卵巢癌是严重威胁女性健康的生殖系统恶性肿瘤[1-2]。因位于盆腔深部，早期症状不明显且缺乏特异性的生化标志物，卵巢癌的诊断主要依靠影像检测。然而，传统的影像学技术对早期卵巢癌的诊断能力有限，缺乏实现细胞水平检测所需的敏感性，70%~80%的患者确诊时已属中晚期，错过最佳治疗时期，5年生存率不到40%[3]。早期精准检测率低，是癌症治愈率低的直接原因。因此，发展一种高效的检测卵巢癌细胞的方法对于卵巢癌的早期诊断至关重要。
分子成像技术通过将高度特异性、高亲和力的分子探针与成像靶点进行特异性结合，再应用成像技术进行靶向成像，有望为卵巢癌的早期诊断提供新策略[4-5]。在各成像模式中，磁共振成像(MRI)技术具有无创、无辐射、空间和软组织分辨率高等优点，被广泛用于临床诊断。但在肿瘤分子成像中，MRI存在灵敏度不足的缺陷[6]。光学分子成像因其高灵敏度、实时成像的特点，是分子影像学的重要成像手段之一[7]。基于MRI与光学成像高度互补的特点，将二者联用发展荧光-MRI双模态成像技术成为近年来分子成像的研究热点[8]。但设计对比度高、稳定性好、毒性低、制备工艺简单的分子探针是荧光-MRI双模态分子成像研究领域的一项挑战。
钆离子具有7个不成对电子，是一种顺磁性非常强的金属离子，能明显地缩短纵向驰豫时间(T1)，从而影响MRI的信号强度，表现出增强的信号。钆的螯合物在临床中被广泛应用，如钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)、钆特酸葡甲胺(Gd-DOTA)等。但是，这些小分子配位化合物的r1弛豫率相对较低(一般在4 L·mmol-1·s-1左右)[9]、在体内清除较快、分布没有特异性，不适用于分子影像的研究[10]。研究发现，把Gd螯合物连接在纳米载体表面或者研制包含Gd的纳米颗粒造影剂，不仅可以延长造影剂在水溶液中的翻转时间从而达到提高r1弛豫率的目的，并且有更长的血液循环时间，有利于高分辨图像的获取[11-12]。以碳元素为主要成分的荧光碳点不仅具有优良光学性能，且具有生物相容性好、易于制备及功能化修饰、稳定性好等优势，成为构建分子探针的理想材料[13]。在前期研究工作中，我们通过简单易行的“一锅法”，制备了钆掺杂型碳点(Gd-CDs)[14-15]，其兼具荧光和MRI性能，并且具有较低的毒性。但这些荧光磁性碳点的最佳发射多处于蓝光区，弛豫效率不高，限制了它们在生物成像领域潜在应用，并且其对卵巢癌细胞的定性与定量检测未进行深入的研究。
本研究通过制备新型绿色荧光-MRI双模态Gd-CDs，将卵巢癌特异性抗体Anti-HE4修饰到Gd-CDs表面，构建多功能探针Anti-HE4/Gd-CDs，探讨多功能探针在卵巢癌细胞的靶向检测及荧光-MRI双模态成像方面的潜在应用。
二水合柠檬酸三钠和尿素购自上海国药集团化学试剂有限公司。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和硝酸钆购自中国Sigma Aldrich公司。Anti-HE4购自Abcam公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。胰酶购自碧云天生物技术研究所，McCoy′s 5a培养基/DMEM不完全培养基(含双抗)购自江苏凯基生物技术股份有限公司。SKOV-3和NIH-3T3细胞购自中国科学院上海细胞库。
主要仪器有LS55荧光分光分度计(美国PerkinElmer公司)、Sigma 3-30ks高速离心机(德国Sigma公司)、Tecnai G2 F30透射电子显微镜(TEM，美国FEI公司，200 kV)、Nano ZS90 Zeta电位仪(英国马尔文仪器有限公司)、UH4150紫外/可见光分光光度计(天美(中国)科学仪器公司)、Optima 5300DV电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，美国PerkinElmer公司)、GE Discovery 3.0T磁共振成像设备(美国GE公司)、电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)、美国Multiskon MK3微板仪、ESCALAB 250 X射线光电子能谱仪(XPS，美国Thermo公司)，Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，德国Bruker公司)、Leica DMl3000B倒置生物显微镜(德国Leica公司)、Incubator 311二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)。
取0.059 g二水合柠檬酸三钠、0.3 g尿素和0.044 g硝酸钆，溶于0.5 mL水，于200 ℃反应1 h。自然冷却后，加入1 mL水溶解，在离心机上以6 000 r·min-1的转速离心10 min，除去沉淀，将上清液于1000 kDa的透析袋里透析24 h，真空干燥，得到Gd-CDs。
取5 mg EDC·HCl加入到1 mL Gd-CDs溶液(2.5 mg·mL-1)中，在37 ℃水浴中反应15 min后，加入2 mg的NHS。反应15 min后，加入10 μL Anti-HE4(1.789 mg·mL-1)。在37 ℃水浴中继续反应2 h，即得到卵巢癌靶向纳米探针Anti-HE4/Gd-CDs，通过离心纯化。
以硫酸奎宁为参照物，根据公式1计算Gd-CDs的荧光量子产率(YQ)[14]：
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(1) |
其中YQ, s为硫酸奎宁的荧光量子产率(0.1 mol·L-1 H2SO4溶液中，YQ, s=54%)，As和Ax分别为硫酸奎宁和Gd-CDs的最大吸光度，Is和Ix分别为硫酸奎宁和Gd-CDs的荧光峰面积。
采用ICP-MS检测Gd的含量。配制不同Gd浓度的Anti-HE4/Gd-CDs(0.01、0.05、0.08、0.10、0.20、0.30、0.4 mmol·L-1)水溶液，进行T1加权成像。扫描参数：重复时间425 ms，回波时间Min Full，反转时间200~800 ms，矩阵384×224，视野18 cm×18 cm，层厚3.0 mm，层距1.5 mm。原始图像经过GE Aw4.6工作站处理，得到不同样品的T1。
细胞实验均在无菌细胞室进行操作。人卵巢癌细胞SKOV-3用含10%胎牛血清及1%双抗(青霉素-链霉素溶液)的McCoy′s 5a培养基培养；小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基培养，细胞均培养在37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱。
将SKOV-3和NIH-3T3细胞分别接种于96孔板中培养24 h，加入含不同质量浓度的Gd-CDs培养液(0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg·mL-1)，共培养24 h。然后弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞3次。每孔加入新鲜培养基100 μL和10 μL MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-甲氧基苯基)-2-(4-磺酸基)-2H-四唑)，再孵育4 h，用酶标仪测定490 nm处的光密度(OD)。根据公式2计算细胞的相对细胞存活率Rs[10]。每组进行6次平行实验。
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(2) |
其中As表示实验培养孔，含细胞+培养基+MTS+不同浓度的Gd-CDs；Ac表示空白对照培养孔，含细胞+培养基+MTS，即含量为0 mg·mL-1的组。
将SKOV-3和NIH-3T3细胞(每孔5×105个)细胞接种于6孔板上，孵育24 h后，分别与Gd-CDs和Anti-HE4/Gd-CDs孵育2 h，用PBS洗涤后，2 000 r·min-1离心10 min，将收集的细胞分散于1%琼脂糖凝胶中进行MRI扫描。采用快速自旋回波(Fast Spin Echo，FSE)序列扫描，扫描参数：回波时间Min Full，重复时间425 ms，视野18 cm×18 cm，矩阵224×224，层厚3.0 mm，层间距1.5 mm。
将细胞与Gd-CDs和Anti-HE4/Gd-CDs孵育2 h后，用PBS洗3次，在荧光倒置显微镜下拍摄荧光图像。
在T25培养瓶中培养SKOV-3细胞24 h后，与0.18 mmol·L-1 Anti-HE4/Gd-CDs孵育2 h，用PBS洗3次后离心(1 000 r·min-1，5 min)收集细胞。用PBS将细胞稀释成不同浓度(1.0×103、5.0×104、1.0×105、1.5×105、2.5×105 cell·mL-1)，测量每个样本的荧光强度。
以硝酸钆为钆源，柠檬酸三钠为碳源，通过高温碳化法合成了Gd-CDs。所得到的Gd-CDs在水中具有良好的溶解性。从TEM图(图 1A)可以看出，Gd-CDs具有类球形形貌和良好的单分散性，平均粒径约为2.77 nm(图 1B)。高分辨率TEM图显示Gd-CDs具有晶格间距为0.22 nm的晶体结构(图 1A插图)，这与石墨烯(100 facet)的面内晶格间距一致[16]。
Inset: high-resolution TEM image of Gd-CDs.
通过FTIR和XPS来表征Gd-CDs表面化学结构。图 1C为FTIR谱图(扫描范围：300~3 900 cm-1)，3 445 cm-1的宽吸收带属于O—H/N—H的伸缩振动，3 132和1 646 cm-1的吸收带分别属于=C—H和C=C伸缩振动，1 720 cm-1的吸收带属于C=O基团的振动吸收，这表明Gd-CDs表面有大量的羧基、羟基官能团，使得Gd-CDs具有良好的亲水性，并且有利于靶向分子的偶联。在530 cm-1的吸收峰归因于Gd-O基团的振动。XPS谱图显示(图 1D)，在141、284、398和530 eV处观察到4个较强的结合能峰，这分别是Gd4d、C1s、N1s和O1s的特征峰，元素定量分析进一步说明制备的Gd-CDs由63.67%的C、27.92%的O、7.53%的N和0.87%的Gd组成。
所制备Gd-CDs在紫外灯下(365 nm)发出明亮的绿色荧光。通过检测Gd-CDs在激发波长为380~470 nm范围内的荧光光谱，发现Gd-CDs发射峰位于526 nm，随着激发波长的变化，其发射峰位基本保持不变，表现出非激发波长依赖的单发射峰特征。其最佳激发波长为420 nm(图 2B)，具有较大的斯托克斯(Stokes)位移(106 nm)。以硫酸奎宁为参比物，计算得到Gd-CDs的荧光量子产率为32.6%。经过Anti-HE4抗体修饰后，Anti-HE4/Gd-CDs的荧光峰位红移3 nm(图 2C)，荧光强度稍有下降(约8%)，但仍保持相对高的荧光强度，有利于其在生物成像中的应用。
Inset: photos of Gd-CDs in daylight and ultraviolet light (365 nm); c: concentration of Gd; ρ: mass concentration of CDs.
ICP-MS测得的Anti-HE4/Gd-CDs中钆离子的浓度是0.039 mmol·L-1。不同浓度的Gd-CDs的T1加权图像(T1WI)显示，随着Gd-CDs浓度的增加，T1WI信号逐渐增强(图 2D)。根据不同Gd-CDs浓度所测得的T1，得出Gd-CDs的T1弛豫率r1为9.02 L·mmol-1·s-1，高于临床用Gd-DTPA的弛豫效率(约4 L·mmol-1·s-1)[9]。不同质量浓度的不掺杂Gd的CDs的T1WI呈低信号，与对照组(0.0)相比几乎没有区别(图 2E)，说明Gd-CDs的高r1值可能是由于Gd与碳之间的“次级电子自旋转移”[17]。具体来说，纵向弛豫率大多来自Gd3+不成对电子与水合质子的作用。纳米结构中的碳壳具有离域电子，导致电子自旋转移到整个碳纳米结构，使质子核自旋与不成对电子自旋产生的局部磁场间的偶极-偶极相互作用增强[18]。此外，Gd-CDs表面的羧基、羟基等亲水基团有利于其与水合质子充分接触进而降低其弛豫时间[19]。因此，把Gd掺杂到碳材料中，不仅提高r1，并且易于靶向修饰，是一种高性能磁共振造影剂。
对Gd-CDs成像性能的稳定性进行了考察。Gd-CDs在室温储存20 d，其荧光强度(图 3A)和T1(图 3B)未见明显变化，说明Gd-CDs在常温下荧光和磁共振性能的稳定性较好。Gd-CDs(0.2 mg·mL-1)分别分散在pH=4~9的缓冲溶液中放置4 h，其荧光强度和T1变化不大(图 3C)，说明在生理pH条件下，Gd-CDs的荧光和磁共振信号基本不受影响，保证了其在生物成像中的稳定性。
在生物成像应用之前，对Gd-CDs的体外细胞毒性进行了评估。以NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞和SKOV-3卵巢癌细胞为模型，通过MTS试验评估不同浓度的Gd-CDs的细胞毒性。如图 4所示，Gd-CDs在0~1 mg·mL-1时对2种细胞均无明显毒性，细胞的平均生存率均大于90%，表明Gd-CDs兼具低毒性和优异的生物相容性，为其在生物领域的潜在应用提供了重要保障。
靶向配体是分子探针的核心组成部分，可使探针快速、正确定位于靶目标。HE4是一种新型的卵巢癌肿瘤标记物，正常情况下，HE4在人体正常组织的表达非常低，但在卵巢癌组织及卵巢癌患者血清中高表达[20]。自从2003年首次被报道与卵巢癌发生密切关系以来，HE4作为肿瘤标记物用于卵巢癌早期诊断及鉴别诊断的临床价值已得到广泛认可[21-22]。本研究将HE4单克隆抗体Anti-HE4偶联到Gd-CDs表面，以提升肿瘤靶细胞对纳米载体的吞噬，特异性地标记SKOV-3人卵巢癌细胞。为了评估纳米探针对卵巢癌细胞靶向成像的效果，分别将NIH-3T3和SKOV-3细胞用相同Gd浓度的Gd-CDs和Anti-HE4/Gd-CDs处理2 h后，进行细胞荧光成像和T1加权成像。荧光成像实验结果显示(图 5A)，SKOV-3卵巢癌细胞与Anti-HE4/Gd-CDs孵育后，呈明显的绿色荧光。在同样条件下，SKOV-3细胞的Gd-CDs组仅观察到微弱的荧光，说明Gd-CDs表面的Anti-HE4极大地增强了SKOV-3细胞对探针的摄取。而相同条件下，Anti-HE4/Gd-CDs及Gd-CD处理的NIH-3T3细胞均未观察到明显的荧光信号，说明所构建的Anti-HE4/Gd-CDs纳米探针可特异性地标记SKOV-3人卵巢癌细胞。细胞T1WI图显示(图 5B)，SKOV-3细胞与Anti-HE4/Gd-CDs作用后，细胞的T1信号增强，明显高于SKOV-3细胞的Gd-CDs组及NIH-3T3细胞组的信号强度。说明Anti-HE4/ Gd-CDs对SKOV-3卵巢癌细胞具有靶向作用，可应用于卵巢癌细胞靶向荧光-磁共振双模式成像。
肿瘤细胞的灵敏检测在肿瘤的诊断和治疗监测中起着至关重要的作用。为了进一步探索Anti-HE4/Gd-CDs对SKOV-3卵巢癌细胞的特异性生物传感方面的应用，对不同细胞浓度的荧光信号进行了定量研究。图 6表明，531 nm峰位处的信号强度(y)与SKOV-3细胞浓度(x)呈线性相关，线性相关系数(R)为0.990 1，回归方程为y=1.02x+80.99，最低检测限(LOD)为658 cell·mL-1(LOD=3σ/k，其中σ为空白样品信噪比，k为线性斜率)。
为了证实该纳米探针可用于实际样品中SKOV-3细胞的检测，我们利用加标法检测血浆中SKOV-3细胞的含量。结果如表 1所示，在血浆中加入已知浓度的SKOV-3细胞(最终浓度：5×104、1×105和2.5×105 cell·mL-1)，测得SKOV-3细胞的回收率分别为104.2%、96.8%和96.8%，表明所研制的生物探针适用于血液中SKOV-3细胞的定量检测。
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| Sample | Concentration of SKOV-3 / (cell·mL-1) | Recovery / % | RSD* / % | |
| Spike | Found | |||
| 1 | 5.0×104 | 5.21×104 | 104.2 | 3.6 |
| 2 | 1.0×105 | 9.68×104 | 96.8 | 3.1 |
| 3 | 2.5×105 | 2.46×105 | 98.4 | 2.8 |
| *RSD=relative standard deviation. | ||||
在本工作中，通过高温碳化法制备了具有绿色荧光和高T1弛豫率的荧光磁性双功能Gd-CDs，其具有低细胞毒性和优良的荧光性能。通过Gd-CDs偶联卵巢癌特异性抗体Anti-HE4，实现了卵巢癌细胞的磁共振-荧光靶向成像及定量检测，检测限为658 cell·mL-1，为卵巢癌及其他肿瘤的早期诊断以及实现细胞分子水平的精准医疗提供了理论和技术基础。
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图 1 Gd-CDs的形貌与组分表征: (A) TEM图; (B) 粒径分布图; (C) FTIR谱图; (D) XPS谱图
Figure 1 Morphology and composition characterization of Gd-CDs: (A)TEM image; (B) distribution profile of Gd-CDs; (C)FTIR spectrum; (D) full XPS spectrum
Inset: high-resolution TEM image of Gd-CDs.
图 2 制备的纳米探针的荧光与磁共振性能表征: (A) 不同激发条件下Gd-CDs的荧光光谱; (B) Gd-CDs的最佳荧光光谱和激发光谱; (C) Gd-CDs和Anti-HE4/Gd-CDs的荧光光谱图(激发波长: 420 nm); (D) Gd-CDs在不同浓度下的T1WI及1/T1与Gd浓度的线性相关; (E) CDs在不同浓度下的T1WI及1/T1与CDs质量浓度关系图
Figure 2 Fluorescence and magnetic resonance characterization of as-prepared nanoprobes: (A) fluorescence spectra of Gd-CDs under different excitation conditions.; (B) optimal fluorescence and excitation spectra of Gd-CDs; (C) fluorescence spectra of Gd-CDs and Anti-HE4/Gd-CDs (excitation wavelength: 420 nm); (D) T1WIs of Gd-CDs at different concentrations and the linear correlation between 1/T1 and Gd concentration; (E) T1WIs of CDs at different concentrations and the relationship between 1/T1 and CDs mass concentration
Inset: photos of Gd-CDs in daylight and ultraviolet light (365 nm); c: concentration of Gd; ρ: mass concentration of CDs.
图 3 Gd-CDs的稳定性: 储存时间对荧光强度(A)和T1 (B)的影响; 在pH=4~9溶液中荧光强度(C)和T1 (D)的变化
Figure 3 Stability of Gd-CDs: effect of storage time on the fluorescence intensity (A) and T1 (B) of Gd-CDs; the fluorescence intensity (C) and T1 (D) changes in the solution with pH=4-9
图 4 不同质量浓度的Gd-CDs分别对NIH-3T3 (A)和SKOV-3 (B)的体外细胞毒性
Figure 4 In vitro cytotoxicity of different mass concentrations of Gd-CDs on NIH-3T3 (A) and SKOV-3 (B) cells, respectively
图 5 SKOV-3和NIH-3T3细胞分别与Gd-CDs、Anti-HE4/Gd-CDs孵育2 h后的荧光成像图(A)和T1WIs (B)
Figure 5 Fluorescence images (A) and T1WIs (B) of SKOV-3 and NIH-3T3 cells after incubation with Gd-CDs and Anti-HE4/Gd-CDs, respectively
图 6 Anti-HE4/Gd-CDs与SKOV-3细胞孵育后的荧光性能: (A) 不同浓度细胞的荧光光谱图; (B) SKOV-3细胞浓度与荧光强度的线性拟合曲线
Figure 6 Fluorescence properties of Anti-HE4/Gd-CDs incubated with SKOV-3 cells: (A) fluorescence spectra of the cells with different concentrations; (B) Linear correlation between the fluorescence intensity and the concentration of SKOV-3 cells
表 1 Anti-HE4/Gd-CDs对血浆样品中SKOV-3细胞的检测
Table 1. Detection of SKOV-3 cells by Anti-HE4/Gd-CDs in plasma samples
| Sample | Concentration of SKOV-3 / (cell·mL-1) | Recovery / % | RSD* / % | |
| Spike | Found | |||
| 1 | 5.0×104 | 5.21×104 | 104.2 | 3.6 |
| 2 | 1.0×105 | 9.68×104 | 96.8 | 3.1 |
| 3 | 2.5×105 | 2.46×105 | 98.4 | 2.8 |
| *RSD=relative standard deviation. | ||||
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