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• 0.   引言

  肾结石的主要成分是草酸钙(CaC₂O₄)晶体，约占70%。尿液中过饱和的CaC₂O₄在成核之后，会继续生长或聚集到病理性尺寸范围。但这些尿微晶只有在与受损伤的肾上皮细胞黏附后，才会滞留和进一步长大，最终形成结石^[1-2]。阻止CaC₂O₄晶体成核、生长、聚集和黏附中的任何一个过程，均可以有效地抑制肾结石的发生和复发^[3]。

  从化学的角度看，CaC₂O₄的过饱和度(RS)、Ca²⁺/Ox^2-化学计量比(n_Ca²⁺/n_Ox^2-，Ox^2-=C₂O₄^2-)、尿液中的促进剂和抑制剂等因素均会影响CaC₂O₄结石的形成。但至今为止，对这些问题仍然没有完全阐明。如尿液中的Ca²⁺和Ox^2-哪个影响更大?有结石的人是否需要少吃含钙物质?广东省肾结石高发肯定与长年温度较高的天气有关，出汗会导致尿液浓缩，CaC₂O₄的RS增大，尿抑制剂浓度和促进剂浓度均增加，但怎么预防至今没有较好的方法。

  植物多糖含有的大量酸性基团(如—OSO₃^-基和—COOH基)^[4-6]，这些酸性基团可以通过静电作用与尿液中的Ca²⁺配位，形成稳定的可溶性配合物，从而降低体系的RS；多糖吸附到晶体表面后还可以减弱晶体与肾上皮细胞的黏附^[7-8]；此外，植物多糖还可以修复受损伤的肾上皮细胞^[9]。这些作用均有利于降低肾结石的形成风险。

  茯苓是中医防石处方中的重要组分之一。茯苓多糖(PCP)是茯苓的重要活性成分^[10]。但天然PCP由于具有分子量大、分子体积大、水溶性较小及黏度高等特点，因此难以通过生物组织屏障进入细胞发挥生物活性^[11]。对天然PCP进行降解可以增强其生物活性。

  基于此，我们研究了CaC₂O₄的RS、n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP对CaC₂O₄晶体形成的影响，从抑制CaC₂O₄晶体成核、生长、聚集和黏附的角度，讨论了降低肾结石形成风险的条件，期望为进一步阐明CaC₂O₄肾结石形成机理、开发新型防石药物提供启示。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  PCP购自陕西慈缘生物有限公司，采用超声降解法^[12]对其进行降解，在超声功率600 W、超声频率40 kHz条件下超声30 min后，得到分子量(M)为2.5 kDa的降解PCP。分子量采用乌氏黏度法测定，并根据Mark-Houwink经验方程式[η]=κM^α计算；对于降解PCP，式中参数κ=1.49×10^-2，α=0.75^[13]，[η]为特性黏度。降解PCP中含有2.80%的—COOH基。详细的降解过程和多糖的结构表征将另文报道。Na₂C₂O₄和CaCl₂等其他常规试剂为分析纯，由广州化学试剂厂提供。

  主要仪器有傅里叶变换红外光谱仪(EQUINOX55，Bruker，德国)、X射线衍射仪(XRD，D/MAX-2400，Rigaku，日本)、场发射扫描电子显微镜(SEM，Ultra 55，ZEISS，德国)、电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP，Optima 2000DV，Perkin Elmer，USA)、拉曼光谱仪(LabRAM HR Evolution，HORIBA JY，法国)、紫外可见分光光度计(Cary 500，Varian，美国)、纳米粒度电位仪(Zetasizer Nano ZS，Malvern，英国)、超声仪(结盟JP-100S)、乌氏黏度计(毛细管内径为0.45 mm)。

  1.2   多糖调控CaC₂O₄晶体生长

  实验分为2组。A组：固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1，使n_Ca²⁺/n_Ox^2-=0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、12^[14]，即在一组50 mL容量瓶中分别加入0.375~36 mL的10 mmol·L^-1 CaCl₂、0.75 mL的0.50 mol·L^-1 NaCl(调节离子强度)，加二次蒸馏水至46 mL左右，然后加入3.0 mL 10 mmol·L^-1 Na₂C₂O₄，定容至刻度。B组：固定n_Ca²⁺/n_Ox^2-=1，改变c_Ox^2-和c_Ca²⁺，使溶液的RS对应上述各组实验，RS根据文献^[15]计算。将上述各组CaC₂O₄过饱和溶液快速转入50 mL烧杯中进行结晶，预先在烧杯底部放入处理好的基片。为防止由于溶剂水的挥发而造成体系过饱和驱动晶体形成，晶体生长在37 ℃的恒温密闭环境中进行。晶体生长3 d后，取出基片，置于干燥器中干燥。上清液用ICP检测可溶性Ca²⁺浓度。2组实验均同时进行对照组(没有多糖存在)和多糖组(质量浓度最终为0.5 g·L^-1)研究。

  1.3   CaC₂O₄晶体表征

  SEM表征：称取上述各组实验得到的CaC₂O₄晶体5 mg，超声10 min使其分散在10 mL无水乙醇中，分多次点样到石英基片上，经喷金处理后在SEM下观察晶体形貌。操作条件为高压5.00 kV，工作距离5~10 mm，放大倍数3×10³。

  XRD表征：采用X射线衍射仪检测上述基片上的晶体，测试条件为Cu Kα射线、波长0.154 16 nm、石墨单色器、30 kV、25 mA，扫描范围为10°~50°，扫描速度8 (°)·min^-1，步宽0.02 (°)·s^-1。晶体中的一水草酸钙(COM)和二水草酸钙(COD)的质量分数采用K值法^[16-17]计算，其中COD的质量分数：$w_{\mathrm{COD}}=\frac{I_{\mathrm{COD}}}{I_{\mathrm{COM}}+I_{\mathrm{COD}}} \times 100 \%$，式中I_COM和I_COD分别为COM的主衍射峰(101)晶面(d=0.593 nm)和COD的主衍射峰(200)晶面(d=0.618 nm)的强度。

  FT-IR表征：取2 mg已干燥的CaC₂O₄样品，与200 mg KBr充分混匀，用玛瑙研钵进行研磨后压片，红外光谱仪于4 000~400 cm^-1波数范围内扫描。

  拉曼光谱表征：取2 mg干燥的CaC₂O₄样品，采用拉曼分析仪器扫描，波数范围是1 800~100 cm^-1，激发波长为532 nm。

  ζ电位的测定：称取各晶体1 mg，超声10 min使其分散在3.0 mL纯水中，在恒温25 ℃采用纳米粒度电位仪检测。

  1.4   降解PCP对CaC₂O₄晶体成核、聚集的抑制作用

  在620 nm波长下，用紫外分光光度计检测30 min内溶液的浊度随时间的变化。通过对Ca²⁺和Ox^2-亚稳态溶液的光密度进行定量检测，并进行线性回归分析，得到降解PCP对CaC₂O₄晶体的成核抑制率和聚集抑制率^[18-19]，成核抑制率：N_m=[1-(S_p/S_c)]×100%，聚集抑制率：A_m=[1-(R_p/R_c)]×100%，其中成核速率S为吸光度随时间增加的最大斜率，主要反映新颗粒形成的最大速率；聚集速率R为吸光度随时间降低的最大斜率，代表新颗粒聚集的最大速率；S_p和R_p是存在降解PCP时的速率，S_c和R_c是空白实验时的速率。每个实验组平行检测2次。

  2.   结果

  2.1   不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下形成的CaC₂O₄晶体的XRD图

  采用XRD分析了不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下生成的CaC₂O₄晶体中COM和COD的质量分数(表 1)，代表性XRD图见图 1A。可以看出：固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1，在n_Ca²⁺/n_Ox^2-为0.25、1和4时，均只形成COM晶体；而在n_Ca²⁺/n_Ox^2-为8和12时，诱导了11.6%和38.3%的COD晶体形成。上述COM的衍射峰出现在2θ=14.88°、24.2°和30.16°处，分别归属于COM的(101)、(020)和(202)晶面；COD的衍射峰出现在2θ=14.28°、32.28°和40.28°处，分别归属于COD的(200)、(411)和(213)晶面^[20]。

  表 1

  

  表 1  不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-及0.5 g·L^-1降解PCP对CaC₂O₄晶体形成的影响

  Table 1.  Effects of different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values and 0.5 g·L^-1 degraded PCP on the formation of CaC₂O₄ crystals

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  cCa2+/(mmol·L-1)	cOx2-/(mmol·L-1)	nCa2+/nOx2-	RS*	I(101)/I(020) of COM	wCOD/%
  					Blank	Degraded PCP
  Group A: cOx2-=0.6 mmol·L-1, changing cCa2+
  0.075	0.6	0.125	4.7	1.88	0	13.8
  0.15	0.6	0.25	6.6	1.42	0	14.3
  0.3	0.6	0.5	9.4	1.31	0	16.7
  0.6	0.6	1	13.3	1.45	0	21.1
  1.2	0.6	2	18.8	1.49	0	25.4
  2.4	0.6	4	26.6	1.10	0	28.6
  4.8	0.6	8	37.6	0.35	11.6	40.8
  7.2	0.6	12	46	0.23	38.3	46.1
  Group B: cOx2-=cCa2+
  0.3	0.3	1	6.6	3.24	0	0
  0.42	0.42	1	9.4	2.45	0	23.3
  0.6	0.6	1	13.3	1.96	0	32.1
  0.85	0.85	1	18.8	1.56	0	18.2
  1.2	1.2	1	26.6	1.26	0	14.5
  1.7	1.7	1	37.6	0.59	0	11.3
  * Supersaturation (RS) was calculated according to the reference[15].

  图 1

  

  图 1.  不同条件下生成的CaC₂O₄晶体的XRD图: (A) 固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, 改变n_Ca²⁺/n_Ox^2-; (B) 固定c_Ox^2-=c_Ca²⁺, 改变溶液的RS

  Figure 1.  XRD patterns of CaC₂O₄ crystals generated under different conditions: (A) fixing c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, changing the n_Ca²⁺/n_Ox^2-; (B) fixing c_Ox^2-=c_Ca²⁺, changing RS of solution

  * Indicates the diffraction peaks of COD, and the others are the peaks of COM

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  当固定c_Ox^2-=c_Ca²⁺，改变体系的RS，形成的CaC₂O₄晶体的XRD图如图 1B所示。在RS=6.6~37.6范围内均只形成COM晶体(表 1)。但随着RS从6.6增加到13.3、26.6和37.6，COM不同晶面的强度出现规律性变化，I₍₁₀₁₎/I₍₀₂₀₎晶面强度比从3.24逐渐减小到1.96、1.26和0.59。

  2.2   降解PCP对CaC₂O₄晶体形成的影响

  XRD图结果表明，在上述体系中加入0.5 g·L^-1的降解PCP后，均促进了COD晶体形成(表 1)，其规律如下：

  (1) 固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1，随着n_Ca²⁺/n_Ox^2-从0.125增加到12，COD质量分数从13.8%增加到46.1%；相比之下，没有降解PCP存在时，只有当n_Ca²⁺/n_Ox^2-≥8时才有COD形成。

  (2) 固定n_Ca²⁺/n_Ox^2-=1，在RS=13.3，即c_Ox^2-=c_Ca²⁺=0.6 mmol·L^-1时形成的COD质量分数最高(32.1%)，高于或低于0.6 mmol·L^-1时均不利于COD的生成。

  2.3   不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-及降解PCP影响CaC₂O₄晶体形成的SEM观察

  如表 2所示，固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1且没有降解PCP存在时，随着n_Ca²⁺/n_Ox^2-从0.25逐渐增大至1、4、8和12，形成的晶体由表面光滑的拉长六边形COM逐渐转变为表面粗糙的COM，且晶体的尺寸和聚集程度均增大；当n_Ca²⁺/n_Ox^2-≥8时出现了少量十字形的COD晶体；即高Ox^2-浓度条件下只生成棱角尖锐的COM晶体，而高Ca²⁺浓度条件下出现COD晶体。

  表 2

  

  表 2  固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1时, n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP影响CaC₂O₄晶体形成的SEM图像

  Table 2.  SEM images for the effects of n_Ca²⁺/n_Ox^2- and degraded PCP on CaC₂O₄ crystal formation at fixed c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1

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  Group	nCa2+/nOx2- (RS)
  	0.25 (6.6)	1 (13.3)	4 (26.6)	8 (37.6)	12 (46)
  Control
  Degraded PCP

  加入降解PCP后，不但诱导了COD晶体生成，且COD质量分数随着n_Ca²⁺/n_Ox^2-增大而增加；此外，加入降解PCP后形成的COM晶体的棱角有变圆钝的趋势，特别是在CaC₂O₄的RS较低时。

  2.4   不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP影响CaC₂O₄晶体形成的FT-IR光谱

  采用FT-IR光谱进一步表征了上述各组晶体，部分结果如图 2所示。在没有降解PCP存在且n_Ca²⁺/n_Ox^2-≤4时(图 2A)，得到的CaC₂O₄晶体在3 059~3 490 cm^-1处的晶体水伸缩振动峰分裂为5个小峰，羧基不对称伸缩振动ν_as(COO^-)和对称伸缩振动ν_s(COO^-)分别在1 618和1 316 cm^-1附近，这些都是COM晶体的特征峰。但在n_Ca²⁺/n_Ox^2-≥8时出现了COD晶体的红外特征吸收，此时不但ν_as(COO^-)和ν_s(COO^-)出现蓝移，而且晶体水伸缩振动峰表现为一个大而宽的单峰(在3 429 cm^-1附近)。

  图 2

  

  图 2.  固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1时, n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP影响CaC₂O₄晶体形成的FT-IR谱图: (A) 没有降解PCP存在下; (B) 在0.5 g·L^-1降解PCP存在下

  Figure 2.  FT-IR spectra for the effects of n_Ca²⁺/n_Ox^2- and PCP on CaC₂O₄ crystal formation at fixed c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1: (A) without PCP; (B) in the presence of 0.5 g·L^-1 degraded PCP

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  加入降解PCP后(图 2B)，随着n_Ca²⁺/n_Ox^2-由0.25增加至12，ν_as(COO^-)从1 618 cm^-1蓝移到1 624 cm^-1，ν_s(COO^-)从1 316 cm^-1蓝移到1 320 cm^-1，表明COD晶体质量分数逐渐增加^[20-21]。

  2.5   拉曼光谱

  图 3为不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下形成的CaC₂O₄晶体的拉曼光谱。在1 463和1 488 cm^-1左右的吸收峰为COM的C—O对称拉伸振动，其中1 463 cm^-1为COM的主峰；1 625 cm^-1处为C—O不对称拉伸振动，893 cm^-1处为C—C侧链拉伸振动，504 cm^-1归属于O—C—O面内弯曲带(表 3)。相比之下，COD的C—O对称伸缩振动在1 476 cm^-1左右，488 cm^-1为O—C—O面内弯曲^[22-23]。即在低Ca²⁺浓度条件下形成的晶体主要为COM(图 3a~3c)，而在高Ca²⁺浓度条件下同时形成了COM和COD晶体(图 3d和3e)。拉曼光谱与FT-IR、XRD检测结果一致。

  图 3

  

  图 3.  固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1时, 不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下生成的CaC₂O₄晶体的拉曼光谱: n_Ca²⁺/n_Ox^2-=0.25 (a)、1 (b)、4 (c)、8 (d)、12 (e)

  Figure 3.  Raman spectra of CaC₂O₄ crystals generated under different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values at fixed c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1: n_Ca²⁺/n_Ox^2-=0.25 (a), 1 (b), 4 (c), 8 (d), 12 (e)

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  表 3

  

  表 3  不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下生成的CaC₂O₄晶体的拉曼吸收峰

  Table 3.  Raman absorption peaks of CaC₂O₄ crystals formed under different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values

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  nCa2+/nOx2-	C—O asymmetric stretching*	C—O symmetric stretching*	C—C stretching	O—C—O in-plane bending	wCOD/%
  Pure COM	1 625w	1 463sh, 1 488s	894	504	—
  0.25	1 625	1 463sh, 1 484	893	504	0
  1	1 627	1 463sh, 1 487	898	502	0
  4	1 628	1 458, 1 490	895	500	0
  8	1 627	1 476, 1 482		488s	31.9
  12	1 629	1 476, 1 487	893	488s	38.3
  Pure COD	1 629	1 476s	909	488s	—
  * s: strong, w: weak, sh: sharp.

  2.6   ζ电位

  图 4为不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP对形成的CaC₂O₄晶体ζ电位的影响。可以看出：

  图 4

  

  图 4.  n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP对形成的CaC₂O₄晶体ζ电位的影响: (A) 固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, 改变c_Ca²⁺; (B) 固定n_Ca²⁺/n_Ox^2-=1, 改变CaC₂O₄溶液的RS

  Figure 4.  Effects of n_Ca²⁺/n_Ox^2- and degraded PCP on the ζ potential of formed CaC₂O₄ crystals: (A) fixing c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, changing c_Ca²⁺; (B) fixing n_Ca²⁺/n_Ox^2-=1, changing RS of CaC₂O₄ solution

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  (1) 多糖的存在使得CaC₂O₄晶体的ζ电位更低。这归因于晶体表面吸附了带负电荷的降解PCP。

  (2) 随着COD质量分数增加，ζ电位越低。例如，固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1，随着n_Ca²⁺/n_Ox^2-从0.25增大到12，COD质量分数从0增加到38.3%，导致晶体的ζ电位从-6.8 mV减小到-13.6 mV(图 4A)；而加入降解PCP后，COD质量分数从13.8%增加到46.1%，晶体的ζ电位从-7.2 mV减小到-19.1 mV。

  (3) 随着CaC₂O₄的RS增加，生成的晶体量增加，在固定0.5 g·L^-1降解PCP的条件下，吸附在每个晶体表面的带负电荷的降解PCP分子减少，因此，ζ电位绝对值减少(图 4B)。

  2.7   降解PCP对CaC₂O₄成核、生长和聚集的抑制作用

  采用紫外分光光度法研究了降解PCP对CaC₂O₄晶体的成核速率和聚集速率的影响(图 5)。结果表明，降解PCP能够显著抑制CaC₂O₄晶体的成核速率和聚集速率。与空白组(图 5A)相比，加入降解PCP后(图 5B)，延长了晶体的成核时间(t_max)，同时降低了晶体的成核速率和聚集速率^[24]。降解PCP对n_Ca2+/n_Ox^2-分别为0.25、1、4、8、12的CaC₂O₄溶液中CaC₂O₄结晶的成核抑制率(N_m)分别为33.4%、36.4%、44.8%、42.4%和44.7%(图 5C)，对CaC₂O₄晶体聚集抑制率(A_m)分别为0%、16.7%、54.8%、58%和53.4%。以上结果表明降解PCP对高Ca²⁺浓度溶液中CaC₂O₄晶体的成核和聚集的抑制效果比在高Ox^2-浓度溶液中好。

  图 5

  

  图 5.  降解PCP对不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下CaC₂O₄晶体成核、聚集的抑制作用: (A) 空白组的吸光度; (B) 加入降解PCP后的吸光度; (C) 降解PCP对CaC₂O₄结晶的N_m和A_m

  Figure 5.  Inhibition of degraded PCP on CaC₂O₄ crystal nucleation and aggregation under different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values: (A) absorbance of the control group; (B) absorbance after degraded PCP was added; (C) N_m and A_m of degraded PCP on CaC₂O₄ crystallization

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  2.8   降解PCP对体系中可溶性Ca²⁺浓度和CaC₂O₄沉淀量的影响

  采用ICP检测了降解PCP对反应体系中可溶性Ca²⁺浓度的影响，并用称重法评估了降解PCP对CaC₂O₄沉淀质量的影响(图 6)。加入降解PCP后，溶液中可溶性Ca²⁺浓度增加，沉淀质量减少，表明降解PCP与体系中的Ca²⁺配位后，减少了与Ox^2-结合的Ca²⁺的量，从而降低了形成的CaC₂O₄沉淀量，这有利于抑制CaC₂O₄结石的形成。

  图 6

  

  图 6.  在0.5 g·L^-1降解PCP存在下改变n_Ca²⁺/n_Ox^2-后上清液中Ca²⁺的浓度和CaC₂O₄沉淀量

  Figure 6.  Concentration of Ca²⁺ in the supernatant and the amount of CaC₂O₄ precipitate in the presence of 0.5 g·L^-1 degraded PCP after changing n_Ca²⁺/n_Ox^2-

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  为了验证结果的可靠性，我们计算了上清液中的可溶性Ca²⁺的物质的量(n_Ca²⁺)与CaC₂O₄沉淀的物质的量(n_CaC2O4)之和(∑n_Ca²⁺)。结果表明各实验的∑n_Ca²⁺与理论Ca²⁺的物质的量总量几乎一致(表 4)，稍有偏差主要是沉淀转移过程中的少量损失所致。

  表 4

  

  表 4  降解PCP对CaC₂O₄晶相、溶液中可溶性Ca²⁺浓度以及CaC₂O₄沉淀的量的影响

  Table 4.  Effects of degraded PCP on CaC₂O₄ crystal phase, soluble Ca²⁺ concentration in solution, and CaC₂O₄ precipitate amount

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  Group	nCa2+/nOx2-	wCOD/%	cCa2+/(μmol·L-1)	nCa2+/μmol	nCaC2O4/μmol	∑nCa2+/μmol	Theoretical ∑nCa2+/μmol
  Control	0.25	0	25.4	1.27	6.3	7.57	7.55
  	1	0	102	5.14	24.28	29.4	30.0
  	4	0	1 279	63.2	55.7	119	120
  	8	11.6	3 121	156	85.2	241	240
  	12	38.3	4 327	216	146	362	360
  Degraded PCP	0.25	14.3	98.6	4.85	3.86	8.71	7.55
  	1	21.1	159.8	7.95	20.3	28.3	30.0
  	4	28.6	1 411	70.6	53.1	124	120
  	8	40.8	3 269	156	75.8	232	240
  	12	46.1	4 839	242	135	377	360

  3.   讨论

  3.1   高浓度Ox^2-摄入后肾结石的形成风险远大于高浓度Ca²⁺摄入

  CaC₂O₄晶体的生长习性及最终形成的晶相受溶液的RS、n_Ca²⁺/n_Ox^2-及添加剂等影响。XRD、FT-IR和拉曼光谱均表明，在高Ox^2-浓度条件下只生成COM晶体，而高Ca²⁺浓度条件下则会促进COD晶体的形成。一般而言，在正常人尿液中n_Ca²⁺/n_Ox^2-在5左右^[25]，n_Ca²⁺/n_Ox^2- < 5为高Ox^2-浓度尿区，不但容易形成CaC₂O₄结石，而且结石中COM晶体占优势。而n_Ca²⁺/n_Ox^2- > 5为高Ca²⁺浓度尿区，容易形成COD晶体。由于COM晶体的主要晶面为带正电荷的(101)晶面^[5]；而COD晶体主要为四角双锥形的晶体，COD的主晶面上排列着大量的水分子，电荷密度低，因此，表面带负电荷的受损伤肾上皮细胞表面与COM的黏附力远大于COD，即COD更容易随尿液排出^[26]。此外COD对肾上皮细胞的毒性比COM更小^[26]，因此抑制COM的形成更有利于抑制结石的形成。这提示，高浓度Ox^2-摄入后对肾结石形成的风险远大于高浓度Ca²⁺摄入。Rodgers等^[27]的研究表明，草酸对CaC₂O₄肾结石形成的影响是钙的23倍；而Sorensen等^[28]研究发现，增加膳食钙的摄入量可使肾结石发生风险降低5%~28%。以上均表明草酸钙肾结石的形成主要是摄入Ox^2-过多所致。

  3.2   降解PCP诱导COD形成并抑制CaC₂O₄晶体成核、生长和聚集

  (1) 降解PCP诱导COD形成。富含阴离子的降解PCP更易吸附在表面带正电荷的COM晶体表面^[14]，从而抑制了COM的进一步生长，使得晶体中COD的质量分数增加。降解PCP中—COOH基与溶液中的Ca²⁺配位，使得多糖表面Ca²⁺富集，增大了局部区域的n_Ca²⁺/n_Ox^2-，Ca²⁺能态增加，这有利于COD晶体形成；相比之下，过量的Ox^2-则对生成COM晶体有利^[29]。此外，被—COOH吸附的Ca²⁺的自由度降低，也会促进热力学亚稳定的COD形成^[30]。Farmanesh等^[31]研究表明，含有高百分比阴离子基团的抑制剂(如硫酸软骨素等)可以通过吸附到COM晶体的特定晶面上而产生螺旋位错，从而改变COM晶体在特定方向上的生长速率，达到抑制COM晶体生长的目的。降解PCP调控CaC₂O₄晶体形成的示意图如图 7所示。

  图 7

  

  图 7.  降解PCP调控CaC₂O₄晶体形成示意图

  Figure 7.  Schematic diagram of degraded PCP regulating CaC₂O₄ crystal formation

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  (2) 降解PCP抑制CaC₂O₄晶体成核、生长和聚集。CaC₂O₄晶体形成包括成核、生长和聚集3个过程^[32]。降解PCP不但能够抑制CaC₂O₄晶体成核与聚集(图 5)，而且能够减少形成的CaC₂O₄晶体质量(图 6)，从而抑制CaC₂O₄晶体的生长。这归因于降解PCP中的—COOH基与溶液中的游离Ca²⁺配位后，增加了溶液中可溶性Ca²⁺浓度，从而减少了Ca²⁺向CaC₂O₄晶体表面运输^[33]，抑制了晶体的生长，降低了CaC₂O₄晶体的形成量。

  晶体的聚集程度与晶体表面的ζ电位密切相关。晶体表面ζ电位越低，粒子间排斥力越大，越不容易发生聚集。降解PCP中的—COOH基可以通过钙桥_(PCP)COO^-…Ca²⁺…^-OOC_(CaC2O4)吸附在CaC₂O₄晶体表面，使得其负电荷密度增加，晶体表面的ζ电位更低(图 4)，因此晶体间的聚集被抑制。晶体的聚集程度也与晶体中COD的质量分数相关。由于COM晶体表面的Ca²⁺浓度高于COD晶体^[5]，且四角双锥形COD的8个(101)晶面上分布着较多的草酸根离子而带负电荷，因此，COD具有更低的ζ电位值^[34]，即晶体中COD质量分数越大，晶体的聚集程度越小。

  抑制CaC₂O₄晶体的成核、生长或聚集均有利于降低CaC₂O₄结石的形成风险。

  3.3   CaC₂O₄的RS对CaC₂O₄晶体形成的影响

  高RS有利于促进COD形成。在低RS条件下(RS=6.6)，即使加入了0.5 g·L^-1降解PCP，也只生成COM晶体。随着RS增加，形成的COD晶体量增加。例如，在RS=9.4和13.3时，形成了23.3%和32.1%的COD晶体。因为在RS较低时，体系中Ca²⁺量和Ox^2-量均较少，降解PCP调控COD形成的能力逐步显现。但当RS > 13.3时，生成的COD晶体减少，因为随着RS进一步增大，体系中形成的CaC₂O₄晶体量显著增加，有限的降解PCP不能与每个Ca²⁺结合，这些未与降解PCP结合的Ca²⁺形成了COM晶体，导致COD所占比例下降。

  RS影响晶体的晶面。在高RS下，高活化能的晶面生长迅速，但由于在高RS时晶体聚集严重，晶体的活性晶面更容易聚集，导致活性晶面受到遮蔽。相比之下，低活化能的晶面本身已经有足够的生长速度，影响不大。因此，随着RS增加，COM的I₍₁₀₁₎/I₍₀₂₀₎减小。

  RS的改变会影响晶体的初始尺寸和聚集程度。结晶的生长是以RS为推动力的。在RS较高时，晶体成核优先于晶体生长，最终使晶体尺寸变小。高RS不但增加了晶体的沉淀量，而且增加了晶体的聚集程度。这归因于RS较高(如RS≥37.6)时，形成的晶核数目过多，此时即使加入0.5 g·L^-1的降解PCP也难以有空间让其发挥效果，晶体立即成核并发生聚集，而晶体在体内的聚集也是肾结石形成的重要原因之一^[1]。

  4.   结论

  CaC₂O₄过饱和溶液中的n_Ca²⁺/n_Ox^2-越大，诱导形成的COD质量分数越多，而高Ox^2-浓度促进COM晶体形成，这提示高浓度Ox^2-尿液中肾结石形成的风险远大于高浓度Ca²⁺尿液。溶液的过饱和度过高时不但增加了晶体的沉淀量，而且促进了晶体的聚集，从而增加了结石的形成风险。降解茯苓多糖(PCP)可以增大溶液中可溶性Ca²⁺浓度，减少生成的CaC₂O₄晶体质量，增加容易排出体外的COD晶体比例，使晶体表面ζ电位变低。降解PCP能够同时抑制CaC₂O₄晶体的成核、生长和聚集，且对高钙溶液中CaC₂O₄晶体的成核和聚集的抑制效果比在高草酸溶液中好，这些结果有利于抑制CaC₂O₄结石形成，提示降解PCP有可能是潜在的防石药物。

  
  
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  图 1  不同条件下生成的CaC₂O₄晶体的XRD图: (A) 固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, 改变n_Ca²⁺/n_Ox^2-; (B) 固定c_Ox^2-=c_Ca²⁺, 改变溶液的RS

  Figure 1  XRD patterns of CaC₂O₄ crystals generated under different conditions: (A) fixing c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, changing the n_Ca²⁺/n_Ox^2-; (B) fixing c_Ox^2-=c_Ca²⁺, changing RS of solution

  * Indicates the diffraction peaks of COD, and the others are the peaks of COM

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  图 2  固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1时, n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP影响CaC₂O₄晶体形成的FT-IR谱图: (A) 没有降解PCP存在下; (B) 在0.5 g·L^-1降解PCP存在下

  Figure 2  FT-IR spectra for the effects of n_Ca²⁺/n_Ox^2- and PCP on CaC₂O₄ crystal formation at fixed c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1: (A) without PCP; (B) in the presence of 0.5 g·L^-1 degraded PCP

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  图 3  固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1时, 不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下生成的CaC₂O₄晶体的拉曼光谱: n_Ca²⁺/n_Ox^2-=0.25 (a)、1 (b)、4 (c)、8 (d)、12 (e)

  Figure 3  Raman spectra of CaC₂O₄ crystals generated under different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values at fixed c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1: n_Ca²⁺/n_Ox^2-=0.25 (a), 1 (b), 4 (c), 8 (d), 12 (e)

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  图 4  n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP对形成的CaC₂O₄晶体ζ电位的影响: (A) 固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, 改变c_Ca²⁺; (B) 固定n_Ca²⁺/n_Ox^2-=1, 改变CaC₂O₄溶液的RS

  Figure 4  Effects of n_Ca²⁺/n_Ox^2- and degraded PCP on the ζ potential of formed CaC₂O₄ crystals: (A) fixing c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1, changing c_Ca²⁺; (B) fixing n_Ca²⁺/n_Ox^2-=1, changing RS of CaC₂O₄ solution

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  图 5  降解PCP对不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下CaC₂O₄晶体成核、聚集的抑制作用: (A) 空白组的吸光度; (B) 加入降解PCP后的吸光度; (C) 降解PCP对CaC₂O₄结晶的N_m和A_m

  Figure 5  Inhibition of degraded PCP on CaC₂O₄ crystal nucleation and aggregation under different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values: (A) absorbance of the control group; (B) absorbance after degraded PCP was added; (C) N_m and A_m of degraded PCP on CaC₂O₄ crystallization

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  图 6  在0.5 g·L^-1降解PCP存在下改变n_Ca²⁺/n_Ox^2-后上清液中Ca²⁺的浓度和CaC₂O₄沉淀量

  Figure 6  Concentration of Ca²⁺ in the supernatant and the amount of CaC₂O₄ precipitate in the presence of 0.5 g·L^-1 degraded PCP after changing n_Ca²⁺/n_Ox^2-

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  图 7  降解PCP调控CaC₂O₄晶体形成示意图

  Figure 7  Schematic diagram of degraded PCP regulating CaC₂O₄ crystal formation

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  表 1  不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-及0.5 g·L^-1降解PCP对CaC₂O₄晶体形成的影响

  Table 1.  Effects of different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values and 0.5 g·L^-1 degraded PCP on the formation of CaC₂O₄ crystals

  cCa2+/(mmol·L-1)	cOx2-/(mmol·L-1)	nCa2+/nOx2-	RS*	I(101)/I(020) of COM	wCOD/%
  					Blank	Degraded PCP
  Group A: cOx2-=0.6 mmol·L-1, changing cCa2+
  0.075	0.6	0.125	4.7	1.88	0	13.8
  0.15	0.6	0.25	6.6	1.42	0	14.3
  0.3	0.6	0.5	9.4	1.31	0	16.7
  0.6	0.6	1	13.3	1.45	0	21.1
  1.2	0.6	2	18.8	1.49	0	25.4
  2.4	0.6	4	26.6	1.10	0	28.6
  4.8	0.6	8	37.6	0.35	11.6	40.8
  7.2	0.6	12	46	0.23	38.3	46.1
  Group B: cOx2-=cCa2+
  0.3	0.3	1	6.6	3.24	0	0
  0.42	0.42	1	9.4	2.45	0	23.3
  0.6	0.6	1	13.3	1.96	0	32.1
  0.85	0.85	1	18.8	1.56	0	18.2
  1.2	1.2	1	26.6	1.26	0	14.5
  1.7	1.7	1	37.6	0.59	0	11.3
  * Supersaturation (RS) was calculated according to the reference[15].

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  表 2  固定c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1时, n_Ca²⁺/n_Ox^2-和降解PCP影响CaC₂O₄晶体形成的SEM图像

  Table 2.  SEM images for the effects of n_Ca²⁺/n_Ox^2- and degraded PCP on CaC₂O₄ crystal formation at fixed c_Ox^2-=0.6 mmol·L^-1

  Group	nCa2+/nOx2- (RS)
  	0.25 (6.6)	1 (13.3)	4 (26.6)	8 (37.6)	12 (46)
  Control
  Degraded PCP

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  表 3  不同n_Ca²⁺/n_Ox^2-条件下生成的CaC₂O₄晶体的拉曼吸收峰

  Table 3.  Raman absorption peaks of CaC₂O₄ crystals formed under different n_Ca²⁺/n_Ox^2- values

  nCa2+/nOx2-	C—O asymmetric stretching*	C—O symmetric stretching*	C—C stretching	O—C—O in-plane bending	wCOD/%
  Pure COM	1 625w	1 463sh, 1 488s	894	504	—
  0.25	1 625	1 463sh, 1 484	893	504	0
  1	1 627	1 463sh, 1 487	898	502	0
  4	1 628	1 458, 1 490	895	500	0
  8	1 627	1 476, 1 482		488s	31.9
  12	1 629	1 476, 1 487	893	488s	38.3
  Pure COD	1 629	1 476s	909	488s	—
  * s: strong, w: weak, sh: sharp.

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  表 4  降解PCP对CaC₂O₄晶相、溶液中可溶性Ca²⁺浓度以及CaC₂O₄沉淀的量的影响

  Table 4.  Effects of degraded PCP on CaC₂O₄ crystal phase, soluble Ca²⁺ concentration in solution, and CaC₂O₄ precipitate amount

  Group	nCa2+/nOx2-	wCOD/%	cCa2+/(μmol·L-1)	nCa2+/μmol	nCaC2O4/μmol	∑nCa2+/μmol	Theoretical ∑nCa2+/μmol
  Control	0.25	0	25.4	1.27	6.3	7.57	7.55
  	1	0	102	5.14	24.28	29.4	30.0
  	4	0	1 279	63.2	55.7	119	120
  	8	11.6	3 121	156	85.2	241	240
  	12	38.3	4 327	216	146	362	360
  Degraded PCP	0.25	14.3	98.6	4.85	3.86	8.71	7.55
  	1	21.1	159.8	7.95	20.3	28.3	30.0
  	4	28.6	1 411	70.6	53.1	124	120
  	8	40.8	3 269	156	75.8	232	240
  	12	46.1	4 839	242	135	377	360

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