(SEM，EDS，S-4800，Hitachi)观察样品的微观形貌和元素分布。通过X射线衍射仪(XRD，D/max2550VB/PC，工作电压40 kV，电流450 mA，铜靶辐射源，波长0.154 06 nm，扫描范围10°~80°)分析样品的晶体结构。通过X射线光电子能谱仪(XPS，Thermo Scientific K-Alpha)分析样品的元素价态和价带变化。通过紫外可见近红外光谱仪(UV-Vis-NIR，Lambda 950)分析并计算样品的禁带宽度。通过压电力显微镜(PFM，NTEGRA)测量样品的压电性能。

  1.4   性能测试

  1.4.1   声动力性能检测

  采用RhB(10 μg·mL^-1)、MB(5 μg·mL^-1)和DPBF(5 μg·mL^-1)溶液分别检测样品声动力产生的总ROS、·OH和·O₂^-。将样品浸入溶液(1 mg·mL^-1)，在不同US条件下，测量上清液的吸光度；以DMPO作为·OH和·O₂^-的捕获剂，通过电子顺磁共振波谱仪(EMX-8/2.7)的电子自旋共振(ESR)光谱考察样品声动力产生·OH和·O₂^-的效果。

  1.4.2   类酶活性检测

  将样品浸入含有1×10^-2 mol·L^-1 H₂O₂的MB溶液(1 mg·mL^-1)中，检测样品的POD类酶活性；在不同US和pH条件下，反应10 min后，测量上清液的吸光度；通过ESR光谱分析样品产生·OH的能力。

  1.4.3   电化学性能检测

  在US(功率为1.5 W·cm^-2)作用下，通过标准三电极系统(Pt对电极、Ag/AgCl参比电极和GCE工作电极，0.1 mol·L^-1 Na₂SO₄电解液)的电化学工作站(PARSTAT2273)，利用电化学阻抗(EIS)分析和计时电流法(i-t)测量样品的电化学性质。GCE工作电极由样品粉末分散液滴涂在导电玻璃表面并干燥后制成。

  1.5   体外细胞响应

  1.5.1   细胞培养

  在α-MEM培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，在37 ℃和5% CO₂气氛下，每3 d更换培养基，使用3~5代鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)进行细胞实验。

  1.5.2   细胞毒性

  使用细胞计数试剂盒(CCK-8)，在培养基中加入不同质量浓度的样品，将rBMSC(密度为每孔2×10⁴)与样品培养24 h，随后在培养基中加入CCK-8溶液(100 μL)，孵育1 h后，在450 nm处检测吸光度。

  1.5.3   细胞增殖

  使用CCK-8检测细胞增殖情况。将rBMSC(密度为每孔2×10⁴)与样品(0.5 mg·mL^-1)培养不同时间，在培养24 h后，每天用US(1 MHz，0.5 W·cm^-2)对处理组中的细胞进行照射(每天2次，每次10 s)。随后，在培养基中加入CCK-8溶液(100 μL)。孵育1 h后，在450 nm处检测吸光度。

  1.5.4   细胞形态观察

  分别用异硫氰酸荧光素-花青素(FITC-phalloidin)和2-(4-脒基苯基)-6-吲哚脒二盐酸盐(DAPI)染色细胞的肌动蛋白丝(绿色)和细胞核(蓝色)，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，Nikon A1R)观察染色后的细胞。

  1.6   体外抗菌实验

  1.6.1   细菌培养

  金黄色葡萄球菌(S. aureus)和大肠杆菌(E. coli)分别在胰蛋白胨大豆肉汤和溶原肉汤培养基中培养，将细菌与样品(0.5 mg·mL^-1)共培养，并在US(功率1.5 W·cm^-2，辐照时间20 min)作用和添加H₂O₂(2 mmol·L^-1)条件下，考察样品的声动力性能和类酶活性。

  1.6.2   平板菌落计数

  将1 mL菌悬液(1×10⁶ CFU·mL^-1)与样品(0.5 mg·mL^-1)在37 ℃共培养6 h，将培养后的菌悬液稀释10倍，取20 μL涂布在营养琼脂板上，于37 ℃孵育24 h，拍照并计数菌落，抑菌率(R)计算公式如下：

  $ R=(C-S) / C \times 100 \% $

  (1)

  其中C和S分别为Control组和样品组的菌落数。

  1.6.3   生物膜染色

  将100 µL菌悬液(1×10⁸ CFU·mL^-1)与900 µL培养基混合，于37 ℃在孔板中培养48 h，再加入样品(0.5 mg·mL^-1)，于37 ℃培养12 h。接着用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入500 µL无水乙醇固定，于4 ℃培养15 min。随后添加300 μL结晶紫染料(1%)并培养30 min，PBS洗涤3次后，拍摄孔中的细菌生物膜。将孔板干燥，加入100 μL冰醋酸溶液(33%)，于37 ℃培养30 min，在590 nm处检测吸光度，评估生物膜的破坏程度。

  1.6.4   细菌膜形态

  样品与细菌共培养后，菌悬液离心，取沉淀物悬浮在无菌水中，将悬浮液滴到干净硅片上干燥，随后加入含1%戊二醛的PBS固定12 h，采用梯度乙醇溶液脱水，干燥后使用SEM观察细菌膜形态。

  2.   结果与讨论

  2.1   材料组成结构表征

  SEM图像(图 1a)显示：Mn、Bi共掺杂后，铌酸钠的粒径(500 nm左右)没有发生明显变化，而6mbNO发生严重的团聚现象。因此，共掺杂4%的Mn、Bi比较合适。EDS谱图(图 1b)显示：2mbNO、4mbNO和6mbNO的Bi和Mn元素特征峰强度逐渐增强，说明Bi和Mn含量增加。EDS定量分析显示：Bi在2mbNO、4mbNO和6mbNO中的原子比分别为(1.53±0.17)%、(3.64±0.21)%和(5.51±0.24)%；Mn在2mbNO、4mbNO和6mbNO中的原子比分别为(1.25±0.15)%、(3.22±0.18)%和(5.28±0.22)%。EDS面扫描元素分布图(图 2)显示：共掺杂材料表面明显分散有Mn和Bi元素。

  图 1

  

  图 1.  NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO的SEM图像(a)和EDS谱图(b)

  Figure 1.  SEM images (a) and EDS spectra (b) of NO, 2mbNO, 4mbNO, and 6mbNO

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  图 2

  

  图 2.  NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO的EDS面扫元素分布图

  Figure 2.  EDS mappings of element distribution of NO, 2mbNO, 4mbNO, and 6mbNO

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  XRD图(图 3a和3b)中，样品衍射峰与PDF No.75-2102一致。根据布拉格方程：2dsin θ=nλ(d为晶面间距，θ为入射角，λ为X射线的波长，n为衍射级数)、晶格参数方程：α=d(h²+k²+l²)^1/2(α为晶格参数，h、k、l为晶面指数)和晶格畸变率(α₀-α)/α₀(α₀为NO的晶格参数，α为2mbNO、4mbNO和6mbNO的晶格参数)，对(110)晶面进行计算可得：NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO的晶面间距分别为0.275 3、0.275 7、0.275 9和0.276 1 nm；2mbNO、4mbNO和6mbNO的晶格畸变率分别为0.18%、0.24%和0.30%。Mn和Bi离子半径分别为80和108 pm，NO中Nb和Na离子半径分别为70和95 pm，Mn、Bi共掺杂时，Mn离子取代Nb离子^[18]，Bi离子取代Na离子^[19]，均为大半径离子取代小半径离子，从而使NO发生晶格扩张，产生点缺陷。结合XRD图和布拉格方程可知，Mn、Bi共掺杂使NO晶格扩张，产生的点缺陷晶格畸变使其晶面间距变大(表现为衍射峰左移)^[20]。

  图 3

  

  图 3.  NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO在10°~80° (a)和31°~33° (b)的XRD图; NO (c)和4mbNO (d)的XPS总谱图; NO和4mbNO的Nb3d (e)、4mbNO的Mn2p (f)和Bi4f (g)、NO (h)和4mbNO (i)的O1s高分辨XPS谱图

  Figure 3.  XRD patterns of NO, 2 mbNO, 4 mbNO, and 6 mbNO at 10°-80° (a) and 31°-33° (b); XPS survey spectra of NO (c) and 4mbNO (d); High-resolution XPS spectra of Nb3d (e) for NO and 4mbNO, Mn2p (f) and Bi4f (g) for 4mbNO, and O1s for NO (h) and 4mbNO (i)

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  与NO(图 3c)相比，4mbNO的XPS总谱图出现了Mn和Bi的元素特征峰(图 3d)，高分辨XPS谱图出现了Nb3d(图 3e)、Mn2p(图 3f)和Bi4f(图 3g)的特征信号。由图 3f可知，2个结合能峰值分别为641.50和652.94 eV，对应Mn2p_3/2和Mn2p_1/2的结合能，表明Mn以Mn²⁺的形式存在于样品中^[21]。由图 3g可知，2个结合能峰值分别为159.02和164.33 eV，对应Bi4f_7/2和Bi4f_5/2的结合能，表明Bi以Bi³⁺的形式存在于样品中^[22]，说明Mn离子和Bi离子成功掺杂于4mbNO晶格中；Mn、Bi共掺杂后，Nb元素结合能减小，这是由于氧空位(O_v)导致Nb周围的电子密度增加^[23]。O1s高分辨XPS光谱(图 3h和3i)显示：NO和4mbNO的氧空位含量分别为10.65%和22.30%。结果表明：Mn、Bi共掺杂产生了氧空位缺陷，导致了晶格畸变，由于晶体的不对称性增加，进而提高其压电性能^[24]。

  2.2   压电性能

  通过PFM考察了不同含量Mn、Bi共掺杂对样品压电性能的影响，结果(表 1)显示：NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO的压电系数(d₃₃)分别为36.58、52.47、69.82和44.26。因此，4mbNO压电性能最优，过多共掺杂导致6mbNO团聚，压电性能下降。PFM的压电响应振幅图(图 4a、4e)和相位图(图 4b、4f)表明，代表样品NO和4mbNO均具有压电性。不同压电响应振幅变化反映了外部电场引起的连续应变，从蝶形回线(图 4c、4g)可知，与NO相比，4mbNO的振幅变化更高，说明其在电场作用下产生更大的应变，表明其压电性能更佳^[25]。从磁滞回线(图 4d、4h)可知，NO和4mbNO均呈现出相位反转，说明外部电场的变化改变了它们的局部极化。与NO相比，mbNO的磁滞回线明显变窄，表明其更容易被极化，说明其压电性能更佳。综上所述，Mn、Bi共掺杂提高了4mbNO的压电性能，这是由于共掺杂使晶格发生畸变、电荷中心发生偏移以及晶体不对称性增强的结果^[24]。

  表 1

  

  表 1  不同样品的d₃₃系数

  Table 1.  d₃₃ coefficient of different samples

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  Sample	d33 / (pm·V-1)
  NO	36.58
  2mbNO	52.47
  4mbNO	69.82
  6mbNO	44.26

  图 4

  

  图 4.  NO (a~d)和4mbNO (e~h)的PFM振幅图(a、e)、相位图(b、f)、蝶形回线(c、g)和磁滞回线(d、h)

  Figure 4.  PFM amplitude images (a, e), phase images (b, f), butterfly loops (c, g), magnetic hysteresis loops (d, h) of NO (a-d) and 4mbNO (e-h)

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  2.3   声动力性能

  声动力性能一般通过超声触发材料产生ROS降解RhB的效率来评价^[26]。图 5a结果显示：在US(1.5 W·cm^-2，5 min)照射下，4mbNO最优，掺杂过多(如6mbNO)，声动力性能反而减弱，说明只有适量的共掺杂才能赋予其优良的声动力性能。图 5b和5c显示了不同US照射时间对4mbNO降解MB和DPBF效率的影响，随着US照射时间增加，4mbNO通过声动力持续产生·OH和·O₂^-等ROS。图 5d显示不同US功率对4mbNO降解RhB效率的影响，结果表明，当US功率不超过0.5 W·cm^-2，4mbNO没有声动力性能，而当US功率超过0.5 W·cm^-2时，4mbNO才具有声动力性能，并且随着US功率增加，声动力逐渐增强，产生ROS的量增多。ESR谱图(图 5e和5f)是4mbNO在US照射下分别产生·OH和·O₂^-的情况。结果表明，与NO相比，4mbNO产生更多的ROS(·OH和·O₂^-)，表明其声动力性能提高，这是由于共掺杂提高了4mbNO的压电性能，相应增强了声动力^[27]。

  图 5

  

  图 5.  在US照射下, 不同样品降解RhB的效率(a); 不同US照射时间对4mbNO降解MB (b)和DPBF (c)效率的影响; 不同US功率对4mbNO降解RhB效率的影响(d); NO和4mbNO在US照射下产生·OH(e)和·O₂^- (f)的ESR谱图

  Figure 5.  Degradation efficiency of different samples for RhB under US irradiation (a); Effect of different US irradiation time on the degradation effiency of MB (b) and DPBF (c) by 4 mbNO; Effect of different US power levels on the degradation effiency of RhB by 4mbNO(d); ESR spectra of ·OH (e) and ·O₂^- (f) produced by NO and 4mbNO under US irradiation

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  2.4   掺杂机理

  UV-Vis-NIR漫反射光谱(图 6a)显示Mn、Bi共掺杂增强了mbNO的可见光吸收。根据漫反射光谱计算禁带宽度(图 6b和6c)^[28]可以得出，与NO的禁带宽度(3.33 eV)相比，4mbNO的禁带宽度(2.30 eV)明显缩小。VB-XPS(价带XPS)图显示NO(图 6e)和4mbNO(图 6d)的价带分别为2.03和1.94 eV，说明共掺杂使其价带位置发生移动。由i-t曲线(图 6f)可知，与其它样品相比，4mbNO的声电流强度最高，即在US作用下产生的载流子密度最高，这是由于共掺杂促进了载流子的分离和迁移^[29]。由EIS曲线(图 6g)可知，共掺杂使4mbNO阻抗曲线的曲率半径逐渐减小，其阻抗明显低于NO，阻抗降低促进电子-空穴的分离^[30]。

  图 6

  

  图 6.  样品的UV-Vis-NIR漫反射光谱(a)、基于漫反射光谱计算的禁带宽度(b、c)、价带XPS谱图(d、e)、i-t曲线(f)和EIS曲线(g); Mn、Bi共掺杂提高mbNO压电/声动力机理图(h)

  Figure 6.  UV-Vis-NIR diffuse reflectance spectra (a), forbidden band widths (b, c) calculated based on the diffuse reflectance spectra; VB-XPS spectra (d, e), i-t curves (f), and EIS curves (g) of the samples; Mechanism diagrams of Mn, Bi co-doping for enhancing piezoelectric/ultrasonic dynamics (h)

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  图 6h为Mn、Bi共掺杂提高mbNO压电/声动力机理图。根据禁带宽度和价带的计算，可得4mbNO导带为-0.36 eV。与NO相比，4mbNO的价带和导带位置均发生移动，导致其禁带宽度减小，使其更容易被US激发^[31]。而且，共掺杂引起4mbNO晶格畸变以增加极化，因而提高其压电性能。在US触发下，4mbNO产生内置电场，压电效应使其能带发生弯曲，促进了电子-空穴的分离，加快电荷转移速率，使价带电位更正，导带电位更负，达到·OH和·O₂^-的氧化还原电位，从而提高了氧化还原反应效率，催化周围环境的H₂O和O₂转化为ROS(·OH和·O₂^-)，因此提高了声动力性能^[32]。

  2.5   酶活性分析

  由图 7a可知，4mbNO能降解MB，表明具备POD类酶活性(产生·OH)。图 7b显示：随着pH降低，4mbNO的POD类酶活性增加，表明POD类酶活性在酸性条件下发挥更好^[33]。图 7c显示：在pH=5.5时，随着US功率增加，4mbNO的POD类酶活性增加，这是由于压电效应促进基于Mn离子价态变化的氧化还原循环^[34]；结合图 5d可知，当US功率不高于0.5 W·cm^-2时，US触发4mbNO压电响应只增强POD类酶活性，没有激活声动力；而当US功率高于0.5 W·cm^-2时，4mbNO具有声动力性能，压电效应同时增强声动力和POD类酶活性，产生大量ROS。ESR光谱(图 7d)显示：在低功率US作用下，4mbNO的POD类酶活性明显增强。

  图 7

  

  图 7.  不同样品降解MB的效率(a); 不同pH值(b)和不同US功率(c)对4mbNO降解MB效率的影响; 4mbNO产生·OH的ESR谱图(d)

  Figure 7.  MB degradation effiency by different samples (a); Effect of different pH values and different US power levels (b) on the degradation effiency of MB by 4mbNO; ESR spectra of ·OH production by 4mbNO (d)

  (a, c) pH=5.5; (d) pH=5.5, US power: 0.5 W·cm^-2, H₂O₂: 10 mmol·L^-1.

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  2.6   材料的细胞毒性及对细胞增殖的影响

  图 8a显示，随着NO和4mbNO质量浓度的增加，2种材料没有细胞毒性。图 8b显示，随着细胞培养时间的增加，细胞增殖提高，表明2种材料都具有优良的生物相容性。另外，4mbNO的细胞增殖明显高于NO，这是由于4mbNO的压电性能优于NO，细胞运动使压电材料产生电信号刺激细胞增殖。在US作用下，2种材料的细胞增殖进一步提高，表明超声触发压电材料产生电信号刺激细胞增殖，而且，4mbNO的细胞增殖明显高于NO。CLSM图像(图 8c)显示了与图 8b相似的细胞增殖趋势。因此，Mn、Bi共掺杂提高4mbNO的压电性能，压电效应促进了细胞增殖。

  图 8

  

  图 8.  不同样品的细胞毒性(a)、样品细胞培养1、3和7 d的增殖情况(b)和CLSM图像(c)

  Figure 8.  Cytotoxicity of different samples (a), proliferation of cells on the samples after 1, 3, and 7 d of incubation (b) and CLSM images (c)

  US power: 0.5 W·cm^-2, *p < 0.05, vs Control.

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  2.7   体外抗菌实验

  图 9a~9d是4mbNO在不同条件下的抗菌效果(S. aureus和E. coli)。结果显示, 单独NO和4mbNO没有抗菌性能；在US作用下，4mbNO的抗菌效果明显优于NO，说明Mn、Bi共掺杂增强了声动力抗菌，这是由于共掺杂提高了压电性能，相应增强声动力；在H₂O₂存在下，4mbNO抗菌性能明显提高，说明其具有POD类酶活性，产生ROS抗菌。在US和H₂O₂都存在下，4mbNO抗菌性能明显优于NO，抗菌率分别达到(98.2±1.0)%(S. aureus)和(97.8±1.2)% (E. coli)，这是由于超声触发压电效应增强声动力和类酶活性产生几种ROS，协同作用，提高了抗菌性能。

  图 9

  

  图 9.  S. aureus和E. coli在不同样品和不同条件下培养后的菌落照片(a、b)和抗菌率(c、d)

  Figure 9.  Photographs of colonies (a, b) and antimicrobial resistance (c, d) of S. aureus and E. coli after incubation with different samples and under different conditions

  US power: 1.5 W·cm^-2, *p < 0.05, vs Control.

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  图 10a~10d是4mbNO在不同条件下清除生物膜(S. aureus和E. coli)的效果。结果显示，单独NO和4mbNO难以清除生物膜；在US作用下，4mbNO清除生物膜效果明显优于NO；在H₂O₂存在下，4mbNO由于具有POD类酶活性，清除生物膜效果明显提高；在US和H₂O₂同时存在下，生物膜残留率分别为(3.3±1.6)%(S. aureus)和(3.7±1.3)%(E. coli)，表明4mbNO清除生物膜效果最优。

  图 10

  

  图 10.  S. aureus和E. coli在不同样品和不同培养条件培养后的结晶紫染色照片(a、b)和生物膜残留率(c、d)

  Figure 10.  Photographs of crystal violet staining (a, b) and biofilm residual rate (c, d) of S. aureus and E. coli after incubation in different samples and under different culture conditions

  US power: 1.5 W·cm^-2, *p < 0.05, vs Control.

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  图 11是4mbNO在不同条件下对S. aureus细菌膜的破坏效果。结果显示，单独NO和4mbNO没有破坏细菌膜；在US存在下，NO破坏了少量细菌膜；在US或H₂O₂存在下，4mbNO使细菌膜黏附在一起，有明显的破坏作用；在US和H₂O₂同时存在下，4mbNO彻底破坏了所有细菌膜。

  图 11

  

  图 11.  S. aureus在不同条件下与样品培养后的SEM图像

  Figure 11.  SEM images of S. aureus after incubation with samples under different conditions

  US power: 1.5 W·cm^-2.

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  综上所述，Mn、Bi共掺杂不仅使4mbNO引起晶格畸变以增加极化，而且降低了带隙，使其更容易被超声激发；在超声触发下，4mbNO产生内置电场，通过促进电荷分离和迁移，提高电荷转移速率，产生更多的ROS，从而提高声动力性能；同时快速的电子传递，也加速了Mn⁴⁺与Mn²⁺的价态转变，从而提高POD类酶活性^[35]。

  耐药菌感染组织的修复，是一个具有挑战性的临床问题。细菌感染抑制组织再生，耐药菌的存在导致组织不愈合或反复感染，因此，抑制细菌感染和促进骨组织再生对骨修复至关重要^[36]。4mbNO既是一种压电材料，又是一种纳米酶，同时也是一种声敏剂和骨修复材料。超声触发材料压电效应促进细胞增殖，有利于骨组织再生。而且在细菌感染的微环境中(pH=5.5)，超声触发材料压电效应同时增强声动力和POD类酶活性，通过2种途径产生多种ROS，协同作用，彻底清除细菌/生物膜，4mbNO作为抗菌骨修复材料有望用于深部感染组织的治疗与修复。

  3.   结论

  通过水热法制备了Mn、Bi共掺杂的4mbNO压电骨修复材料。结果发现，适量Mn与Bi离子共掺杂提高了4mbNO的压电性能和声动力效果，并赋予POD类酶活性。在较低超声功率作用下，4mbNO压电响应明显地促进了间充质干细胞增殖；在低超声功率作用下，4mbNO压电响应同时增强声动力和POD类酶活性，产生多种ROS，协同杀死细菌/清除生物膜。因此，4mbNO压电生物材料在治疗感染组织方面具有潜在的应用前景。

  
  
• 1. [1]

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  图 1  NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO的SEM图像(a)和EDS谱图(b)

  Figure 1  SEM images (a) and EDS spectra (b) of NO, 2mbNO, 4mbNO, and 6mbNO

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  图 2  NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO的EDS面扫元素分布图

  Figure 2  EDS mappings of element distribution of NO, 2mbNO, 4mbNO, and 6mbNO

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  图 3  NO、2mbNO、4mbNO和6mbNO在10°~80° (a)和31°~33° (b)的XRD图; NO (c)和4mbNO (d)的XPS总谱图; NO和4mbNO的Nb3d (e)、4mbNO的Mn2p (f)和Bi4f (g)、NO (h)和4mbNO (i)的O1s高分辨XPS谱图

  Figure 3  XRD patterns of NO, 2 mbNO, 4 mbNO, and 6 mbNO at 10°-80° (a) and 31°-33° (b); XPS survey spectra of NO (c) and 4mbNO (d); High-resolution XPS spectra of Nb3d (e) for NO and 4mbNO, Mn2p (f) and Bi4f (g) for 4mbNO, and O1s for NO (h) and 4mbNO (i)

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  图 4  NO (a~d)和4mbNO (e~h)的PFM振幅图(a、e)、相位图(b、f)、蝶形回线(c、g)和磁滞回线(d、h)

  Figure 4  PFM amplitude images (a, e), phase images (b, f), butterfly loops (c, g), magnetic hysteresis loops (d, h) of NO (a-d) and 4mbNO (e-h)

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  图 5  在US照射下, 不同样品降解RhB的效率(a); 不同US照射时间对4mbNO降解MB (b)和DPBF (c)效率的影响; 不同US功率对4mbNO降解RhB效率的影响(d); NO和4mbNO在US照射下产生·OH(e)和·O₂^- (f)的ESR谱图

  Figure 5  Degradation efficiency of different samples for RhB under US irradiation (a); Effect of different US irradiation time on the degradation effiency of MB (b) and DPBF (c) by 4 mbNO; Effect of different US power levels on the degradation effiency of RhB by 4mbNO(d); ESR spectra of ·OH (e) and ·O₂^- (f) produced by NO and 4mbNO under US irradiation

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  图 6  样品的UV-Vis-NIR漫反射光谱(a)、基于漫反射光谱计算的禁带宽度(b、c)、价带XPS谱图(d、e)、i-t曲线(f)和EIS曲线(g); Mn、Bi共掺杂提高mbNO压电/声动力机理图(h)

  Figure 6  UV-Vis-NIR diffuse reflectance spectra (a), forbidden band widths (b, c) calculated based on the diffuse reflectance spectra; VB-XPS spectra (d, e), i-t curves (f), and EIS curves (g) of the samples; Mechanism diagrams of Mn, Bi co-doping for enhancing piezoelectric/ultrasonic dynamics (h)

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  图 7  不同样品降解MB的效率(a); 不同pH值(b)和不同US功率(c)对4mbNO降解MB效率的影响; 4mbNO产生·OH的ESR谱图(d)

  Figure 7  MB degradation effiency by different samples (a); Effect of different pH values and different US power levels (b) on the degradation effiency of MB by 4mbNO; ESR spectra of ·OH production by 4mbNO (d)

  (a, c) pH=5.5; (d) pH=5.5, US power: 0.5 W·cm^-2, H₂O₂: 10 mmol·L^-1.

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  图 8  不同样品的细胞毒性(a)、样品细胞培养1、3和7 d的增殖情况(b)和CLSM图像(c)

  Figure 8  Cytotoxicity of different samples (a), proliferation of cells on the samples after 1, 3, and 7 d of incubation (b) and CLSM images (c)

  US power: 0.5 W·cm^-2, *p < 0.05, vs Control.

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  图 9  S. aureus和E. coli在不同样品和不同条件下培养后的菌落照片(a、b)和抗菌率(c、d)

  Figure 9  Photographs of colonies (a, b) and antimicrobial resistance (c, d) of S. aureus and E. coli after incubation with different samples and under different conditions

  US power: 1.5 W·cm^-2, *p < 0.05, vs Control.

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  图 10  S. aureus和E. coli在不同样品和不同培养条件培养后的结晶紫染色照片(a、b)和生物膜残留率(c、d)

  Figure 10  Photographs of crystal violet staining (a, b) and biofilm residual rate (c, d) of S. aureus and E. coli after incubation in different samples and under different culture conditions

  US power: 1.5 W·cm^-2, *p < 0.05, vs Control.

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  图 11  S. aureus在不同条件下与样品培养后的SEM图像

  Figure 11  SEM images of S. aureus after incubation with samples under different conditions

  US power: 1.5 W·cm^-2.

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  表 1  不同样品的d₃₃系数

  Table 1.  d₃₃ coefficient of different samples

  Sample	d33 / (pm·V-1)
  NO	36.58
  2mbNO	52.47
  4mbNO	69.82
  6mbNO	44.26

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