English

• 0.   引言

  次氯酸根(ClO^-)是一种重要的活性氧物种(reactive oxygen species，ROS)，广泛存在于生物体内^[1-3]。内源性ClO^-可通过髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的催化作用，由过氧化氢和氯化物反应生成^[4]。ClO^-由于具有强的氧化作用，可与各种蛋白质侧链和肽键发生反应，并在先天性免疫中起重要的杀菌作用。另一方面，过量的ClO^-会通过氧化含有硫醇、硫醚、血红素蛋白和氨基基团的生物分子从而导致靶细胞损伤和组织损伤^[5-6]，引起各种心血管疾病^[7]、神经元退化^[8]、关节炎^[9]和癌症等^[10]。因此，发展能够用于生命体内的ClO^-实时检测的分析方法，对于理解ClO^-的生理功能及其在相关疾病的发展中扮演的角色具有重要意义。

  虽然人们已经开发了比色法^[11]、电化学法^[12-13]、化学发光法^[14]等分析方法实现了体外ClO^-的检测，然而上述方法难以满足生命体内ClO^-的实时检测。另一方面，由于ClO^-在体内的半衰期短、扩散距离小^[15]，同时生命体内存在如H₂O₂、ONOO^-、O₂^-等强氧化剂通常会干扰ClO^-的检测，这些影响因素使得人们对内源性ClO^-的专一性检测变得尤为困难^[15]。小分子荧光探针作为一种优秀的检测工具，由于其优异的选择性和高灵敏度响应以及实时分析成像等优点，已经成为生命体系中相关生命物种检测的一种有效方法^[16-18]。鉴于ClO^-在生物体中的重要作用及其实时专一性检测的迫切需求，具有高灵敏高选择性ClO^-响应的荧光探针的开发也因此备受人们关注。

  近年来，人们设计合成了多种特异性检测ClO^-的荧光探针，并实现了生命体系内ClO^-的成像示踪^[19-24]。目前ClO^-荧光探针的设计主要是利用ClO^-对响应基团的选择性氧化设计而成。常用的响应基团主要有硫族化合物(硫、硒、碲元素)^[25]、碳碳双键^[26]、对甲氧基苯酚/胺及其衍生物^[27]、羟胺或肟基^[28]以及酰肼^[29]等。ClO^-易于将上述基团氧化，使响应基团转化为相关的氧化产物，从而改变这些富电子基团对荧光团的电荷转移或者光诱导电子转移效应，引起探针的荧光信号变化。虽然基于以上响应基团的荧光探针极大地丰富了ClO^-检测的手段，但需要指出的是，大多数探针仍存在响应时间长、抗干扰能力差等缺点。例如Yang等报道的花青素染料荧光探针BR-1对ClO^-的响应时间大于30 min^[30]。Shepherd和Sun等课题组报道的基于对甲氧基苯酚/胺氧化裂解机制的探针APF、HKOCl-1对ClO^-的响应时间大于5 min^[31-32]。Wu等报道的基于C=C氧化机制的探针Py-Cy对于ClO^-的响应时间长达30 min^[33]。Li和Liu等课题组报道的基于酰肼氧化的探针RPTPP和CC-ONOO容易同时受到过氧化亚硝酰等氧化物种的干扰^[34-35]。因此，具有高灵敏、专一性响应的ClO^-探针的开发仍然是化学家需要解决的问题之一^[30]。

  在有机合成中，醛基可与羟胺反应被保护为肟，在温和条件下，肟可以被ClO^-快速氧化，从而重新回到醛基的状态^[36]。与硫族、碳碳双键、对甲氧基苯酚/胺及其衍生物等基团的相对较慢的氧化反应速率相比，肟与ClO^-迅速反应，反应时间通常小于10 s^[37]。因此，基于ClO^-氧化肟基的检测机制是用来构建高灵敏响应ClO^-探针的常用策略之一。Lin等构建了首例基于ClO^-氧化脱除肟基机制的荧光探针Probe 1^[38]。随后人们在该探针的基础上，通过选用不同的荧光团及调控肟基被氧化的能力，获得了性质各异的ClO^-荧光探针^[39-40]。然而需要指出的是，常见的肟基氧化后的基团一般为醛基或酮基。这些基团很容易在生成之后进一步与生命体内大量的含硫物种(如谷胱甘肽、半胱氨酸等)发生加成反应，从而导致荧光信号进一步发生变化，干扰探针对于ClO^-的检测^[41-42]。为克服含硫物种对于ClO^-检测的干扰，同时满足ClO^-实时快速检测的需求，本研究中，我们通过将香豆素的内酯羰基转换为肟基，设计合成了一种新颖的ClO^-探针Cou-HC。 Cou-HC 不仅可以在水溶液中选择性地被ClO^-快速氧化(响应时间小于1 s)，荧光强度增强15倍，而且该氧化过程不受pH、活性氧、活性硫以及金属离子等相关生理物种的影响。最为重要的是，氧化后所得到的香豆素可以稳定存在，不会与含硫物种进一步发生反应，从而避免了含硫物种对产物进一步反应带来的干扰。我们还进一步利用Cou-HC 实现了细胞中内源及外源性的ClO^-的实时检测，证明了 Cou-HC 在生命体系内对于ClO^-高选择性实时检测的能力。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  所有的试剂都直接购买自商业公司，无需进一步纯化。柱层析硅胶粉购买自青岛海洋化工公司。¹H和¹³C NMR谱在Bruker AVANCE Ⅲ HD核磁共振仪上获得。紫外可见吸收和荧光光谱分别在岛津UV-1750的紫外分光光度计以及HORIBA Fluoromax-4荧光光谱仪上测得。质谱数据从Bruker Daltonics micro TQF-Q Ⅱ的高分辨质谱(HRMS)测试得到。高效液相色谱(HPLC)采用岛津LC-20A进行。细胞成像实验采用Zeiss LSM 710激光共聚焦荧光显微镜进行。

  1.2   Cou-HC及香豆素中间体的合成和表征

  1.2.1   3-苯并噻唑基-7-甲氧基-2-亚氨基-香豆素(1) 的合成

  取50 mL二口烧瓶，加入原料5-甲氧基水杨醛(1.9 g，13 mmol)和苯并噻唑-2-乙腈(2.3 g，13 mmol)，加入无水乙醇(10 mL)溶解，加入哌啶(130 μL，1.3 mmol)。将体系加热至80 ℃，搅拌回流1 h，反应结束。停止反应，冷却至室温，有固体析出，抽滤得到产物并用无水乙醇洗涤，得到固体产物，产率为75%。¹H NMR(600 MHz，CDCl₃)：δ 8.32(s，1H)，8.04 (d，J=6 Hz，1H)，7.48~7.50(m，1H)，7.37~7.39(m，2H)，6.74(dd，J=6 Hz, 1H)，6.68(d，J=6 Hz，1H)，3.86(s，3H)。¹³C NMR(150 MHz，CDCl₃)：δ 163.4，155.2，141.7，136.2, 130.5，129.9，126.4，126.3，125.2，122.9，121.4，113.9，112.5，111.5，100.5，100.4，55.8。

  1.2.2   3-苯并噻唑基-7-甲氧基-香豆素(2)的合成

  取50 mL二口烧瓶，加入香豆素1(3.2 mmol)，加入4 mol·L^-1 HCl，60 ℃下反应4 h。反应结束后，将pH值调至中性，用CH₂Cl₂萃取3次，水洗5~6次(除去体系中的DMF溶剂)，用饱和食盐水洗3次，柱层析分离提纯，得到黄棕色固体0.60 g，产率为61%。¹H NMR(600 MHz，CDCl₃)：δ 9.02(s，1H)，8.06(d，J=6 Hz，1H)，7.97(d，J=6 Hz，1H)，7.62(d，J=6 Hz，1H)，7.51~7.53(m, 1H), 7.40~7.42(m, 2H)，6.92~6.96(m，2H)，3.93(s，3H)。¹³C NMR (150 MHz，CDCl₃)：δ 164.3，160.5, 160.2，156.0，152.5，141.7，136.6，130.5，126.4，125.1，122.6，121.7，116.8，114.0，112.7，100.6，56.0。

  1.2.3   Cou-HC的合成

  取50 mL二口烧瓶，加入香豆素1(1 g，3.2 mmol)，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(5 mL)溶解。将盐酸羟胺(334 mg，4.8 mmol)和10% H₂SO₄(1 mL)溶于甲醇(5 mL)中，加入反应体系中。将反应体系加热至90 ℃，搅拌回流3 h。停止反应，冷却至室温，有黄色固体析出，抽滤得到产物并用无水乙醇洗涤，得到黄色固体0.59 g，产率57%。¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 10.88(s，1H)，8.35(s，1H)，8.12(d，J= 6 Hz，1H)，8.03(d，J=12 Hz，1H)，7.66(d，J=12 Hz，1H)，7.54(t，J=6 Hz，1H)，7.44(t，J=6 Hz，1H)，6.89(s，1H)，6.83(d，J=6 Hz，1H)，3.85 (s，3H)。¹³C NMR (150 MHz，DMSO-d₆)：δ 163.0，160.4，154.2，152.1，146.5，136.6, 131.1，130.9，126.9，125.5，122.8，122.3，117.9，112.9，111.8，101.0，56.4。HRMS (ESI positive)：[M+ H]⁺ (C₁₇H₁₃N₂O₃S) m/z 计算值：325.064 1，实验值：325.065 4。元素分析按C₁₇H₁₂N₂O₃S的计算值(%)：C 62.95，H 3.73，N 8.64；实验值(%)：C 62.99，H 3.80，N 8.53。

  1.3   Cou-HC的光物理性质表征

  以DMF为溶剂，制备10 mmol·L^-1 Cou-HC 浓储备液。用CH₃CN/phosphate缓冲液(PBS)稀释原液(1∶9，V/V，pH=8，0.4%吐温80)。Cou-HC 在激发波长为400 nm，狭缝宽度为1 nm的情况下记录荧光光谱。选择性响应测试中所用活性氧物种参考文献^[18]配制。

  1.4   Cou-HC的荧光量子产率

  以香豆素6(3-(2′-苯并噻唑基)-7-二乙氨基香豆素)为标准品(在乙醇中，φ_standard=0.8)，测定量子产率。对探针和香豆素6 在0.01~0.05的吸光度范围内进行吸收光谱的测量。根据以下公式计算量子产率：

  $ \varphi_{\text {sample }}=\varphi_{\text {sample }} \frac{A_{\text {standard }} \sum F_{\text {sample }}}{A_{\text {sample }} \sum F_{\text {standard }}} \frac{n_{\text {sample }}^{2}}{n_{\text {standard }}^{2}} $

  其中φ 是量子产率，ΣF 是积分荧光强度，A 是在λ_ex =400 nm处的吸光度，n 表示溶剂的折射率。

  1.5   生物细胞培养及成像

  在含有10% 胎牛血清、100 mL^-1青霉素以及100 μg·mL^-1链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养巨噬细胞(RAW 264.7)。细胞在体积分数5% 的二氧化碳、饱和湿度、37 ℃培养箱中培养。

  细胞实验分为4组。第一组是将细胞与10 μmol·L^-1 Cou-HC 一起孵育30 min，PBS洗涤3次，进行细胞成像。第二组细胞用ABH(250 μmol·L^-1) 预处理4 h后洗去，再与10 μmol·L^-1 Cou-HC 一起孵育30 min，PBS洗涤，进行细胞成像。第三组细胞用ABH(250 μmol·L^-1)预处理4 h后洗去，再用NaClO (20 μmol·L^-1)孵育4 h，与10 μmol·L^-1 Cou-HC 一起孵育30 min，PBS洗涤，进行细胞成像。第四组细胞用ABH(250 μmol·L^-1)预处理4 h后洗去，再与LPS(5 μg·mL^-1)和PMA(5 μg·mL^-1)孵育12 h，然后与10 μmol·L^-1 Cou-HC 一起孵育30 min，PBS洗涤3次，进行细胞成像。激发波长405 nm，光谱波长范围为430~600 nm。

  2.   结果与讨论

  2.1   Cou-HC的设计与合成

  香豆素类分子是一类经典的荧光分子，因其具有发光效率高、波长可调、生物兼容性好等优势已被广泛应用于荧光检测与成像领域^[43]。我们以3-苯并噻唑基-7-甲氧基-香豆素(2)为发光母体，通过对其2位进行肟基修饰，设计合成了Cou-HC。 Cou-HC 的合成如Scheme 1所示。5-甲氧基水杨醛与2-氰甲基苯并噻唑在哌啶的催化下缩合成环，得到3-苯并噻唑基-7-甲氧基-2-亚氨基香豆素(1)。香豆素1 与盐酸羟胺在含有硫酸和N，N-二甲基甲酰胺的甲醇溶液中反应可得Cou-HC。由于肟的C= N在激发态条件下的顺反异构会导致分子荧光猝灭^[40]，因此Cou-HC 在PBS中的初始荧光较弱。而与ClO^-反应后，肟基被氧化水解，Cou-HC 转化为具有良好发光性能的香豆素2。因此，Cou-HC 对ClO^-的响应将表现为明显的荧光增强行为。另外，由于香豆素2 的内酯羰基稳定性远高于醛基，难以被谷胱甘肽等含硫物种加成，因此在生命体系内， Cou-HC 对ClO^-响应的荧光信号有望不受这些物种的影响。Cou-HC 的结构经核磁共振氢谱、碳谱、高分辨质谱和元素分析进行表征(图S5~S7，Supporting information)。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis and response mechanism of Cou-HC

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.2   Cou-HC的响应机理

  为了验证上述反应的机理，我们采用HPLC对 Cou-HC 与ClO^-之间的响应机理进行了研究。如图 1所示，Cou-HC(10 μmol·L^-1)和香豆素2(10 μmol· L^-1)的甲醇溶液的吸收峰均为单峰，保留时间分别为4.2 min(Cou-HC)和4.64 min(香豆素2)。在探针溶液中加入ClO^-后，探针溶液的HPLC谱图在4.64 min处出现了新的吸收峰，与香豆素2 的吸收峰一致，这一结果表明Cou-HC 与ClO^-反应的过程中生成了香豆素2，与我们推测的反应机理一致。

  图 1

  

  图 1.  Cou-HC和香豆素2以及Cou-HC加入ClO^-后的HPLC分析

  Figure 1.  HPLC analysis of Cou-HC, coumarin 2 and Cou-HC treated with ClO^-

  Red line: Cou-HC (10 μmol·L^-1) treated with ClO^- 20 μmol·L^-1) for 1 min; HPLC condition: 1.0 mL·min^-1 flow rate, 95% acetonitrile and 5% water for 20 min; all samples were diluted to 10 μmol·L^-1 before the test; the wavelength for detection was 400 nm

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.3   探针的光谱性质

  所有的光物理性质表征均在室温条件下的CH₃CN/PBS(1∶9，V/V，10 mmol·L^-1，pH=8，含0.4%吐温80)中进行。首先，我们对Cou-HC 的紫外可见吸收和荧光光谱分别进行了测试，如图 2a所示，Cou-HC 的最大吸收波长为400 nm，摩尔消光系数为34 880 L·mol^-1·cm^-1。Cou-HC 的最大发射波长在465 nm处，荧光量子效率为3.9%(图 2b)。

  图 2

  

  图 2.  Cou-HC (5 μmol·L^-1)在室温下CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中的紫外可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)

  Figure 2.  UV-Vis absorption (a) and fluorescence emission (b) spectra of Cou-HC (5 μmol·L^-1) in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80) at room temperature

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  为了研究Cou-HC 对ClO^-的荧光响应行为，我们对Cou-HC 进行了ClO^-的荧光滴定实验，实验结果如图 3a所示。从荧光光谱的变化可以看出，随着ClO^-浓度的增加，探针的荧光强度逐渐增强，增强倍数为15倍，且最大发射波长从465 nm处红移至480 nm。我们对465 nm处的荧光强度随ClO^-浓度增加的趋势进行分析可知(图 3b)，荧光强度的增加在ClO^-浓度为10~50 μmol·L^-1范围内有很好的线性关系。当ClO^-的浓度增加至70 μmol·L^-1时，Cou-HC 的荧光强度增加至最大，即使将ClO^-浓度继续增加至100 μmol·L^-1，荧光强度也基本保持不变。此时量子产率为66%，与香豆素2 的量子产率基本一致，表明Cou-HC 已全部转化为香豆素2。根据检测限计算公式LOD=3σ/k(n=3)，确定了Cou-HC 对ClO^-的检测限为0.11 μmol·L^-1(图 4，表S1)。与已经报道的香豆素类肟基探针CMSH相比^[28]，Cou-HC 的检测限较低，有高的量子产率，表明Cou-HC 对ClO^-具有较高的灵敏度，可以应用于低浓度ClO^-的检测。

  图 3

  

  图 3.  (a) 室温下Cou-HC在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中随ClO^-浓度变化的荧光发射光谱; (b) 随ClO^-浓度变化的Cou-HC在465 nm处的荧光发射强度

  Figure 3.  (a) ClO^- concentration-dependent fluorescence emission spectra of Cou-HC (5 μmol·L^-1) in CH₃CN/PBS(1:9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80) at room temperature; (b) ClO^- concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC (5 μmol·L^-1)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  图 4

  

  图 4.  Cou-HC (5 μmol·L^-1)在465 nm处荧光发射强度随ClO^-浓度变化的线性拟合曲线

  Figure 4.  Linear fitting curve of ClO^- concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC (5 μmol·L^-1)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.4   Cou-HC的选择性测试

  Cou-HC 的一个重要特征是它对于一种分析物具有特异性检测功能。为了考察Cou-HC 对ClO^-的特异性检测能力，我们测试了Cou-HC 在生命体内各种潜在干扰物质存在下的荧光响应(图 5a)。结果表明，ClO^-的加入引起了明显的荧光强度变化， Cou-HC 的荧光光谱在最大发射峰处均有增强，加入其他分析物(50 μmol·L^-1)后，Cou-HC 的荧光强度并未发生明显变化。同时，我们还测试了香豆素2 在不同氨基酸中的荧光响应。从图 5b中可以看出，香豆素2 的荧光强度在氨基酸以及亚硫酸根等含硫物种的存在下保持稳定。这一结果说明香豆素2 在生理条件下可以排除这些含硫物种对ClO^-检测的干扰。以上结果表明探针对ClO^-具有高的选择性响应，有利于其在生命体系内ClO^-检测的应用。

  图 5

  

  图 5.  (a) 室温下Cou-HC在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中与10倍的ClO^-和其他分析物反应的荧光强度的变化; (b) 香豆素2在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中与不同氨基酸分析物反应的荧光强度的变化, 数据为平均值±S.E.M., n=3

  Figure 5.  (a) Fluorescent intensity changes of Cou-HC (5 μmol·L^-1) with 10 eq. of ClO^- and other analysts in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80); (b) Fluorescent intensity changes of coumarin 2 (5 μmol·L^-1) with amino-acid analysts in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80), Data are mean ±S.E.M., n=3

  In (a): 1: Blank, 2: Na⁺, 3: K⁺, 4: Mg²⁺, 5: Ca²⁺, 6: Cu²⁺, 7: Fe³⁺, 8: Fe²⁺, 9: Zn²⁺, 10: CO₃^2-, 11: SO₄^2-, 12: SO₃^2-, 13: HSO₃^-, 14: S^2-, 15: HS^-, 16: Hcy, 17: Cys, 18: GSH, 19: ROO·, 20: H₂O₂, 21: ₁O₂, 22: HO·, 23: NO, 24: ONOO^-, 25: ClO^-; In (b): 1: Blank, 2: Cys, 3: Hcy, 4: GSH, 5: HS^-, 6: S^2-, 7: HSO₃^-, 8: SO₃^2-

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.5   Cou-HC反应动力学响应实验与对pH依赖性实验

  为了研究Cou-HC 与ClO^-响应的速率，我们进一步考察了Cou-HC 对ClO^-的动力学响应过程，测试结果如图 6a所示。结果表明，向含Cou-HC 的PBS加入不同浓度的ClO^-后，Cou-HC 均能与ClO^-立即反应，响应时间小于3 s，并在短时间内基本保持稳定。Cou-HC的响应时间小于APF、HKOCl-1、Py-Cy等探针^[31-33]，证明了Cou-HC 对于ClO^-的快速响应能力。

  图 6

  

  图 6.  (a) Cou-HC在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中分别与不同浓度ClO^-作用时在466 nm处的荧光发射强度随时间的变化; (b) Cou-HC在不同pH值的CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中与ClO^-反应后在466 nm处荧光发射强度的变化

  Figure 6.  (a) Time-dependent emission fluorescent intensity of Cou-HC (5 μmol·L^-1) at 466 nm with various concentrations of ClO^- in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80) at room temperature; (b) Effects of pH value on fluorescent intensity at 466 nm of Cou-HC (5 μmol·L^-1) after reacting with ClO^- in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  我们还研究了Cou-HC 在不同pH值(4.0~11.0) 条件下对ClO^-的响应情况。如图 6b所示，Cou-HC 的荧光强度在pH=4~11范围内高度稳定，表明 Cou-HC 具有稳定的非pH依赖的荧光特性。加入ClO^-后，Cou-HC 的荧光强度在pH=4~6范围内没有明显增强。这是因为次氯酸是弱电解质，在强酸中电离出来的ClO^-会结合氢离子，生成弱酸，不稳定，导致ClO^-的浓度降低，进而导致Cou-HC 难以被氧化，从而表现不出明显的荧光增强行为。在pH=10~ 11的碱性范围内，Cou-HC+ClO^-体系的荧光强度与pH=8时相比略有降低。这可能是因为Cou-HC 的肟基在碱性条件下部分成盐，导致Cou-HC 的氧化程度降低。在pH=8时，Cou-HC+ClO^-体系的荧光发射的强度增强最为明显，增强倍数约为15倍，这与上述荧光滴定及动力学实验结果一致。

  以上光物理性质测试结果表明，Cou-HC 对ClO^-的响应有灵敏度高、特异性高、响应时间快等优点，具有应用于细胞内ClO^-检测及成像的潜力。

  2.6   细胞成像

  RAW 264.7是一种免疫细胞，是维持体内平衡所必需的细胞种类之一，能够产生次氯酸杀伤侵入体内的病原体^[44]。因此，我们进一步选用该细胞研究了探针分子对细胞内ClO^-的成像能力。

  首先，将细胞与Cou-HC(10 μmol·L^-1)在25 ℃下孵育30 min，然后通过共聚焦激光扫描显微镜成像。由图 7a可以看出细胞内部显示出微弱的荧光，表明该化合物具有良好的细胞渗透性。我们分别用ABH(内源性ClO^-清除剂)和NaClO(外源性ClO^-供体)处理细胞后，再与Cou-HC 一起孵育30 min后进行荧光成像，得到图 7b和7c。由图 7b可以看出，细胞内的荧光强度与7a相比有明显的减弱，荧光强度下降约2倍。而图 7c细胞内的荧光明显增强，强度与图 7a相比增强约6倍。从图 7c和7d可以看出，外源性NaClO的加入，使得细胞内荧光强度增强，而经ABH处理之后，荧光强度明显减弱(图 7d)。因此，图 7c中荧光强度的变化是由ClO^-与探针反应引起。为了验证Cou-HC 对ClO^-成像的特异性，我们用LPS/PMA(内源性ClO^-诱导剂)处理后的细胞进行孵育。结果(图 7e)表明，加入诱导剂LPS/PMA后，荧光强度与图 7b相比增强约5倍。而经LPS/PMA处理后的细胞进一步用ABH处理后，荧光明显降低至与图 7b类似的水平(图 7f)。以上成像实验表明， Cou-HC 对ClO^-具有优异的成像能力，可以对细胞中外源性和内源性的ClO^-进行特异性检测，达到细胞内ClO^-可视化的效果。

  图 7

  

  图 7.  Cou-HC在RAW 264.7细胞中的共聚焦荧光成像: (a) 细胞与Cou-HC孵育; (b) 将细胞用ClO^-清除剂ABH (250 μmol·L^-1, 4 h)预处理, 再与Cou-HC孵育; (c) 用NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h)处理细胞, 再与Cou-HC孵育; (d) 用NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h)孵育, 然后用ABH (20 μmol·L^-1, 4 h)预处理细胞, 再与Cou-HC孵育; (e) 用LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)处理细胞12 h, 再与Cou-HC孵育; (f) 用LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)预处理细胞12 h, 用ABH (250 μmol·L^-1, 4 h)处理细胞, 再与Cou-HC孵育; (g) 图a~f中的平均荧光强度, 比例尺10 μm, 数据为平均值±S.E.M., n=3

  Figure 7.  Confocal fluorescence imaging of probe Cou-HC in RAW 264.7 cells: (a) cells incubated with probe Cou-HC; (b) cells pretreated with ClO^- scavenger ABH (250 μmol·L^-1, 4 h), and incubated with probe Cou-HC; (c) cells pretreated with NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h), and incubated with probe Cou-HC; (d) cells pretreated with NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h), then incubated with ABH (250 μmol·L^-1, 4 h), and then incubated with probe Cou-HC; (e) cells treated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 12 h, and then incubated with probe Cou-HC; (f) cells pretreated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 12 h, then treated with ABH (250 μmol·L^-1, 4 h), and then incubated with probe Cou-HC; (g) average fluorescence intensity in Fig.a~f, scale bar: 10 μm, data=mean±S.E.M., n=3

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.   结论

  综上所述，我们设计了一种特异性检测ClO^-的增强型荧光探针Cou-HC，其以香豆素为荧光团，肟基为识别基团，能实现对ClO^-灵敏、快速的特异性识别。供电子基团的引入使得Cou-HC 的荧光发射增强至15倍，检测限为0.11 μmol·L^-1，荧光量子产率增加了62%。此外，细胞成像研究表明，Cou-HC 可以有效地进行活细胞中的内源和外源ClO^-的低毒性成像。因此，Cou-HC 在活细胞中ClO^-的检测具有潜在的应用前景。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
• 1. [1]

     D'Autreaux B, Toledano M B. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. , 2007, 8(10): 813-824 doi: 10.1038/nrm2256

  2. [2]

     Hawkins C L, Davies M J. Chem. Res. Toxicol. , 2005, 18: 1600-1610 doi: 10.1021/tx050207b

  3. [3]

     Winterbourn C C. Nat. Chem. Biol. , 2008, 4(5): 278-286 doi: 10.1038/nchembio.85

  4. [4]

     Christine J D, Michael W W, Winterbourn C C, Kettle A J. Biochem. J. , 1997, 327: 487-492 doi: 10.1042/bj3270487

  5. [5]

     Fu S, Davies M J, Stocker R, Dean R T. Biochem. J. , 1998, 333: 519-525 doi: 10.1042/bj3330519

  6. [6]

     Squadrito G L, Postlethwait E M, Matalon S. Am. J. Physiol. Lung C, 2010, 299(3): 289-300 doi: 10.1152/ajplung.00077.2010

  7. [7]

     Anatoliotakis N, Deftereos S, Bouras G, Giannopoulos G, Tsounis D, Angelidis C, Kaoukis A, Stefanadis C. Curr. Top. Med. Chem. , 2013, 13: 115-138 doi: 10.2174/1568026611313020004

  8. [8]

     Yap Y W, Whiteman M, Bay B H, Li Y, Sheu F S, Qi R Z, Tan C H, Cheung N S. J. Neurochem. , 2006, 98(5): 1597-1609 doi: 10.1111/j.1471-4159.2006.03996.x

  9. [9]

     Li H F, Miao Y, Liu Z X, Wu X, Piao C X, Zhou X. Dyes Pigm. , 2020, 176: 108192 doi: 10.1016/j.dyepig.2020.108192

  10. [10]

      Meng H, Huang X Q, Lin Y, Yang D Y, Lv Y J, Cao X Q, Zhang G X, Dong J, Shen S L. Spectrochim. Acta Part A, 2019, 223: 117355 doi: 10.1016/j.saa.2019.117355

  11. [11]

      Grundler P, Holzapfel H. Talanta, 1971, 18: 147-153 doi: 10.1016/0039-9140(71)80023-1

  12. [12]

      Zhou Y, Pei W B, Wang C Y, Zhu J X, Wu J S, Yan Q Y, Huang L, Huang W, Yao C, Loo J S C, Zhang Q C. Small, 2014, 10(17): 3560-3567 doi: 10.1002/smll.201303127

  13. [13]

      Zhao C C, An J C, Zhou L, Fei Q, Wang F Y, Tan J, Shi B, Wang R, Guo Z Q, Zhu W H. Chem. Commun. , 2016, 52(10): 2075-2078 doi: 10.1039/C5CC08936K

  14. [14]

      Xiao H D, Xin K, Dou H F, Yin G, Quan Y W, Wang R Y. Chem. Commun. , 2015, 51(8): 1442-1445 doi: 10.1039/C4CC07411D

  15. [15]

      Parvez S, Long M J C, Poganik J R, Aye Y. Chem. Rev. , 2018, 118(18): 8798-8888 doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00698

  16. [16]

      Chen X Q, Wang F, Hyun J Y, Wei T W, Qiang J, Ren X T, Shin I, Yoon J. Chem. Soc. Rev. , 2016, 45(10): 2976-3016 doi: 10.1039/C6CS00192K

  17. [17]

      Li X H, Gao X H, Shi W, Ma H M. Chem. Rev. , 2014, 114(1): 590-659 doi: 10.1021/cr300508p

  18. [18]

      Sun Q, Xu J J, Ji C L, Shaibani M S S, Li Z, Lim K, Zhang C W, Li L, Liu Z P. Anal. Chem. , 2020, 92(5): 4038-4045 doi: 10.1021/acs.analchem.9b05599

  19. [19]

      Hu J J, Wong N K, Gu Q S, Bai X Y, Ye S, Yang D. Org. Lett. , 2014, 16(13): 3544-3547 doi: 10.1021/ol501496n

  20. [20]

      Lin W Y, Long L L, Chen B B, Tan W. Chem. Eur. J. , 2009, 15(10): 2305-2309 doi: 10.1002/chem.200802054

  21. [21]

      Lou Z R, Li P, Song P, Han K L. Analyst, 2013, 138(21): 6291-6295 doi: 10.1039/c3an00198a

  22. [22]

      Shi J, Li Q Q, Zhang X, Peng M, Qin J G, Li Z. Sens. Actuators B, 2010, 145(1): 583-587 doi: 10.1016/j.snb.2009.11.003

  23. [23]

      Koide Y, Urano Y, Kenmoku S, Kojima H, Nagano T. J. Am. Chem. Soc. , 2007, 129(34): 10324-10325 doi: 10.1021/ja073220m

  24. [24]

      Zhao N, Wu Y H, Wang R M, Shi L X, Chen Z N. Analyst, 2011, 136(11): 2277-2282 doi: 10.1039/c1an15030h

  25. [25]

      Wu L, Wu I C, DuFort C C, Carlson M A, Wu X, Chen L, Kuo C T Qin Y L, Yu J B, Hingorani S R, Chiu D T. J. Am. Chem. Soc. , 2017, 139(20): 6911-6918 doi: 10.1021/jacs.7b01545

  26. [26]

      Zhang X F, Zhao W Y, Li B, Li W Q, Zhang C X, Hou X C, Jiang J, Dong Y Z. Chem. Sci. , 2018, 9(43): 8207-8212 doi: 10.1039/C8SC03226B

  27. [27]

      Wu G S, Thirumalaivasan N, Lin T C, Wu S P. J. Pharm. Biomed. Anal. , 2020, 190: 113545 doi: 10.1016/j.jpba.2020.113545

  28. [28]

      He X J, Chen H, Xu C C, Fan J Y, Xu W, Li Y H, Deng H, Shen J L. J. Hazard. Mater. , 2020, 388: 122029 doi: 10.1016/j.jhazmat.2020.122029

  29. [29]

      Liu L Y, Jiang L P, Yuan W, Liu Z K, Liu D Y, Wei P, Zhang X Y, Yi T. ACS Sens. , 2020, 5(8): 2457-2466 doi: 10.1021/acssensors.0c00640

  30. [30]

      Yang J J, Zheng W B, Shen Y, Xu Y Z, Lv G L, Li C X. J. Lumin. , 2020, 226: 117460 doi: 10.1016/j.jlumin.2020.117460

  31. [31]

      Liu D D, Feng S M, Feng G Q. Sens. Actuators B, 2018, 269: 15-21 doi: 10.1016/j.snb.2018.04.152

  32. [32]

      Sun Z N, Liu F Q, Chen Y, Tam P K H, Yang D. Org. Lett. , 2008, 10(11): 2171-2174 doi: 10.1021/ol800507m

  33. [33]

      Wu Y L, Wang J, Zeng F, Huang S L, Huang J, Xie H T, Yu C M, Wu S Z. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8(2): 1511-1519 doi: 10.1021/acsami.5b11023

  34. [34]

      Li H Y, Li X H, Wu X F, Shi W, Ma H M. Anal. Chem. , 2017, 89(10): 5519-5525 doi: 10.1021/acs.analchem.7b00503

  35. [35]

      Zhu B C, Zhang M, Wu L, Zhao Z Y, Liu C Y, Wang Z K, Duan Q X, Wang Y W, Jia P. Sens. Actuators B, 2018, 257: 436-441 doi: 10.1016/j.snb.2017.10.170

  36. [36]

      Khurana J M, Ray A, Sahoo P K. Bull. Chem. Soc. Jpn. , 1994, 67(4): 1091-1093 doi: 10.1246/bcsj.67.1091

  37. [37]

      Dong S Q, Zhang L J, Lin Y J, Ding C F, Lu C. Analyst, 2020, 145(15): 5068-5089 doi: 10.1039/D0AN00645A

  38. [38]

      Lin W Y, Long L L, Chen B B, Tan W. Chem. Eur. J. , 2009, 15: 2305-2309 doi: 10.1002/chem.200802054

  39. [39]

      Shi Y, Huo F J, Yin C X. Sens. Actuators B, 2020, 325: 128793 doi: 10.1016/j.snb.2020.128793

  40. [40]

      Yang X F, Shi W D, Dong X L, Cui C Y, Huang X, Wang X, Xie H X, Li Y X, Yan M, Cui Y, Sun G X. Polyhedron, 2020, 185: 114563 doi: 10.1016/j.poly.2020.114563

  41. [41]

      Wang B S, Li P, Yu F B, Song P, Sun X F, Yang S Q, Lou Z R, Han K L. Chem. Commun. , 2013, 49(10): 1014-1016 doi: 10.1039/C2CC37803E

  42. [42]

      Liu S R, Wu S P. Org. Lett. , 2013, 15(4): 878-881 doi: 10.1021/ol400011u

  43. [43]

      Cao D X, Liu Z P, Verwilst P, Koo S, Jangjili P, Kim J S, Lin W Y. Chem. Rev. , 2019, 119(18): 10403-10519 doi: 10.1021/acs.chemrev.9b00145

  44. [44]

      Watanabe S, Alexander M, Misharin A V, Budinger G R S. J. Clin. Invest. , 2019, 129(7): 2619-2628 doi: 10.1172/JCI124615

• 

  Scheme 1  Synthesis and response mechanism of Cou-HC

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 1  Cou-HC和香豆素2以及Cou-HC加入ClO^-后的HPLC分析

  Figure 1  HPLC analysis of Cou-HC, coumarin 2 and Cou-HC treated with ClO^-

  Red line: Cou-HC (10 μmol·L^-1) treated with ClO^- 20 μmol·L^-1) for 1 min; HPLC condition: 1.0 mL·min^-1 flow rate, 95% acetonitrile and 5% water for 20 min; all samples were diluted to 10 μmol·L^-1 before the test; the wavelength for detection was 400 nm

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  Cou-HC (5 μmol·L^-1)在室温下CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中的紫外可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)

  Figure 2  UV-Vis absorption (a) and fluorescence emission (b) spectra of Cou-HC (5 μmol·L^-1) in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80) at room temperature

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 3  (a) 室温下Cou-HC在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中随ClO^-浓度变化的荧光发射光谱; (b) 随ClO^-浓度变化的Cou-HC在465 nm处的荧光发射强度

  Figure 3  (a) ClO^- concentration-dependent fluorescence emission spectra of Cou-HC (5 μmol·L^-1) in CH₃CN/PBS(1:9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80) at room temperature; (b) ClO^- concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC (5 μmol·L^-1)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 4  Cou-HC (5 μmol·L^-1)在465 nm处荧光发射强度随ClO^-浓度变化的线性拟合曲线

  Figure 4  Linear fitting curve of ClO^- concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC (5 μmol·L^-1)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 5  (a) 室温下Cou-HC在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中与10倍的ClO^-和其他分析物反应的荧光强度的变化; (b) 香豆素2在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中与不同氨基酸分析物反应的荧光强度的变化, 数据为平均值±S.E.M., n=3

  Figure 5  (a) Fluorescent intensity changes of Cou-HC (5 μmol·L^-1) with 10 eq. of ClO^- and other analysts in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80); (b) Fluorescent intensity changes of coumarin 2 (5 μmol·L^-1) with amino-acid analysts in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80), Data are mean ±S.E.M., n=3

  In (a): 1: Blank, 2: Na⁺, 3: K⁺, 4: Mg²⁺, 5: Ca²⁺, 6: Cu²⁺, 7: Fe³⁺, 8: Fe²⁺, 9: Zn²⁺, 10: CO₃^2-, 11: SO₄^2-, 12: SO₃^2-, 13: HSO₃^-, 14: S^2-, 15: HS^-, 16: Hcy, 17: Cys, 18: GSH, 19: ROO·, 20: H₂O₂, 21: ₁O₂, 22: HO·, 23: NO, 24: ONOO^-, 25: ClO^-; In (b): 1: Blank, 2: Cys, 3: Hcy, 4: GSH, 5: HS^-, 6: S^2-, 7: HSO₃^-, 8: SO₃^2-

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 6  (a) Cou-HC在CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中分别与不同浓度ClO^-作用时在466 nm处的荧光发射强度随时间的变化; (b) Cou-HC在不同pH值的CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, 含0.4%吐温80)中与ClO^-反应后在466 nm处荧光发射强度的变化

  Figure 6  (a) Time-dependent emission fluorescent intensity of Cou-HC (5 μmol·L^-1) at 466 nm with various concentrations of ClO^- in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80) at room temperature; (b) Effects of pH value on fluorescent intensity at 466 nm of Cou-HC (5 μmol·L^-1) after reacting with ClO^- in CH₃CN/PBS (1∶9, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=8, containing 0.4% Tween 80)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 7  Cou-HC在RAW 264.7细胞中的共聚焦荧光成像: (a) 细胞与Cou-HC孵育; (b) 将细胞用ClO^-清除剂ABH (250 μmol·L^-1, 4 h)预处理, 再与Cou-HC孵育; (c) 用NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h)处理细胞, 再与Cou-HC孵育; (d) 用NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h)孵育, 然后用ABH (20 μmol·L^-1, 4 h)预处理细胞, 再与Cou-HC孵育; (e) 用LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)处理细胞12 h, 再与Cou-HC孵育; (f) 用LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)预处理细胞12 h, 用ABH (250 μmol·L^-1, 4 h)处理细胞, 再与Cou-HC孵育; (g) 图a~f中的平均荧光强度, 比例尺10 μm, 数据为平均值±S.E.M., n=3

  Figure 7  Confocal fluorescence imaging of probe Cou-HC in RAW 264.7 cells: (a) cells incubated with probe Cou-HC; (b) cells pretreated with ClO^- scavenger ABH (250 μmol·L^-1, 4 h), and incubated with probe Cou-HC; (c) cells pretreated with NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h), and incubated with probe Cou-HC; (d) cells pretreated with NaClO (20 μmol·L^-1, 4 h), then incubated with ABH (250 μmol·L^-1, 4 h), and then incubated with probe Cou-HC; (e) cells treated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 12 h, and then incubated with probe Cou-HC; (f) cells pretreated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 12 h, then treated with ABH (250 μmol·L^-1, 4 h), and then incubated with probe Cou-HC; (g) average fluorescence intensity in Fig.a~f, scale bar: 10 μm, data=mean±S.E.M., n=3

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
•