English

• 0.   引言

  活性氧(reactive oxygen species，ROS)由于在生物体的各种生理和病理过程中扮演着重要角色，近年来引起了人们的广泛关注^[1-2]。次氯酸或次氯酸盐(HClO/ClO^-)是最重要的ROS之一^[3]，它是由中性粒细胞中的氯离子(Cl^-)和过氧化氢(H₂O₂)在髓过氧化物酶(MPO)的催化氧化反应中产生的^[4-5]。HClO是一种弱酸，在生理pH值下会部分解离成次氯酸根(ClO^-)^[6]。内源性HClO在免疫防御和炎症系统中发挥着重要作用^[7-8]。适量的HClO可以杀死入侵的微生物，维持细胞增殖的正常信号传导。然而，HClO浓度异常则可能会引发一些疾病，如囊性纤维化^[4]、肺损伤^[5]、类风湿性关节炎^[7]和某些癌症^[9]。因此，开发一种能够检测生物体内ClO^-的方法，对于进一步阐明其生理功能，具有十分重要的意义。

  近几十年来，有机小分子荧光探针因其高灵敏度、快速响应、高分辨率、低成本、实时检测、无创性以及对生物样品的良好兼容性，成为了一种备受关注的分析工具^[10-13]。一系列用于选择性检测次氯酸的小分子荧光探针被设计、合成^[14-16]。例如，杨丹教授团队基于次氯酸对2，6-二氯苯酚的选择性氧化，开发了一种具有超高选择性和超高灵敏度的荧光探针HKOCl-3^[15]。这种高灵敏度的探针可以更快地检测到目标分子的存在或变化，从而加速检测过程、提高检测的准确性。易涛教授及其团队则首次采用脱甲酰化反应策略设计合成了一种近红外发射的荧光探针FDOCl-1，并成功用于活细胞内源性次氯酸的成像和定量检测^[16]。这种具有较大的发射波长(红光发射或者近红外发射)的荧光探针通常具有更深的组织穿透性、更好的空间定位、更低的自吸收和更低的光毒性^[17]，其在应用于生命系统时往往更具优势。此外，一些探针分子还具有较大的斯托克斯位移，它们能够有效分离入射光和荧光信号，使探针避免受到自吸收和自发荧光的干扰^[18-21]，在实际应用中可提高探针的检测效果。然而，许多探针分子难以同时具备上述优势，且面临着结构复杂、合成步骤繁琐的问题^[22-23]。因此，如何开发出结构简单、响应迅速且具有较大发射波长和斯托克斯位移的探针分子，以实现对活细胞中ClO^-的快速、实时检测，依然是一项重要挑战。

  巴比妥酸及其衍生物是十分常见的吸电子分子骨架，广泛存在于许多天然产物和药用活性分子中^[24]。4-(二甲氨基)肉桂醛也常作为改变分子光物理性质的强推电子结构而被广泛采用^[25]。我们受共轭双键氧化的启发^[26-27]，采用一步合成法，将4-(二甲氨基)肉桂醛(1)与1，3-二甲基巴比妥酸(2)骨架共价连接，构建了一种基于分子内电荷转移(ICT)机制的具有D-π-A结构的探针分子3。其通过与ClO^-的“氧化加成”来破坏探针的ICT进程，从而实现对ClO^-的特异性响应(图 1)。探针3表现出优异的传感性能，如红光发射、响应迅速(< 15 s)、良好的光稳定性、大斯托克斯位移、对ClO^-的高灵敏度和选择性，以及低的检测限(14 nmol·L^-1)等。此外，探针3还具有高细胞膜渗透性，表现出低细胞毒性，这为其应用于ClO^-的传感和细胞成像提供了有力支持。

  图 1

  

  图 1.  探针3的合成路线及其与ClO^-的相互作用示意图

  Figure 1.  Synthetic route of probe 3 and schematic diagram of its interaction with ClO^-

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  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  所用仪器为Cary Eclipse荧光分光光度计(美国Agilent公司)、Cary 5000紫外可见分光光度计(美国Varian公司)、AVANCE Ⅲ HD 600核磁共振波谱仪(美国Bruker公司)、2695/ZQ2000液质联用仪(美国Waters公司)、SuPerMax 3100型酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)、DMI4000B倒置荧光显微镜(德国Leica公司)。

  试剂1(纯度不低于99%))、2(纯度不低于99%)、谷胱甘肽(GSH，还原型，纯度不低于98%)、L-半胱氨酸(Cys，纯度不低于99%)和DL-同型半胱氨酸(Hcy，纯度不低于95%)购自北京伊诺凯科技有限公司。色谱纯四氢呋喃(THF，纯度不低于99.9%)及其他试剂购自天津福晨化学试剂厂。实验用水为二次蒸馏水。

  1.2   实验方法

  1.2.1   探针3的合成

  首先将化合物1(350 mg，2 mmol)溶解在20 mL的乙醇中，向其中加入化合物2(312 mg，2 mmol)。在底物完全消耗后，过滤得到粗品。然后通过柱色谱法(V_二氯甲烷∶V_甲醇=20∶1)提纯，得到深紫色固体3(532 mg，产率85%)。¹H NMR (600 MHz，DMSO-d₆)：δ 8.27(dd，J=14.9，12.4 Hz，1H)，8.06(d，J=12.4 Hz，1H)，7.68(d，J=14.9 Hz，1H)，7.57(d，J=8.8 Hz，2H)，6.80(d，J=8.8 Hz，2H)，3.19(s，6H)，3.07(s，6H)(图S1，Supporting information)。¹³C NMR(150 MHz，CDCl₃)：δ 163.19, 162.55, 158.85, 157.46, 153.23, 152.04, 132.37，123.63, 120.71，112.05，110.09，40.35，28.71，28.05(图S2)。HR-MS(ESI，m/z)：C₁₇H₂₀N₃O₃[M+H]⁺计算值314.150 0，实验值314.150 8。

  1.2.2   各种潜在干扰物质的制备

  将各种阳离子分析物(包括K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺，平衡阴离子均为NO₃^-)、阴离子分析物(包括HSO₃^-、S^2-、SO₃^2-、Cl^-，平衡阳离子均为Na⁺)、Cys、Hcy、GSH等首先配成浓度为0.01 mol·L^-1的储备溶液，再使用磷酸盐缓冲溶液(PBS，10 mmol·L^-1，pH=7.4)稀释以获得对应浓度的测试液。ROS包括H₂O₂、ONOO^-、·OH、¹O₂、ClO^-、^tBuOO·。首先使用0.01 mol·L^-1的NaOH适当稀释NaClO溶液，然后根据292 nm处的摩尔消光系数(350 L·mol^-1·cm^-1)测定吸光度以确定ClO^-的浓度。¹O₂通过在ClO^-中加入H₂O₂原位产生。过氧亚硝酸离子(ONOO^-)是由H₂O₂和NaNO₂化学反应产生，ONOO^-的浓度通过302 nm处的摩尔消光系数(1 670 L·mol^-1·cm^-1)用吸光度来估算。羟基自由基(·OH)由Fenton反应产生(c_Fe²⁺∶c_H2O2=1∶10)，·OH的浓度等于Fe²⁺的浓度。所用叔丁基过氧化氢(^tBuOOH)为5%的水溶液。H₂O₂则直接在水中适当地稀释，其浓度根据240 nm处的摩尔消光系数(43.6 L·mol^-1·cm^-1)测定吸光度后确定。

  1.2.3   检测限的计算

  检测限(LOD)由滴定实验获得。探针3(10 μmol·L^-1)的所有荧光测量都进行了3次。LOD计算公式为LOD=3σ/K，其中σ是空白样品的标准偏差(5次)，K是荧光强度与c_ClO^-之间关系的拟合直线的斜率。

  1.2.4   MTT毒性检测

  HepG2细胞株首先在包含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中传代培养至对数生长期，经胰酶消化后(4×10⁴ mL^-1)接种至96孔板中(180 μL)，并在37 ℃、φ_CO2=5%的培养箱中继续培养24 h。随后，去除原有培养基，将20 μL的不同浓度的探针3用新的培养基(180 μL)稀释至目标浓度(0、10、20、30、40和50 μmol·L^-1)，并加入到培养的HepG2细胞中，继续培养12、24、48 h。去除原有培养基后，用PBS洗涤3次，并更换新的培养基(180 μL)，然后加入20 μL的噻唑兰(MTT，5 mg·mL^-1)，继续培养4 h。离心(2 000 r·min^-1，5 min)，去除上清液。随后每孔加入150 μL的DMSO，在微型振荡器上低速振荡10 min，以完全溶解甲臜晶体。最后，使用酶标仪在570 nm波长下测量其光密度(OD)值。

  1.2.5   细胞荧光成像

  采用HepG2细胞进行外源性ClO^-的荧光成像实验，实验分为3组：第一组：将HepG2细胞加入0.4 μmol·L^-1的探针3，与其作用30 min后进行观察。第二组：首先将HepG2细胞加入0.4 μmol·L^-1的探针3，与其作用30 min，然后继续加入44 μmol·L^-1 ClO^-，继续作用30 min后再进行观察。第三组：先将HepG2细胞与0.4 μmol·L^-1的探针3作用30 min，然后加入44 μmol·L^-1抗坏血酸(VC)，培养30 min，最后加入44 μmol·L^-1 ClO^-，与其作用30 min后进行观察。所有实验细胞在观察前均使用PBS洗涤3次，最后在Leica DMI4000B上进行荧光成像。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针对次氯酸的选择性响应

  2.1.1   探针对ClO^-的紫外可见吸收光谱的选择性响应

  我们首先测试了探针3对不同的活性氧和其他生物体内常见分析物的响应性，包括^tBuOO·、¹O₂、H₂O₂、ClO^-、·OH、ONOO^-，以及HSO₃^-、S^2-、SO₃^2-、Cl^-、Cys、GSH、Hcy、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺。如图 2a所示，探针溶液呈现的深紫色随着各种其他分析物的加入并没有明显变化，只有在加入ClO^-的溶液后，在相同条件下变为了无色。这一结果表明，探针3能够选择性地与ClO^-相互作用，并且可以用裸眼将其与其他活性氧等分析物区分开来。进一步地，我们利用紫外可见吸收光谱测试了探针与各种活性氧的相互作用(图 2b)。其中，含ClO^-的溶液吸光度下降明显，几乎降为零。含ONOO^-的溶液吸光度减少了近一半，而其他活性氧对探针溶液的吸光度则影响很小。该结果表明，探针3对ClO^-具有良好的选择性。此外，探针3的吸光度与ClO^-浓度呈线性相关。如图 2c所示，探针3在550 nm处的吸光度随着ClO^-浓度的增加而逐渐降低，线性相关系数为0.981 9(图 2c插图)。因此，该探针可利用紫外可见吸收光谱实现对ClO^-的定量分析与检测。

  图 2

  

  图 2.  (a) 探针3在自然光下对各种分析物的颜色变化图片; (b) 探针3在加入ClO^-和其他ROS后的紫外可见光谱和(c) 在加入各种浓度的ClO^-后的紫外可见光谱

  Figure 2.  (a) Color responses of probe 3 to various analytes under natural light; (b) UV-Vis spectra of probe 3 after adding ClO^- and other ROS and (c) after adding various concentrations of ClO^-

  pH=7.4, 50% THF, c₃=10 μmol•L^-1, canalyte=1.1 mmol•L^-1; Inset: plot of absorbance vs c_ClO^- for probe 3.

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  2.1.2   探针对ClO^-的选择性荧光响应

  在后续研究中，我们进一步探究了探针3对各种分析物的荧光响应(图 3)。在紫外光(365 nm)照射下，探针3呈现出明亮的玫瑰色荧光。然而，在加入1.1 mmol·L^-1的ClO^-后，该荧光被迅速猝灭。相比之下，加入其他分析物后，探针的荧光几乎未发生变化(图 3a)。为了更详细地量化探针3对不同分析物的响应，我们获取了相应的荧光光谱。显然，加入1.1 mmol·L^-1的ClO^-后，荧光发射被迅速抑制。相比之下，加入其他分析物(1.1 mmol·L^-1)后，探针在628 nm的荧光强度几乎未变或仅轻微减弱(图 3b)。这表明，探针3未与这些分析物发生反应，或者反应速率非常缓慢，即探针3对ClO^-具有较高的选择性。此外，我们还评估了探针3对各种分析物的抗干扰能力。从图 3c的柱状图中可以看出，这些物质对于ClO^-的检测干扰性较小。

  图 3

  

  图 3.  (a) 探针3与各种分析物在紫外光(λ=365 nm)下的照片; (b) 探针3加入ClO^-和其他分析物后的发射光谱及(c) 相应的各种分析物的荧光强度比(I₀/I)柱状图

  I₀ is the initial fluorescence intensity, and I is the fluorescence intensity upon adding various analytes; c₃=10 μmol·L^-1, c_analyte=1.1 mmol·L^-1, λ_ex=470 nm.

  Figure 3.  (a) Photos of probe 3 (10 μmol·L^-1) with various analytes under UV light (λ=365 nm); (b) Emission spectra of probe 3 after adding ClO^- and other analytes and (c) corresponding fluorescence intensity ratio (I₀/I) histogram of various analytes

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  2.2   探针对次氯酸的灵敏度分析

  如图 4a所示，通过监测探针3(10 μmol·L^-1)在不同浓度的ClO^-存在时的荧光强度，我们仔细评估了探针对ClO^-的敏感度。可以看到，随着ClO^-浓度的增加，探针的荧光强度持续下降。在加入1.1 mmol·L^-1的ClO^-后，其荧光发射几乎被完全抑制。荧光强度与ClO^-的浓度密切相关，线性相关系数R²为0.992 2(图 4b)，这可用于ClO^-的定量。根据定义得到的检测限LOD为14 nmol·L^-1，这比先前报道的许多HClO探针^[27-28]都低得多。

  图 4

  

  图 4.  (a) 探针3的荧光光谱随ClO^-浓度的变化; (b) 探针3在628 nm处的荧光强度与ClO^-浓度的关系

  Figure 4.  (a) Change of the fluorescence spectrum of probe 3 with the concentration of ClO^-; (b) Fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 as a function of the concentration of ClO^-

  c₃=10 μmol•L^-1, λ_ex=470 nm.

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  2.3   探针的响应速率和光稳定性

  为了研究探针3和ClO^-之间的反应动力学，在ClO^-存在时，我们对不同照射时间下的探针荧光强度进行了观测。如图 5a所示，荧光猝灭过程在15 s内完成，并且随着反应时间的延长，荧光强度保持不变。这表明探针3和ClO^-之间的反应非常迅速，而且反应产物很稳定。此外，我们还研究了探针3的荧光光稳定性。在470 nm处连续激发12次后(每次10min)，探针3溶液的荧光强度变化很小，仅略有下降(图 5b)，表明探针3在水溶液中具有良好的光稳定性。这些特性使其成为一个适合用于生物分析的荧光探针。

  图 5

  

  图 5.  (a) 加入ClO^-后，探针3在628 nm处的荧光强度随时间的变化; (b) 探针3在628 nm处的荧光强度对激发时间作图

  Figure 5.  (a) Time-dependent fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 in the presence of ClO^-; (b) Fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 as a function of the excitation time

  c₃=10 μmol•L^-1, c_ClO^-=1.1 mmol•L^-1, λ_ex=470 nm.

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  2.4   pH对探针3的荧光发射影响

  我们继续评估了pH对探针3荧光发射的影响，以探讨其在生物体内应用的可能性。在无ClO^-存在、pH=6.0~9.0的范围内时，探针的荧光强度变化较小(图 6)，这满足了在生理条件下(pH=7.4)进行实验的必备条件。而当pH < 6时，探针的荧光强度明显下降，这可能是由于探针中二甲氨基的N原子被质子化，转变为吸电子基团，从而破坏了ICT进程。然而，在pH > 9时，探针的荧光强度也开始下降，这可能是由于过量的OH^-与巴比妥酸衍生物的羰基发生了亲核加成，从而破坏了其吸电子特性，阻断了ICT进程。在ClO^-存在时，探针在pH=6.0~9.0的范围内荧光仍被全部猝灭，这表明在生理pH条件下对ClO^-的检测不会受到明显影响，这一结果鼓舞了我们进一步进行生物体内的ClO^-检测研究。

  图 6

  

  图 6.  ClO^-存在和不存在时，pH对探针3在628 nm处的荧光强度的影响

  Figure 6.  Effect of pH on the fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 in the absence and presence of ClO^-

  c₃=10 μmol·L^-1, c_ClO^- =1.1 mmol·L^-1, λ_ex=470 nm.

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  2.5   响应机理

  为了深入探究探针对ClO^-的响应机理，我们利用液质联用(HLPC-HRMS)技术对加入ClO^-(1.1 mmol·L^-1)前后的探针3(10 μmol·L^-1)溶液进行了分析(图 7和S3)，以确认可能的氧化产物。在加入ClO^-之前，我们将质谱图中位于m/z 314.150 8和336.132 4的离子峰归属为[3+H]⁺和[3+Na]⁺(图 7a)，这进一步确认了探针分子的结构。同时我们也对加入ClO^-后不同液相保留时间的色谱峰进行了质荷分析，将m/z 348.156 0、370.137 8、150.091 6、172.073 1、219.037 1和235.012 0的峰分别归属为[6+H]⁺、[6+Na]⁺、[7+H]⁺、[7+Na]⁺、[8+Na]⁺和[8+K]⁺(图 7b~7d)。这表明，在加入1.1 mmol·L^-1的ClO^-后，探针3与ClO^-发生了氧化加成反应，主要生成了加成产物4。由于4不稳定，很快脱除一分子HCl，形成环氧化合物5。5仍然不稳定，紧接着发生水解生成邻羟基化合物6，6最终被ClO^-彻底氧化生成终产物7和8。这个反应机理与先前文献报道中的ClO^-氧化加成机理相符^[26-28]。因此，我们在图 8中提出了探针3与ClO^-可能的反应机理示意图。

  图 7

  

  图 7.  探针3在加入ClO^-前(a)后(b、c、d)的ESI-MS谱图

  Figure 7.  ESI-MS spectra of probe 3 before (a) and after (b, c, d) adding ClO^-

  c₃=10 μmol•L^-1, c_ClO^-=1.1 mmol•L^-1.

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  图 8

  

  图 8.  探针3和ClO^-可能的反应机理示意图

  Figure 8.  Possible reaction mechanism of probe 3 with ClO^-

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  2.6   探针的活细胞成像

  2.6.1   细胞毒性实验

  我们首先采用MTT法评估了探针3对HepG2细胞的毒性。用不同浓度的探针(0、10、20、30、40和50 μmol·L^-1)分别处理HepG2细胞12、24和48 h，然后再分别测量细胞存活率(cell viability)。如图 9所示，我们可以看到探针3处理细胞12、24和48 h后，表现的细胞毒性很低。在加入10 μmol·L^-1的探针3到细胞培养液中时，细胞存活率在各个时间段均保持在90%以上。当探针3的浓度达到40 μmol·L^-1时，在12和48 h实验组的细胞存活率也都高于85%。这些结果表明，探针3具有较低的细胞毒性，具有应用于活细胞成像的潜力。

  图 9

  

  图 9.  不同浓度探针3的细胞毒性评估

  Figure 9.  Cytotoxicity evaluation of probe 3 at different concentrations

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  2.6.2   活细胞成像实验

  基于上述研究，为了深入探索探针3在生物领域的应用潜力，我们对其在HepG2细胞中的成像效果进行了研究。首先，我们将HepG2细胞与0.4 μmol·L^-1的探针3一同培养30 min，观察到培养后的细胞展现出强烈的荧光信号(图 10b)，这表明该探针可用于活细胞成像。当使用44 μmol·L^-1的ClO^-处理经探针3培养过的活细胞时，细胞内的荧光则完全消失(图 10e)。然而，当VC作为ClO^-的抗氧化剂存在时^[31]，再加入ClO^-则不能使探针3的荧光猝灭(图 10h)。这表明，探针3在活细胞中可以通过荧光猝灭对ClO^-作出有效反应。明场照片(图 10a、10d和10g)显示，在使用探针3和ClO^-处理后，HepG2细胞依然具有活力，进一步表明了探针对细胞的毒性较低。叠加场照片(图 10c和10i)显示，荧光信号位于细胞内区域，表明探针3具有良好的细胞膜通透性。这些发现为探针3在生物领域的应用提供了有力的支持。

  图 10

  

  图 10.  HepG2细胞的荧光照片: (a、b、c) 使用0.4 μmol•L^-1探针3培养30 min的细胞; (d、e、f) 使用44 μmol•L^-1 ClO^-继续培养30 min; (g、h、i) 先用VC培养细胞30 min, 再使用44 μmol•L^-1 ClO^-继续培养30 min

  Figure 10.  Fluorescence photographs of HepG2 cells: (a, b, c) cells incubated for 30 min using 0.4 μmol•L^-1 probe 3; (d, e, f) continued incubation for 30 min using 44 μmol•L^-1 ClO^-; (g, h, i) first incubated with VC for 30 min and then continued incubation for 30 min using 44 μmol•L^-1 ClO^-

  Bright field (a, d, g); Merged image (c, f, i).

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  3.   结论

  以4-(二甲基氨基)肉桂醛(1)为电子供体、1，3-二甲基巴比妥酸(2)为电子受体，成功一步合成了一种基于D-π-A结构的新型比色和荧光双响应性红光发射荧光探针3。该探针可以实现对ClO^-的裸眼比色检测，同时表现出对ClO^-的快速荧光关闭响应(约15 s)。探针对ClO^-展现出高的选择性和敏感性，具有很好的抗干扰能力，检测限低至14 nmol·L^-1。荧光强度与ClO^-的浓度线性相关，R²=0.992 2，可用于ClO^-的定量。该探针的荧光猝灭机制可能是ClO^-对碳碳双键的亲电加成和氧化裂解，最终破坏了探针分子D-π-A结构的ICT进程。此外，该探针具有较大的斯托克斯位移，在生理pH下表现出低细胞毒性和高细胞膜渗透性，可用于活细胞的荧光成像，具有进一步应用于生物成像领域的潜力。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
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  图 1  探针3的合成路线及其与ClO^-的相互作用示意图

  Figure 1  Synthetic route of probe 3 and schematic diagram of its interaction with ClO^-

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  图 2  (a) 探针3在自然光下对各种分析物的颜色变化图片; (b) 探针3在加入ClO^-和其他ROS后的紫外可见光谱和(c) 在加入各种浓度的ClO^-后的紫外可见光谱

  Figure 2  (a) Color responses of probe 3 to various analytes under natural light; (b) UV-Vis spectra of probe 3 after adding ClO^- and other ROS and (c) after adding various concentrations of ClO^-

  pH=7.4, 50% THF, c₃=10 μmol•L^-1, canalyte=1.1 mmol•L^-1; Inset: plot of absorbance vs c_ClO^- for probe 3.

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  图 3  (a) 探针3与各种分析物在紫外光(λ=365 nm)下的照片; (b) 探针3加入ClO^-和其他分析物后的发射光谱及(c) 相应的各种分析物的荧光强度比(I₀/I)柱状图

  Figure 3  (a) Photos of probe 3 (10 μmol·L^-1) with various analytes under UV light (λ=365 nm); (b) Emission spectra of probe 3 after adding ClO^- and other analytes and (c) corresponding fluorescence intensity ratio (I₀/I) histogram of various analytes

  I₀ is the initial fluorescence intensity, and I is the fluorescence intensity upon adding various analytes; c₃=10 μmol·L^-1, c_analyte=1.1 mmol·L^-1, λ_ex=470 nm.

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  图 4  (a) 探针3的荧光光谱随ClO^-浓度的变化; (b) 探针3在628 nm处的荧光强度与ClO^-浓度的关系

  Figure 4  (a) Change of the fluorescence spectrum of probe 3 with the concentration of ClO^-; (b) Fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 as a function of the concentration of ClO^-

  c₃=10 μmol•L^-1, λ_ex=470 nm.

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  图 5  (a) 加入ClO^-后，探针3在628 nm处的荧光强度随时间的变化; (b) 探针3在628 nm处的荧光强度对激发时间作图

  Figure 5  (a) Time-dependent fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 in the presence of ClO^-; (b) Fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 as a function of the excitation time

  c₃=10 μmol•L^-1, c_ClO^-=1.1 mmol•L^-1, λ_ex=470 nm.

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  图 6  ClO^-存在和不存在时，pH对探针3在628 nm处的荧光强度的影响

  Figure 6  Effect of pH on the fluorescence intensity at 628 nm of probe 3 in the absence and presence of ClO^-

  c₃=10 μmol·L^-1, c_ClO^- =1.1 mmol·L^-1, λ_ex=470 nm.

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  图 7  探针3在加入ClO^-前(a)后(b、c、d)的ESI-MS谱图

  Figure 7  ESI-MS spectra of probe 3 before (a) and after (b, c, d) adding ClO^-

  c₃=10 μmol•L^-1, c_ClO^-=1.1 mmol•L^-1.

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  图 8  探针3和ClO^-可能的反应机理示意图

  Figure 8  Possible reaction mechanism of probe 3 with ClO^-

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  图 9  不同浓度探针3的细胞毒性评估

  Figure 9  Cytotoxicity evaluation of probe 3 at different concentrations

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  图 10  HepG2细胞的荧光照片: (a、b、c) 使用0.4 μmol•L^-1探针3培养30 min的细胞; (d、e、f) 使用44 μmol•L^-1 ClO^-继续培养30 min; (g、h、i) 先用VC培养细胞30 min, 再使用44 μmol•L^-1 ClO^-继续培养30 min

  Figure 10  Fluorescence photographs of HepG2 cells: (a, b, c) cells incubated for 30 min using 0.4 μmol•L^-1 probe 3; (d, e, f) continued incubation for 30 min using 44 μmol•L^-1 ClO^-; (g, h, i) first incubated with VC for 30 min and then continued incubation for 30 min using 44 μmol•L^-1 ClO^-

  Bright field (a, d, g); Merged image (c, f, i).

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