English

• 0.   引言

  随着纳米技术的蓬勃发展，磁性纳米材料^[1-3]由于其优异的磁响应性、良好的生物安全性及易于表面修饰等特点，被广泛用于磁共振成像、磁靶向药物递送^[4]和肿瘤热疗等领域，Fe₃O₄由于其超顺磁性且广泛易得成为纳米医药领域研究的热点。2007年，Fe₃O₄被发现具有类过氧化物酶(POD)催化活性，这一研究发现更为其注入了新的活力^[5]，随后，相继报道的类过氧化氢酶(CAT)^[6]、超氧化物歧化酶(SOD)^[7]的活性，也为肿瘤的诊断和治疗带来了更多新的可能。

  近年来，肿瘤饥饿疗法通过切断肿瘤细胞的营养来源，有效抑制肿瘤细胞的生长和扩散，并且联合化疗、光动力治疗协同增强抗肿瘤效果，引起了研究者们的广泛关注^[8-10]。在肿瘤的饥饿治疗及协同治疗中，基于葡萄糖氧化酶(GOx)的纳米治疗剂，以O₂为电子受体，专一地催化β-D-葡萄糖形成葡萄糖酸^[11]和H₂O₂，从而实现葡萄糖的快速消耗。这种方法具有安全性高、可控性好的优势，因此具有巨大的应用前景。然而，这一过程以消耗O₂为前提，鉴于实体瘤中固有的缺氧条件，GOx介导的肿瘤饥饿疗法的效率受到了O₂供应不足的限制。为了解决肿瘤细胞中乏氧的问题，更好地发挥肿瘤饥饿治疗效果，我们将纳米Fe₃O₄类CAT的活性引入GOx催化葡萄糖的反应体系中，构建Fe基氧化物纳米平台^[12]，以纳米Fe₃O₄催化H₂O₂分解产生氧气，再将此反应产生的溶解氧引入到消耗葡萄糖的氧化反应中，以补充GOx催化葡萄糖氧化分解快速消耗的氧气。这种设计可以使葡萄糖的氧化分解反应可循环持续进行，从而在肿瘤微环境^[13-14]中消耗大量的葡萄糖，切断肿瘤营养物质供应，阻碍肿瘤血管生长，“饿死”肿瘤细胞，达到肿瘤饥饿治疗的效果。另外，GOx催化葡萄糖氧化分解产生的葡萄糖酸，强化了肿瘤细胞的弱酸性条件，使氧化铁纳米颗粒(IONPs)类CAT和类POD的催化性能活化，促进高浓度活性氧的产生，进一步造成肿瘤细胞内蛋白和DNA^[15]的损伤，最终使得肿瘤细胞损伤后凋亡。因此，将纳米Fe₃O₄应用于肿瘤饥饿治疗中，不仅能解决饥饿治疗中肿瘤细胞的乏氧限制，而且还具有协同化学动力学^[16-17]治疗的作用。

  本实验采用氧化共沉淀法成功制备了纳米Fe₃O₄，随后将其加入至GOx催化葡萄糖的反应体系中，成功实现了体外模拟肿瘤饥饿治疗的过程(图 1)。首先在纳米Fe₃O₄催化H₂O₂的体系中，验证了纳米Fe₃O₄的类CAT活性；接着，利用GOx催化葡萄糖的反应体系模拟体内饥饿治疗环境，以探究氧化铁催化葡萄糖分解的最适宜pH值和浓度，同时考察了其类POD活性所产生的活性氧^[18-20]；最后，利用体外模拟实验，验证了Fe₃O₄在协同肿瘤饥饿治疗中的效果。

  图 1

  

  图 1.  磁性纳米Fe₃O₄的氧化共沉淀法制备及催化性能在模拟肿瘤饥饿治疗中的应用示意图

  Figure 1.  Schematic diagram of oxidization co-precipitation preparation and catalytic performance of magnetic nano iron oxide in simulated tumor starvation therapy

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  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  硫酸亚铁铵购自天津市华盛化学试剂有限公司；葡萄糖(GS)购自天津市富宇精细化工有限公司；GOx购自上海麦克林生化科技有限公司；3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)购自福州飞净生物科技有限公司。溶解型氧测量仪(JPB-607A)购自上海仪电科学仪器股份有限公司。紫外可见分光光度计(UV-8000)购自上海元析仪器有限公司。采用JEOL2010高分辨透射电子显微镜(TEM)观察纳米Fe₃O₄在真空状态下的形态、分布状态和粒子大小，其加速电压为200 kV。使用X射线衍射仪(XRD，D/max 2400 X-diffractometer)表征材料的结晶性能，采用Cu靶(λ=0.154 06 nm)，石墨单色器，工作电压40 kV，工作电流30 mA，扫描范围20°~80°，数据采集时间6 min，并将样品X射线衍射峰与晶体数据库卡片数据进行比对。使用超导量子干涉仪对样品进行了磁滞回线的测定。

  1.2   纳米Fe₃O₄的制备

  称量0.5 g硫酸亚铁铵粉末，倒入三颈烧瓶中，再加10.0 mL去离子水，磁力搅拌条件下使之完全溶解。将H₂O₂溶液(0.4%，10.0 mL)和硫酸(1.0 mL，2 mol·L^-1)同时以每秒2~3滴的速度滴加到三颈烧瓶中。在50 ℃条件下，再将氢氧化钠溶液(6 mol·L^-1，2.0 mL)加入上述反应液中。继续反应10 min后停止加热和搅拌。再静置冷却10 min，可观察到有黑色固体析出，然后用磁铁进行固液分离，95%无水乙醇进行洗涤，所得黑色粉末为纳米Fe₃O₄。

  1.3   纳米Fe₃O₄类CAT催化性能的测定

  分别取1 mg纳米Fe₃O₄超声分散于pH为5.0、6.0、7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，利用溶氧仪记录溶液中溶解氧含量，待示数稳定后加入600 μL 30%的H₂O₂溶液，每隔1 min记录溶氧仪示数，持续记录10 min内体系中溶解氧含量的变化。取3份纳米Fe₃O₄(1、2、3 mg)分别超声分散于pH=6.0、5 mL(10 μg·mL^-1)的GOx溶液中，分别与15 mL(5 mg·mL^-1)葡萄糖溶液(pH=6.0)在25 ℃条件下混合，每隔1 min记录溶解氧含量，直至示数趋于平稳。重新取3份(每份1 mg)纳米Fe₃O₄，分别超声分散于5 mL(pH=5.0、6.0、7.0)的10 μg·mL^-1的GOx溶液中，分别与15 mL(5 mg·mL^-1)相应pH值的葡萄糖溶液在25 ℃条件下混合，每隔1 min记录溶解氧含量，直至示数趋于平稳。

  1.4   纳米Fe₃O₄类POD催化性能的测定

  酶溶液的配制：将纳米Fe₃O₄超声分散在水中，浓度根据纳米Fe₃O₄活性配制。TMB溶液的配制：TMB盐酸盐用水配制成10 mmol·L^-1工作液备用。H₂O₂溶液的配制：将H₂O₂用水稀释为100 mmol·L^-1备用。参比对象：将100 μL的水、TMB溶液和H₂O₂溶液加入pH为5.0的PBS中，用移液枪每次抽取100 μL溶液润洗比色皿3次，之后加入100 μL溶液至比色皿，调节波长，测量3次取平均值记为A₀。将100 μL的酶溶液，TMB溶液和H₂O₂溶液分别加入pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的PBS中(终浓度相当于工作液浓度十分之一)，涡旋均匀后于37 ℃反应3 min，然后在波长652 nm处以去离子蒸馏水为参比分别测定吸光度值A_i；求ΔA=A₀-A_i，然后按式1求得体系中·OH的表观生成率(R_ag)，即

  $ R_{\mathrm{ag}}=\left(\Delta A/A_0\right) \times 100 \% $

  (1)

  2.   结果与讨论

  2.1   纳米Fe₃O₄的形貌组成与磁性表征

  样品的形貌表征结果如图 2A所示。可见，制备所得样品为均匀球形，尺寸约为7 nm，分散性较好。含有样品的固液混合物在磁铁作用下，可观察到明显的固液分离，所得产物外观为黑色粉末。根据图 2A测量样品尺寸，样品的粒径分布己绘制在图 2A插图中。样品的XRD图如图 2B所示，其衍射峰与PDF No.33-0664卡片相一致，说明样品的物相组成为Fe₃O₄。磁滞回线测定结果如图 2C所示，样品的饱和磁化强度73.7 emu·g^-1，且剩磁为0，可见产物具有超顺磁性。

  图 2

  

  图 2.  (A) 样品的TEM图(插图: 样品的粒径分布图)、(B) XRD图、(C) 磁滞回线图

  Figure 2.  (A) TEM image (Inset: particle size distribution of the samples), (B) XRD pattern, (C) hysteresis loop of the sample

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  2.2   纳米Fe₃O₄的类CAT活性

  不同的pH条件下，纳米Fe₃O₄(1 mg·mL^-1)的类CAT活性即催化H₂O₂分解产生氧气反应的实验结果如图 3A所示。pH=6.0时，溶解氧含量从11.9 mg·mL^-1迅速增加至15.1 mg·mL^-1，这表明纳米Fe₃O₄在pH=6.0时展现出优异的类CAT活性。不同浓度的纳米Fe₃O₄助力GOx催化葡萄糖溶液中的溶解氧变化如图 3B所示。在25 ℃，pH=6.0的条件下，随着纳米Fe₃O₄浓度的逐步提升，溶解氧浓度的最大下降值逐渐增大，最高可达95.4%的显著降幅，但与此同时，溶解氧下降速率却呈现出减缓的趋势。由图可见，纳米Fe₃O₄浓度为3 mg·mL^-1时，体系中溶解氧含量下降最多，纳米Fe₃O₄的催化活性最好。其原因是，随着纳米Fe₃O₄浓度的增加，催化位点也随之增多，这导致在相同时间内催化H₂O₂产生的氧气含量增多，从而加速了葡萄糖被氧化的过程，使其被氧化的程度更大。鉴于1 mg·mL^-1纳米Fe₃O₄催化反应速率较为平缓，所以当探究其他反应条件对葡萄糖氧化反应速率的影响时，反应速率受纳米Fe₃O₄浓度的影响较小，从而便于观察其他反应条件对葡萄糖氧化反应速率和反应限度的影响。因此选择1 mg·mL^-1纳米Fe₃O₄作为对比研究的实验条件。

  图 3

  

  图 3.  (A) 不同pH下纳米Fe₃O₄催化H₂O₂分解的溶解氧变化曲线; (B) 不同浓度下纳米Fe₃O₄助力GOx催化葡萄糖溶液的溶解氧变化曲线; (C) 不同pH条件下GOx和纳米Fe₃O₄助力GOx催化葡萄糖溶液的溶解氧变化曲线

  Figure 3.  (A) Dissolved oxygen change curve of H₂O₂ decomposition catalyzed by nano Fe₃O₄ with different pH values; (B) Dissolved oxygen change curve in glucose solution catalyzed by GOx assisted by nano Fe₃O₄ with different concentrations; (C) Dissolved oxygen change curve in glucose solution catalyzed by GOx assisted by nano Fe₃O₄ with different pH

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  在模拟肿瘤饥饿治疗条件下，纳米Fe₃O₄的类CAT活性可用GOx催化葡萄糖的氧化反应来验证。在不同的pH条件下纳米Fe₃O₄(1 mg·mL^-1)助力GOx催化葡萄糖溶液中的溶解氧变化如图 3C所示。随着pH值的降低，溶解氧含量降低的幅度增大，这说明在酸性条件下葡萄糖分解程度增加。模拟肿瘤微环境pH=5的条件下，葡萄糖分解在只有GOx作用下，反应达平衡时溶解氧含量从9.0 mg·L^-1下降到6.2 mg·L^-1且在15 min时趋于稳定；在纳米Fe₃O₄和GOx的双重催化下，pH=5时反应达平衡时溶解氧含量从6.0 mg·L^-1下降到1.0 mg·L^-1，且在40 min时趋于稳定。在反应速度方面，纳米Fe₃O₄和GOx的双重催化体系与GOx的单一催化体系相比，溶解氧消耗量随时间变化下降较快。反应达15 min时，纳米Fe₃O₄和GOx的双重催化的反应溶解氧消耗量明显多于GOx单一催化体系，说明双重催化条件下反应速率更快。15 min后，纳米Fe₃O₄和GOx的双重催化反应体系溶解氧含量继续降低，而GOx的单一催化体系溶解氧含量几乎不变。可能的原因是，在GOx单一催化体系中，随着反应进行，生成H₂O₂累积，其分解产生溶解氧速率缓慢，这导致了系统中溶解氧的供应不足，从而影响了葡萄糖氧化反应的速率，使其趋于缓慢。而纳米Fe₃O₄存在的双重催化体系，由于纳米Fe₃O₄可加速H₂O₂分解产生溶解氧，相当于为葡萄糖的氧化反应提供了“氧源”，因此带来了反应速率的增加。在葡萄糖分解限度方面，在15 min后，GOx的单一催化体系，由于反应产物H₂O₂的累积，使得反应正向进行的限度降低；而纳米Fe₃O₄和GOx的双重催化体系，纳米Fe₃O₄及时地将反应产物H₂O₂分解，产生溶解氧，降低了反应产物浓度，增加了反应物氧源浓度，使葡萄糖分解限度更大。因此，在肿瘤微环境pH=5的条件下，纳米Fe₃O₄对葡萄糖分解反应有助力反应速度增加及限度增大的作用。

  2.3   纳米Fe₃O₄的类POD活性

  Fe₃O₄(1 mg·mL^-1)的类POD活性利用TMB作为底物，催化H₂O₂和TMB发生氧化还原反应，产生蓝色的氧化TMB产物(TMBox)，从而检测纳米Fe₃O₄的类POD活性。紫外可见光谱全波长扫描实验结果如图 4A所示，652 nm处出现明显的特征吸收峰，说明TMBox的存在，证明纳米Fe₃O₄催化产生了活性氧。与天然酶类似，纳米Fe₃O₄的类POD活性受到pH因素影响。如图 4B所示，当pH=5.0时，纳米Fe₃O₄具有最强的催化活性，而在正常生理环境中其催化能力下降。可见，Fe₃O₄的类POD活性具有pH敏感性，在肿瘤细胞内微酸性条件下产生活性氧能力更强。恶性肿瘤周围组织的pH值通常介于6.5至7.0之间，某些特定类型的癌症，如肺癌、乳腺癌、宫颈癌等，周围组织的pH值可能会更低，甚至降至6.0以下。由于肿瘤细胞内部的pH值相较于胞外更低，因此在胞内纳米Fe₃O₄以类POD途径作用于H₂O₂产生活性氧，而胞外倾向于以类CAT途径作用于H₂O₂生成氧气。

  图 4

  

  图 4.  (A) 类POD活性测定的紫外可见光谱图; (B) 类POD活性随pH变化关系图

  Figure 4.  (A) UV-Vis spectrum for the determination of POD-like activity; (B) Relationship between POD-like activity and pH

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  3.   结论

  基于解决因肿瘤微环境内乏氧而导致葡萄糖氧化反应不彻底，从而限制肿瘤“饥饿疗法”推广的问题，以Fe²⁺作为单一铁源，采用氧化共沉淀法制备了尺寸7 nm的Fe₃O₄颗粒；在模拟肿瘤饥饿治疗条件下，对纳米Fe₃O₄类CAT、类POD活性进行了研究。结果表明纳米Fe₃O₄在1 mg·mL^-1、pH=5.0时能很好地推动葡萄糖氧化反应的反应速度增加、限度增大。在pH=5.0时，纳米Fe₃O₄的类POD活性更好，能高效率催化H₂O₂产生活性氧。本工作为Fe₃O₄在肿瘤的多模式治疗中的应用提供了新的思路，对于肿瘤“饥饿疗法”推广具有参考价值。

  
  
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  图 1  磁性纳米Fe₃O₄的氧化共沉淀法制备及催化性能在模拟肿瘤饥饿治疗中的应用示意图

  Figure 1  Schematic diagram of oxidization co-precipitation preparation and catalytic performance of magnetic nano iron oxide in simulated tumor starvation therapy

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  图 2  (A) 样品的TEM图(插图: 样品的粒径分布图)、(B) XRD图、(C) 磁滞回线图

  Figure 2  (A) TEM image (Inset: particle size distribution of the samples), (B) XRD pattern, (C) hysteresis loop of the sample

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  图 3  (A) 不同pH下纳米Fe₃O₄催化H₂O₂分解的溶解氧变化曲线; (B) 不同浓度下纳米Fe₃O₄助力GOx催化葡萄糖溶液的溶解氧变化曲线; (C) 不同pH条件下GOx和纳米Fe₃O₄助力GOx催化葡萄糖溶液的溶解氧变化曲线

  Figure 3  (A) Dissolved oxygen change curve of H₂O₂ decomposition catalyzed by nano Fe₃O₄ with different pH values; (B) Dissolved oxygen change curve in glucose solution catalyzed by GOx assisted by nano Fe₃O₄ with different concentrations; (C) Dissolved oxygen change curve in glucose solution catalyzed by GOx assisted by nano Fe₃O₄ with different pH

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  图 4  (A) 类POD活性测定的紫外可见光谱图; (B) 类POD活性随pH变化关系图

  Figure 4  (A) UV-Vis spectrum for the determination of POD-like activity; (B) Relationship between POD-like activity and pH

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