English

• 0.   引言

  恶性肿瘤的全球发病率和死亡率逐年攀升，在许多国家已成为民众第一大致死原因，严重威胁着人类健康^[1]。近年来，恶性肿瘤被认为是精准医疗(precision medicine)主要应用的重大疾病之一，利用分子影像技术(molecular imaging)可进行肿瘤的早期诊断与边界精确化，构建个性化治疗，实现对肿瘤的高效精准诊疗^[2]。目前，临床对于肿瘤治疗的方法主要包括手术、化疗、放射治疗以及免疫治疗等，但这些治疗方式存在对正常组织器官的损伤、肿瘤治疗效果有限、增加肿瘤复发与转移几率等诸多不足，严重影响肿瘤的诊断与治疗效果^[3]。

  光热治疗(photothermal therapy，PTT)作为一种高效的肿瘤治疗手段，由于其侵袭性小和时空选择性高等优势在近年来受到广泛关注^[4]。与传统治疗方式相比，PTT具有操作简单、微创、安全、治疗时间短等特点，通过光热剂将照射激光的光能以非热辐射形式转化为热能，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤^[5]。目前已开发用于PTT的纳米光热剂包括有机材料和无机材料2大类^[6]，如吲哚菁绿^[7]、聚吡咯^[8]、多巴胺^[9]等有机材料具有良好的光热性能，但光热稳定性差，光漂白现象严重，限制了其在肿瘤PTT中的应用。因此，科学家将研究重心转向更加稳定且结构易于控制的无机纳米材料，这些材料主要包括金属纳米颗粒(金纳米棒^[10]、钯纳米片^[11]、合金纳米颗粒^[12]等)、碳纳米材料(碳量子点^[13]、碳球^[14])、半导体纳米材料(硫化铜^[15]、硫化银^[16])等。无机纳米材料拥有生物毒性低、热稳定性强、光热灵敏度高、光转换效率高等优势，极具临床应用前景。PTT实现精准治疗离不开影像学技术的有效引导。光声(photoacoustic，PA)成像作为一种新型的光学成像技术，同样是利用光热效应，将光转化为声波实现成像^[17]。光声成像结合了光学成像和超声成像，具有较深的组织穿透性，可以利用高的分辨率精准定位肿瘤、清晰勾勒肿瘤轮廓，从而有效引导光热治疗^[18]。特别是第二近红外区(the second near-infrared window，NIR-Ⅱ，1000~1700 nm)的PA成像，由于该区域人体各组织器官对光子的吸收、散射显著降低，无背景信号干扰，与常规近红外一区PA成像相比，有效改善了成像质量，实现了良好的空间分辨率、组织穿透力和高信噪比PA成像性能^[19]。因此，利用具有NIR-Ⅱ光学吸收性能的纳米药物可有效结合PA成像与PTT治疗性能，实现高效的肿瘤诊疗一体化作用效果。

  理想的NIR-Ⅱ纳米光热剂不仅具备良好的诊疗性能，还要在肿瘤部位实现有效聚集才能达到最佳效果。众所周知，由于纳米药物在肿瘤部位的吸收和代谢速率是动态平衡的，只有当沉积量达到一定数量时才能进行诊断和治疗^[20]。然而，仅利用高渗透长滞留(enhanced permeability and retention，EPR)效应促使纳米药物向肿瘤区域递送，易出现积累与滞留不足，影响最终的诊疗效果^[21]。因此，如何增强纳米药物在肿瘤部位的有效富集，是提升诊疗性能至关重要的一项挑战。恶性肿瘤细胞不受周围细胞因子影响与机体调控，从而导致形态、细胞代谢、分化能力及组织血供等方面的显著差异，促使肿瘤区域呈现个性化微环境特性^[22]。研究表明，带正电荷的纳米颗粒易于通过特殊的胞吞途径穿透深层肿瘤，但带正电的纳米粒子在循环期间很容易被内皮网状系统(reticuloendothelial system，RES) 清除，通过表面修饰，可使得纳米颗粒在肿瘤微环境作用下，实现电荷翻转，正电荷特异性表达^[23]。基于肿瘤区域诸多特点，研究者致力于开发电荷翻转的刺激响应型纳米平台，实现肿瘤部位表面电荷和颗粒大小等物理化学性质的响应性改变，以提升纳米药物的靶向性和富集量，减少毒副作用^[24]。因此，通过简单高效的方式将正、负电性优势结合，开发特异性肿瘤诊疗药物极具临床应用前景。

  综上所述，我们设计并构筑一种肿瘤微环境响应性翻转表面电荷纳米平台Pt-Cu@PLL@HA(图 1，PLL=聚赖氨酸，HA=透明质酸)，通过肿瘤特异性靶向聚集，实现在NIR-Ⅱ PA成像引导下对肿瘤的精准NIR-Ⅱ PTT治疗。选取具有良好NIR-Ⅱ光学吸收性能的Pt-Cu合金纳米材料作为核相，通过层层(layer-by-layer，LBL)自组装技术，在其表面依次均匀包覆带正电荷的PLL和带负电荷的HA。利用HA的负电性增加纳米平台体内循环过程，结合EPR效应与HA的主动靶向性在肿瘤部位高效富集。由于肿瘤组织中的透明质酸酶(HAase) 可将Pt-Cu@PLL@HA外部HA层(-)快速降解，暴露出内部PLL层(+)，纳米平台发生响应性电荷翻转。带有正电荷的Pt-Cu@PLL在进入肿瘤细胞过程中，易呈现溶酶体逃逸现象，增加纳米平台的肿瘤细胞摄取量，从而大幅提升肿瘤诊疗效果，为构筑NIR-Ⅱ诊疗一体化纳米平台提供新思路。

  图 1

  

  图 1.  Pt-Cu@PLL@HA纳米平台的构筑及其诊疗机制示意图

  Figure 1.  Schematic illustration for preparation and therapeutic mechanism of Pt-Cu@PLL@HA nanoplatform

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  1.   实验方法

  1.1   药品及试剂

  聚乙烯吡咯烷酮(PVP，M_w=30 000)、硝酸铜(Cu(NO₃)₂·3H₂O)、六水合氯铂酸(H₂PtCl₆·6H₂O，37.5%)、甘氨酸、PLL(M_w=150 000)、HA均购于阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)；台盼蓝购于Sigma-Aldrich公司；细胞增殖检测试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK-8)购于博斯特生物技术有限公司。所有试剂均未进行进一步纯化。实验用水为超纯水(ρ > 18 MΩ)。

  1.2   Pt-Cu合金的制备

  室温条件下，将80 mg PVP加入2.5 mL超纯水中，充分搅拌至完全溶解，加入预先配制的1 mL H₂PtCl₆(20 mmol·L^-1) 溶液和1 mL Cu(NO₃)₂溶液(20 mmol·L^-1)。随后，将40.0 mg甘氨酸加入混合溶液中，25 ℃下高速搅拌30 min，形成均匀的黄绿色溶液。将反应混合物转移到含有聚四氟乙烯内衬的15 mL高压反应釜中，在200 ℃下反应6 h，冷却至室温。将混合溶液以4 500 r·min^-1的转速离心，用超纯水洗涤3次，固体产物真空冷冻干燥得到Pt-Cu合金。

  1.3   Pt-Cu@PLL@HA的制备

  采用LBL自组装技术制备样品。将5 mL Pt-Cu合金水溶液(2 mg·mL^-1)分散于10 mL超纯水中，超声15 min，滴加2 mL PLL(10 mg·mL^-1) 水溶液，在37 ℃下搅拌1 h，离心收集固体Pt-Cu@PLL。随后，将得到的Pt-Cu@PLL分散在5 mL去离子水中，缓慢加入10 mL HA(2 mg·mL^-1)水溶液。反应1 h后离心收集Pt-Cu@PLL@HA，用超纯水洗涤数次，固体沉淀经真空冷冻干燥得到Pt-Cu@PLL@HA。

  1.4   表征分析仪器

  采用JEM 2100F(200 kV) 型透射电子显微镜(TEM)对材料的形貌及结构进行分析。使用Rigaku D/max-2500型衍射仪测定样品在5°~80°范围内的X射线衍射(XRD) 图，工作条件：Cu Kα辐射(λ = 0.154 059 8 nm)、管电压50 kV、管电流200 mA、扫描速度5 (°)·min^-1。动态光散射(DLS)的尺寸分布和样品的ζ电位在Malvern电位分析仪上测试。X射线光电子能谱(XPS) 的测定使用Thermo-VG Scientific ESCALAB250光谱仪，以Al Kα为射线源(150 W)。FT-IR光谱在Vertex PerkinElmer 580 BIR分光光度计(Bruker)上采集，使用KBr压片进行制样分析。样品的UV-Vis光谱采用TU-1901双光束紫外可见分光光度计(PerkinElmer)测定。热重-差热(TG-DTA)分析采用Rigaku的TG 8101D型仪器，在空气气氛中以10 ℃·min^-1的加热速率，从室温升温至800 ℃。

  1.5   体外细胞毒性评价

  以购自中国科学院(中国上海)的小鼠乳腺癌细胞(4T1)为细胞模型，以RPMI 1640为培养基，在培养基中加入体积分数10% 的灭活胎牛血清(FBS)，加入1% 双抗(青霉素/链霉素)防止细菌污染。细胞置于细胞培养箱中，在37 ℃、CO₂体积分数5% 的气氛条件下培养。采用标准CCK-8方法分别测定Pt-Cu和Pt-Cu@PLL@HA的体外细胞毒性以及激光照射后细胞杀伤性能。将4T1细胞悬液以每孔8 000个的密度均匀播种在96孔板中，每孔加入100 μL培养液，在37 ℃、CO₂体积分数5% 的条件下培养24 h，贴壁后，弃去培养液，向孔中加入100 μL含不同浓度Pt-Cu或Pt-Cu@PLL@HA(0、12.5、25、50、100、200和400 μg·mL^-1)的新鲜培养基。孵育24 h后，去除含有样品的培养基，加入10 μL CCK-8溶液(5 mg· mL^-1)与培养液混合，共孵育2 h，使用酶标仪(BioTek Epoch 2)在450 nm处测量吸光度。

  对于体外细胞光热性能分析，将1×10⁵个4T1细胞置于直径35 mm的培养皿中，培养24 h。经磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，pH=7.4)冲洗后，用含不同浓度的Pt-Cu或Pt-Cu@PLL@HA(0、12.5、25、50、100、200和400 μg·mL^-1)溶液孵育4 h。随后用PBS冲洗细胞，并浸泡在300 μL的介质中，在强度为1.0 W· cm^-2的1 064 nm激光下照射5 min，细胞在37 ℃下再培养30 min。加入CCK-8溶液共孵育2 h，通过酶标仪检测细胞杀伤情况；同样条件下，采用台盼蓝染色，在荧光显微镜下观察细胞。

  1.6   活体PA成像

  雌性BALB/c裸鼠(6~8周龄，17~19 g)购自北京维通丽华实验动物科技有限公司。动物实验中，所有动物操作规程均符合《中国国家实验动物管理和使用条例》的标准。动物协议经山西医科大学机构动物使用与关爱委员会批准(批准号：2016LL141，中国太原)。将小鼠驯化至少7 d后，在小鼠左腿背皮下注射4T1细胞(3×10⁶个)建立瘤模型。当肿瘤体积达到75 mm³以上时，在尾静脉注射Pt-Cu@PLL@HA材料(15 mg·kg^-1)，利用实时多光谱光声层析成像系统(MSOT)，分别于注射前及注射后1、4、8、12、24 h麻醉小鼠进行PA成像，研究材料在肿瘤部位的聚集特性。

  1.7   活体光热治疗

  将荷瘤小鼠随机分为3组(每组4只)进行不同治疗：(1) PBS+laser、(2) Pt-Cu+laser、(3) Pt-Cu @PLL@HA+laser。在尾静脉分别注射样品(15 mg· kg^-1)，用1 064 nm激光(1.0 W·cm^-2)照射整个肿瘤区域5 min。采用红外热成像系统监测肿瘤区域平均温度。用公式(ab)²/2计算肿瘤体积，其中a和b分别表示肿瘤长度和宽度。12 d后，处死所有小鼠，收集肿瘤进行苏木精和伊红(H & E)染色。

  1.8   统计分析

  所有结果均以均数±标准差(S.D.)的形式记录。采用单因素方差分析进行统计学意义分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

  2.   结果与讨论

  2.1   Pt-Cu@PLL@HA的形貌与理化特性

  对Pt-Cu@PLL@HA的形貌、结构及物化性能进行分析，如图 2所示。利用水热合成的Pt-Cu合金纳米颗粒(图 2A)呈花簇状结构，粒径均一，平均粒度为56.2 nm。通过LBL自组装过程，在Pt-Cu颗粒表面包覆PLL和HA，从TEM图可以看出(图 2B)，Pt-Cu@PLL@HA纳米颗粒外部具有明显的壳层结构包覆，壳层厚度约为10.9 nm，表明利用LBL技术在Pt-Cu颗粒表面成功构筑包覆壳层。Pt-Cu@PLL@HA的元素映射图(图 2C)显示所含Pt、Cu元素以及壳层C、N等元素在样品颗粒中呈现均匀分布。通过XRD对样品中Pt、Cu元素的存在形式进行分析，由图 2D可以看出，在41.1°、47.7°、69.3°处出现的特征衍射峰介于金属Pt(PDF No.04-0802)与金属Cu(PDF No.04-0836)的衍射峰之间，表明Pt-Cu是合金相。经PLL和HA修饰后，Pt-Cu晶体结构未发生改变，说明Pt-Cu合金具备良好的稳定性，有利于生物活体应用。进一步，利用XPS探究Pt-Cu@PLL@HA中Pt、Cu元素的价态。图 2E为样品的Pt4f能级光谱，结合能为70.65和74.06 eV处的吸收峰分别对应Pt⁰的Pt4f_7/2和Pt4f_5/2轨道^[25]。71.67和75.06 eV处出现的较弱吸收峰是表面Pt氧化导致。此外，由于样品中含有Cu元素，出现在75.74 eV的吸收峰可归属于Cu3p峰。图 2F为Pt-Cu@PLL@HA的Cu2p谱图，分析表明，在932.13和951.85 eV处的峰与Cu⁰2p峰相吻合^[26]。由此证明样品中Pt、Cu元素以Pt-Cu合金形式存在。

  图 2

  

  图 2.  (A) Pt-Cu与(B) Pt-Cu@PLL@HA的TEM图; (C) Pt-Cu@PLL@HA的元素映射图像; Pt-Cu@PLL@HA的(D) XRD图、(E) Pt4f和(F) Cu2p的XPS谱图

  Figure 2.  TEM images of (A) Pt-Cu and (B) Pt-Cu@PLL@HA; (C) Corresponding elemental mappings of Pt-Cu@PLL@HA; (D) XRD patterns, high-resolution XPS spectra of (E) Pt4f and (F) Cu2p of Pt-Cu@PLL@HA

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  2.2   Pt-Cu@PLL@HA的构筑分析和响应性能

  Pt-Cu@PLL@HA的合成是利用正负电荷间相互作用的LBL技术，由于Pt-Cu合金带负电荷，通过静电结合，将带正电性的PLL和带负电性的HA依次包覆在Pt-Cu纳米颗粒上。在LBL包覆过程中对样品进行ζ电位和粒径分析。由图 3A可知，通过PLL的包覆，样品的ζ电位从-5.5 mV翻转为Pt-Cu @PLL的22.6 mV，随后再次翻转至Pt-Cu @PLL@HA的-37.9 mV。通过逐级包覆样品的颗粒尺寸(流体力学直径)逐渐增大，从Pt-Cu合金的粒径64.6 nm增大至Pt-Cu@PLL@HA的80.22 nm(图 3B)，充分证明PLL和HA依次成功包覆在Pt-Cu合金颗粒表面。此外，Pt-Cu@PLL@HA的颗粒尺寸使得样品具有良好的EPR效果，有利于样品在肿瘤部位的高效富集^[27]。进一步对Pt-Cu@PLL@HA的稳定性进行分析(图 3C)，分别在水、PBS、生理盐水和RPMI 1640培养基中孵育24 h后，Pt-Cu@PLL@HA保持胶体稳定性，粒径与ζ电位未发生明显变化，这表明Pt-Cu @PLL@HA具有良好的生理稳定性和长血液循环性能。当样品进入肿瘤微环境，样品外部的HA被肿瘤组织中的HAase快速降解，样品内部的PLL暴露，发生电荷翻转。Pt-Cu@PLL@HA在模拟肿瘤微环境HAase的作用下(图 3D)，样品粒径与电位发生明显变化，随着外表面HA的降解，样品表面电位向正电荷方向变化，反应180 min后ζ电位增大为19.31 mV，粒径减小至65.01 nm，表明在肿瘤部位样品表面的HA可有效降解，释放内部Pt-Cu@PLL纳米颗粒。

  图 3

  

  图 3.  Pt-Cu、Pt-Cu@PLL和Pt-Cu@PLL@HA的(A) ζ电位和(B) 流体力学直径; (C) Pt-Cu@PLL@HA在水、PBS、生理盐水和RPMI 1640培养基中24 h后的流体力学直径和ζ电位; (D) HAase作用下Pt-Cu@PLL@HA的流体力学直径和电位变化

  Figure 3.  (A) ζ potentials and (B) hydrodynamic diameters of Pt-Cu, Pt-Cu@PLL and Pt-Cu@PLL@HA; (C) Hydrodynamic diameters and ζ potentials of Pt-Cu@PLL@HA in water, PBS, saline and RPMI 1640 medium after 24 h; (D) Hydrodynamic diameter and ζ potential changes of Pt-Cu@PLL@HA

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  2.3   Pt-Cu@PLL@HA的光热性能

  图 4A为Pt-Cu@PLL@HA的吸收光谱图。Pt-Cu@PLL@HA在600~1 400 nm范围存在广谱光吸收能力，特别是在1 000 nm之后的NIR-Ⅱ依旧保持较高的光吸收强度，表明Pt-Cu@PLL@HA可作为光热肿瘤治疗潜在的候选材料。基于良好的吸光性能，将不同浓度的Pt-Cu@PLL@HA溶液(25、50、100、200和400 μg·mL^-1)分别在1 064 nm(1.0 W· cm^-2)近红外激光下照射5 min，分析材料的光热性能。如图 4B所示，当Pt-Cu@PLL@HA溶液在激光照射下，即使在低浓度(25 μg·mL^-1)时温度也会迅速升高，而纯水在照射后温度变化可忽略不计。并且随着Pt-Cu@PLL@HA浓度提高，其升温速率不断增加，表明Pt-Cu@PLL@HA的光热效应具有浓度依赖性。此外，从红外热像图(图 4C)也可直观地看出Pt-Cu@PLL@HA在不同条件下的升温差异。众所周知，纳米光热剂的光热稳定性是其未来应用的关键^[28]。将Pt-Cu@PLL@HA溶液(400 μg·mL^-1) 在1 064 nm激光开/关循环照射5次后，检测其光热稳定性(图 4D)。5次循环过程中升温效果没有明显的偏差，光热性能也没有明显的衰退，表明Pt-Cu@PLL@HA纳米材料具有优异的光热稳定性。综上分析，Pt-Cu@PLL@HA在NIR-Ⅱ的1 064 nm激光照射下表现出良好的光热特性，表明此材料适合作为NIR-Ⅱ纳米光热剂实现肿瘤高效光热治疗。

  图 4

  

  图 4.  (A) Pt-Cu@PLL@HA的吸收光谱图; 不同浓度Pt-Cu@PLL@HA溶液(0、25、50、100、200和400 μg·mL^-1)在1 064 nm (1 W·cm^-2)激光照射300 s的(B) 升温曲线图和(C) 热成像图; (D) Pt-Cu@PLL@HA的光热稳定性

  Figure 4.  (A) Absorption spectra of Pt-Cu@PLL@HA; (B) Photothermal heating curves and (C) infrared thermal images of Pt-Cu@PLL@HA solution with different concentrations (0, 25, 50, 100, 200 and 400 μg·mL^-1) under laser irradiation (1 064 nm, 1 W·cm^-2) as a function of time (0-300 s); (D) Photothermal stability of Pt-Cu@PLL@HA

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  2.4   Pt-Cu@PLL@HA的细胞毒性

  采用CCK-8法检测Pt-Cu@PLL@HA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞) 的细胞活性影响。如图 5A所示，即使在高浓度Pt-Cu@PLL@HA(400 μg·mL^-1)中孵育24 h后，细胞活力仍保持在95%以上，表明Pt-Cu@PLL@HA细胞毒性较低，具有良好的生物相容性。基于以上细胞毒性，利用1 064 nm激光辐照，分析Pt-Cu和Pt-Cu@PLL@HA对4T1细胞的杀伤性能。图 5B表明，Pt-Cu@PLL@HA孵育的4T1细胞存活率明显低于Pt-Cu处理组，并且2组细胞存活率随溶液浓度增加变化趋势基本一致，这一现象说明聚合物包覆可有效提升细胞对材料的摄取量，并且包覆层对Pt-Cu光热性能影响较小。利用台盼蓝细胞染色观察Pt-Cu和Pt-Cu@PLL@HA在1 064 nm激光照射下的细胞活性(图 5C)。Pt-Cu@PLL@HA组细胞无明显死亡，细胞存活率高，这与图 5A的CCK-8细胞活性相吻合，进一步证实该材料良好的细胞相容性。在1 064 nm激光照射下，Pt-Cu@PLL@HA+Laser组细胞的死亡率明显高于Pt-Cu+Laser组，呈现出大量细胞死亡现象，表明Pt-Cu@PLL@HA是一种极具应用前景的NIR-Ⅱ光热剂。

  图 5

  

  图 5.  (A) 不同浓度Pt-Cu@PLL@HA分别孵育HUVEC和4T1细胞的存活率; (B) 经不同浓度的Pt-Cu和Pt-Cu@PLL@HA孵育4T1细胞后在1 064 nm (1 W·cm^-2)激光照射5 min下的细胞活性; (C) 不同样品与4T1共孵育后分别进行1 064 nm (1 W·cm^-2)的激光照射, 通过台盼蓝染色死细胞; ***P < 0.001

  Figure 5.  (A) HUVEC and 4T1 cell viabilities after incubation with Pt-Cu@PLL@HA with various concentrations; (B) Cell viability of 4T1 cells after incubation with Pt-Cu and Pt-Cu@PLL@HA under laser irradiation (1 064 nm, 1 W·cm^-2, 5 min); (C)Micrographs of 4T1 cells incubated with the samples before or after irradiation with 1 064 nm laser (1 W·cm^-2), where dead cells are stained with trypan blue; ***P < 0.001

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  2.5   Pt-Cu@PLL@HA的光声成像

  通过体外分析Pt-Cu@PLL@HA的PA信号评价其光声特性。如图 6A所示，观察到在1 064 nm处PA强度与Pt-Cu@PLL@HA浓度呈线性关系，随着溶液浓度的提升，PA信号呈上升趋势，表明对体内Pt-Cu@PLL@HA浓度定量分析的可行性。基于以上结果，对4T1荷瘤小鼠进行Pt-Cu@PLL@HA尾静脉注射(15 mg·kg^-1)，在注射前后不同时间点(0、1、4、8、12和24 h)监测Pt-Cu@PLL@HA活体PA成像性能。图 6C中肿瘤区域PA信号随着时间的推移逐渐增强，在整个肿瘤内的对比度明显高于周围组织，并在给药后12 h达到最佳聚集效果，给药24 h肿瘤部位的光声强度逐步减弱。此外，通过对PA信号的半定量分析(图 6B)，给药后12 h肿瘤部位的PA强度约为给药前的13.4倍，进一步证明Pt-Cu @PLL@HA可作为一种优异的PA成像剂，其能够有效识别肿瘤区域，指导诊断和治疗。

  图 6

  

  图 6.  (A) 不同浓度Pt-Cu@PLL@HA的PA强度; 4T1荷瘤鼠静脉注射Pt-Cu@PLL@HA后在1 064 nm激光照射下不同时间点的(B) PA强度变化和(C) 活体PA成像

  Figure 6.  (A) PA intensities of Pt-Cu@PLL@HA with different concentrations; (B) PA intensity changes and (C) PA imaging of 4T1 tumor-bearing mice after Pt-Cu@PLL@HA injection under 1 064 nm laser irradiation

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  2.6   Pt-Cu@PLL@HA活体光热治疗

  为进一步阐明Pt-Cu@PLL@HA的活体PTT疗效，分别对4T1荷瘤鼠进行PBS、Pt-Cu和Pt-Cu @PLL@HA三种尾静脉给药，根据PA成像的最佳滞留时间，给药12 h后对肿瘤部位进行1 064 nm(1 W· cm^-2)激光照射5 min，用热成像技术评价体内抑瘤效果。如图 7A和7B所示，PBS对照组的肿瘤部位仅观察到微小的温度变化；而Pt-Cu组和Pt-Cu @PLL@HA组在相同的激光照射下，最终温度分别升高至47.68和51.89 ℃，Pt-Cu@PLL@HA在所有光热辐照时间点上都表现出最高的温度值，这表明样品由于包覆层在肿瘤微环境的HA特异性降解与PLL的细胞高效摄取，有效提升了肿瘤区域的富集量，增强了光热治疗性能。持续监测PTT治疗Pt-Cu和Pt-Cu@PLL@HA组小鼠(图 7C)，Pt-Cu@PLL@HA组表现出良好的热消融作用，光热治疗小鼠12 d后肿瘤成功消除；而Pt-Cu组小鼠出现明显的肿瘤复发现象，光照治疗区域出现火山形瘤体。经Pt-Cu@PLL@HA光热治疗后(图 7D)，荷瘤鼠肿瘤体积显著减小，表现出优异的肿瘤抑制效果。此外，3组治疗小鼠体重12 d内均无明显下降趋势(图 7E)，进一步证明Pt-Cu@PLL@HA良好的生物相容性和生物安全性。图 7F为3组治疗小鼠肿瘤组织H & E分析，Pt-Cu@PLL@HA光热治疗后，肿瘤组织遭到破坏，呈现明显的细胞凋亡，表明Pt-Cu@PLL@HA在NIR-Ⅱ光照条件下具备高效的PTT治疗效果，有效消融癌细胞。此外，Pt-Cu@PLL@HA光热治疗后，小鼠的主要器官(包括心、肝、脾、肺和肾)未见明显坏死或生理形态变化(图 7G)。综上所述，Pt-Cu@PLL@HA具有较高的肿瘤富集与摄取能力，可实现高效的NIR-Ⅱ光热治疗性能。

  图 7

  

  图 7.  4T1荷瘤鼠静脉注射PBS、Pt-Cu或Pt-Cu@PLL@HA后对肿瘤区域激光辐照(1 064 nm, 1 W·cm^-2)的(A) 红外热成像和(B) 肿瘤温度变化曲线; (C) 光热治疗后不同治疗组的小鼠照片; 各治疗组小鼠(D) 肿瘤体积和(E) 体重随时间的变化图; (F) 治疗结束后收集小鼠肿瘤组织的H & E染色; (G) Pt-Cu@PLL@HA治疗组小鼠主要器官的H & E染色图像; 标尺: 100 μm; ***P < 0.001

  Figure 7.  (A) IRT images and (B) corresponding temperature curves of 4T1 tumor-bearing mice injected with PBS, Pt-Cu or Pt-Cu@PLL@HA under laser irradiation (1 064 nm, 1 W·cm^-2); (C) Representative photographs of mice of different groups after PTT; (D) Tumor volume and (E) body weight of mice from different groups after PTT; (F) H & E staining of the tumor tissues collected from mice at the end of treatment; (G) H & E-stained images of major organs collected from mices in Pt-Cu@PLL@HA group; Scale bar: 100 μm; ***P < 0.001

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  3.   结论

  基于Pt-Cu纳米合金良好的NIR-Ⅱ吸收性能，通过LBL技术构筑可在肿瘤部位高效富集的Pt-Cu@PLL@HA纳米平台，实现NIR-Ⅱ PA成像引导下的精准NIR-Ⅱ PTT肿瘤治疗。通过表征手段对Pt-Cu@PLL@HA纳米平台的颗粒形貌、元素存在形式、体外响应效果以及NIR-Ⅱ光热性能进行系统性分析，表明Pt-Cu@PLL@HA具有理想的光热效应与生物相容性。基于HA层在肿瘤区域的降解特性，促使PLL层(+)暴露，发生电荷翻转，增加肿瘤细胞摄取量。进一步通过一系列细胞、活体实验证实，相比Pt-Cu纳米颗粒，Pt-Cu@PLL@HA能够有效进入肿瘤细胞，实现高效肿瘤热消融效果。

  
  ^#共同第一作者。
  
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  图 1  Pt-Cu@PLL@HA纳米平台的构筑及其诊疗机制示意图

  Figure 1  Schematic illustration for preparation and therapeutic mechanism of Pt-Cu@PLL@HA nanoplatform

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  图 2  (A) Pt-Cu与(B) Pt-Cu@PLL@HA的TEM图; (C) Pt-Cu@PLL@HA的元素映射图像; Pt-Cu@PLL@HA的(D) XRD图、(E) Pt4f和(F) Cu2p的XPS谱图

  Figure 2  TEM images of (A) Pt-Cu and (B) Pt-Cu@PLL@HA; (C) Corresponding elemental mappings of Pt-Cu@PLL@HA; (D) XRD patterns, high-resolution XPS spectra of (E) Pt4f and (F) Cu2p of Pt-Cu@PLL@HA

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  图 3  Pt-Cu、Pt-Cu@PLL和Pt-Cu@PLL@HA的(A) ζ电位和(B) 流体力学直径; (C) Pt-Cu@PLL@HA在水、PBS、生理盐水和RPMI 1640培养基中24 h后的流体力学直径和ζ电位; (D) HAase作用下Pt-Cu@PLL@HA的流体力学直径和电位变化

  Figure 3  (A) ζ potentials and (B) hydrodynamic diameters of Pt-Cu, Pt-Cu@PLL and Pt-Cu@PLL@HA; (C) Hydrodynamic diameters and ζ potentials of Pt-Cu@PLL@HA in water, PBS, saline and RPMI 1640 medium after 24 h; (D) Hydrodynamic diameter and ζ potential changes of Pt-Cu@PLL@HA

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  图 4  (A) Pt-Cu@PLL@HA的吸收光谱图; 不同浓度Pt-Cu@PLL@HA溶液(0、25、50、100、200和400 μg·mL^-1)在1 064 nm (1 W·cm^-2)激光照射300 s的(B) 升温曲线图和(C) 热成像图; (D) Pt-Cu@PLL@HA的光热稳定性

  Figure 4  (A) Absorption spectra of Pt-Cu@PLL@HA; (B) Photothermal heating curves and (C) infrared thermal images of Pt-Cu@PLL@HA solution with different concentrations (0, 25, 50, 100, 200 and 400 μg·mL^-1) under laser irradiation (1 064 nm, 1 W·cm^-2) as a function of time (0-300 s); (D) Photothermal stability of Pt-Cu@PLL@HA

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  图 5  (A) 不同浓度Pt-Cu@PLL@HA分别孵育HUVEC和4T1细胞的存活率; (B) 经不同浓度的Pt-Cu和Pt-Cu@PLL@HA孵育4T1细胞后在1 064 nm (1 W·cm^-2)激光照射5 min下的细胞活性; (C) 不同样品与4T1共孵育后分别进行1 064 nm (1 W·cm^-2)的激光照射, 通过台盼蓝染色死细胞; ***P < 0.001

  Figure 5  (A) HUVEC and 4T1 cell viabilities after incubation with Pt-Cu@PLL@HA with various concentrations; (B) Cell viability of 4T1 cells after incubation with Pt-Cu and Pt-Cu@PLL@HA under laser irradiation (1 064 nm, 1 W·cm^-2, 5 min); (C)Micrographs of 4T1 cells incubated with the samples before or after irradiation with 1 064 nm laser (1 W·cm^-2), where dead cells are stained with trypan blue; ***P < 0.001

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  图 6  (A) 不同浓度Pt-Cu@PLL@HA的PA强度; 4T1荷瘤鼠静脉注射Pt-Cu@PLL@HA后在1 064 nm激光照射下不同时间点的(B) PA强度变化和(C) 活体PA成像

  Figure 6  (A) PA intensities of Pt-Cu@PLL@HA with different concentrations; (B) PA intensity changes and (C) PA imaging of 4T1 tumor-bearing mice after Pt-Cu@PLL@HA injection under 1 064 nm laser irradiation

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  图 7  4T1荷瘤鼠静脉注射PBS、Pt-Cu或Pt-Cu@PLL@HA后对肿瘤区域激光辐照(1 064 nm, 1 W·cm^-2)的(A) 红外热成像和(B) 肿瘤温度变化曲线; (C) 光热治疗后不同治疗组的小鼠照片; 各治疗组小鼠(D) 肿瘤体积和(E) 体重随时间的变化图; (F) 治疗结束后收集小鼠肿瘤组织的H & E染色; (G) Pt-Cu@PLL@HA治疗组小鼠主要器官的H & E染色图像; 标尺: 100 μm; ***P < 0.001

  Figure 7  (A) IRT images and (B) corresponding temperature curves of 4T1 tumor-bearing mice injected with PBS, Pt-Cu or Pt-Cu@PLL@HA under laser irradiation (1 064 nm, 1 W·cm^-2); (C) Representative photographs of mice of different groups after PTT; (D) Tumor volume and (E) body weight of mice from different groups after PTT; (F) H & E staining of the tumor tissues collected from mice at the end of treatment; (G) H & E-stained images of major organs collected from mices in Pt-Cu@PLL@HA group; Scale bar: 100 μm; ***P < 0.001

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