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• 配合物具有良好的生物特性，有望成为新一代金属基抗癌药物，其中非铂类金属(Ru、Ir和Os等)配合物的设计与研究已得到了广泛关注^[1-2]。Sadler等发现这类配合物相较于传统铂类配合物具有溶解性好、耐药性小以及光学性能优良等优势；同时其配位点众多，利于通过设计获得多变的复杂结构，从而进入生物体内识别或匹配生物大分子；此外，这类配合物具有低毒性，易于被生物体摄取和代谢，从而具有良好的生物相容性与应用可行性^[3-10]。其中，环金属钌配合物具有基于其相关配体的、可调节的、优越且独特的光物理和化学性质^[11]，包括高量子产率、长寿命光致发光、较大Stokes位移以及高效的单线态氧生成能力等，这使得它们被广泛用于蛋白质监测^[12]、疾病诊断^[13]、光动力治疗^{[5, 14]}等。

  以血清白蛋白为代表的生物分子作为生物体内重要组成部分，具有转运氨基酸、脂肪酸、金属离子以及药物等物质的作用^[15]。金属配合物与其发生作用将会影响自身在体内的吸收、释放与代谢^[16]，通过改变与金属中心配位的配体，可以调节配合物的结构，从而影响其与蛋白质的作用^[17]。同为生物大分子的DNA影响着生命与遗传性状的翻译与转录，甚至影响着疾病和进化^[18-19]，因此研究配合物与DNA作用引起了人们极大的关注。Ru²⁺、Zn²⁺、Co³⁺等配位饱和的金属配合物可以识别DNA的二级结构^[20]，且Ru配合物与DNA的相互作用已有很多文献报道^[21-22]，例如被称为“DNA光开关”的[Ru(bpy)₂ (dppz)]²⁺(dppz为二吡啶并吩嗪)及其衍生物，可以插入双链DNA碱基对之间并稳定DNA。有些环金属配合物已被作为DNA拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂等进行研究^[23]。

  反式阿魏酸(trans-ferulic acid，trans-FA)是一种存在于植物中的酚酸类化学物质，具有良好的稳定性，并被证明具有多种生物活性，例如抗氧化^[24]、抗癌^[25-27]等，其对正常的生物组织基本无毒，具有很好的生物利用度。基于此，我们设计并合成了2种尾接反式阿魏酸的新型钌配合物[Ru(cym)(L)Cl]Cl (Ru-1)与[Ru(bpy)₂(L)]Cl₂ (Ru-2)(cym=对伞花烃，bpy= 2, 2′-联吡啶，L=(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N- ((4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl)methyl)acrylamide)，通过¹H NMR及ESI-MS对其进行了基础结构表征，并利用紫外及荧光方法等研究了配合物的光学性质、单线态氧生成能力，以及与BSA及CT-DNA的相互作用。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  实验所用溶剂均采用分析纯试剂，根据实验需要，无须进一步纯化。除特殊要求，所有反应均在氩气保护氛围下进行。4，4′-dimethyl-2，2′-bipyri- dine购自阿拉丁试剂公司，反式阿魏酸购自安耐吉试剂公司。根据文献方法制备了配体(4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl)methanamine^[28-29]与金属钌前驱体[(η⁶-p-cym)RuCl₂]₂^[30]与cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]^[31]。

  ¹H NMR采用Bruker AVANCE 400 spectrometer测定(德国)。ESI - MS使用Thermo Scientific LCQ FLEET电喷雾质谱仪(美国)测定，测试条件为：Source Voltage 4.0 kV，Sheath Gas Flow Rate 8arb，Capillary Voltage 70 V，Capillary Temp 275 K，流动相为甲醇，流速为200 pL·min^-1，进样方式为直接进样，样品溶于甲醇。紫外吸收光谱为PerkinElmer Lambda 365紫外-可见光谱仪(美国)测定。荧光光谱为Edinburgh FS5荧光光谱仪(英国)测定。共聚焦成像实验用Nikon A1荧光共聚焦显微镜(日本)进行。

  1.2   配体及配合物的合成与表征

  1.2.1   配体L

  在氩气保护、冰浴条件下，将34.1 μL的三乙胺加入反式阿魏酸(48.5 mg，0.3 mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，49.8 mg，0.3 mmol)的无水DMF溶液(8 mL)中，搅拌15 min后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt，28.1 mg，0.2 mmol)并继续搅拌10 min，最后将(4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl) methanamine(50.0 mg，0.3 mmol)缓慢加入上述混合溶液中, 反应过夜。待反应结束后向溶液中加入80 mL冰水, 有黄色沉淀生成，过滤并依次用热水、乙醇和乙醚清洗多次，得到41.7 mg较纯的产物L，产率为45%。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 9.48(s，1H)，8.68(t，J=6.1 Hz，1H)，8.63~8.59(m，1H)，8.53(d，J=5.2 Hz, 1H)，8.32(d，J=0.8 Hz，1H)，8.26~8.22(m，1H)，7.40 (dd，J=12.8，9.1 Hz，1H)，7.34(dd，J=5.0，1.6 Hz，1H)，7.31~7.27(m，1H)，7.18(t，J=3.3 Hz，1H)，7.04(dd，J=8.2，1.9 Hz，1H)，6.81(d，J=8.1 Hz，1H)，6.57(d，J= 15.7 Hz，1H)，4.51(d，J=6.0 Hz，2H)，3.82(s，3H)，2.42 (s，3H)。¹³C NMR(101 MHz，DMSO-d₆)：δ 166.20，155.81, 155.42, 150.36, 149.60, 149.44，148.88，148.43，148.27, 140.31, 126.67, 125.47, 123.05，122.20，121.73，119.10，118.77，116.10，111.25，55.95，42.01，21.19。MALDI-MS：[L+H]⁺ m/z的理论值为376.16，实验值为376.29。

  1.2.2   配合物[Ru(cym)(L)Cl]Cl (Ru-1)

  在氩气氛围下，将芳基钌二聚体[(η⁶-p-cym) RuCl₂]₂(25.0 mg，0.04 mmol)、配体L(36.0 mg，0.1 mmol)溶于无水甲醇(10 mL)中，338 K回流过夜。待反应结束后除去溶剂，将粗产物通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(10:1，V/V)时得到黄色粉末，产量35.7 mg，产率为65%。¹H NMR(400 MHz，DMSO - d₆)：δ 9.56(s，1H)，9.45(d，J=5.9 Hz，1H)，9.38(d，J=5.9 Hz，1H)，8.90(t，J=5.9 Hz，1H)，8.62~8.56(m 1H), 8.54(s，1H)，7.68~7.58(m，2H)，7.42(d，J=15.7 Hz，1H), 7.18(d，J=1.8 Hz，1H), 7.05(dd，J=8.2，1.8 Hz, 1H)，6.84(t，J=7.1 Hz，1H)，6.63(d，J=15.8 Hz，1H)，6.20(t，J=6.6 Hz, 2H)，5.96(t，J=5.7 Hz，2H)，4.72~4.58(m，2H)，3.85~3.79(m，3H)，2.62~2.53(m，4H)，2.17(s，3H)，0.95 (dd，J=6.9，2.5 Hz，6H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d₆)：δ 166.50，155.91，155.50，154.62，154.30，153.90，152.47, 149.01, 148.27, 140.43, 128.75，126.60，125.84，124.85, 122.38, 122.17, 118.66, 116.14，111.40，103.73，103.68, 86.94, 86.83, 84.25，84.09，56.00，41.85，30.85，22.20，22.13，21.13，18.79。ESI-MS：[Ru-1-Cl]+ m/z的理论值为646.17，实验值为646.42。

  1.2.3   配合物[Ru(bpy)₂(L)]Cl₂(Ru-2)

  在氩气氛围下，将环金属钌前驱体 cis-[Ru(bpy)₂Cl₂](50.0 mg，0.1 mmol)、配体L(36.0 mg，0.1mmol)溶于乙醇/水(5.0 mL/2.5 mL)混合溶剂中，353 K下回流24 h。除去溶剂，将粗产物通过柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，9:1，V/V)，得到亮红色粉末，产量57.4 mg，产率为67%。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 9.56(s，1H)，8.95(t，J=6.0 Hz，1H)，8.86(d，J=7.5 Hz，5H)，8.80(s，1H)，8.21~8.11(m，4H)，7.74(dd，J=12.4，5.5 Hz，4H)，7.65(d，J=5.9 Hz，1H)，7.59~7.49(m, 5H), 7.41~7.34(m，3H)，7.13(d，J=1.8 Hz，1H), 7.01(dd，J=8.2，1.8 Hz, 1H), 6.82(d，J=8.1 Hz，1H)，6.62(d，J=15.8 Hz，1H)，4.61(t，J=5.5 Hz，2H)，3.80(s，3H)，2.55~2.52(m，3H)。¹³C NMR(101 MHz，DMSO - d₆)：δ 166.43，157.05，157.01，156.65，156.39，151.71，151.62, 151.54, 151.49, 151.41, 150.77，150.27，149.00，148.25, 140.22, 138.28, 138.23, 129.15，128.34，128.30，126.59, 126.30, 125.78, 124.97, 123.32，122.02，118.78，116.14，111.44，56.00，41.77，21.20。ESI-MS：[Ru-2-2Cl]²⁺ m/z的理论值为394.60，实验值为394.75。

  1.3   配合物的亲脂性

  通过摇瓶法分别将配合物Ru-1与Ru-2溶于水相与有机相的混合溶液中，并采用紫外-可见光谱进行定量分析。将水和正辛醇饱和2 d后分液，将配合物溶解于水相中，再向溶液中加入等体积正辛醇，置于摇床上振摇2 h，将混合相离心3 min(7 000 r·min^-1)，用紫外-可见光谱分别检测水相与有机相中配合物的吸光度，脂水分配系数lgP_O/W值可通过配合物在有机相和水相中浓度的比值取对数获得。

  1.4   配合物的紫外吸收光谱与荧光光谱

  在298 K下，将配合物用5 mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4，含10 mmol·L^-1 NaCl)配制为浓度为35 μmol·L^-1的溶液(DMSO和PBS的体积分数分别为5%和95%)。将溶液置于1 cm路径的石英比色皿中，测定的吸收波长范围为250~600 nm。将Ru-2的相应溶液(10 μmol·L^-1)使用荧光光谱测试其发射光谱，激发波长为454 nm，测定的发射波长范围为480~750 nm。

  1.5   配合物Ru-2的荧光pH响应

  配合物Ru-2的pH荧光响应与抗离子干扰实验均在DMSO水溶液(体积分数1%)中完成。Ru-2浓度为10 μmol·L^-1，用HCl或NaOH调节溶液的pH=3~12，配制完成后进行荧光测试。将各种离子对应的盐溶于水，其中碱金属与碱土金属(K⁺、Na⁺、Mg²⁺Ca²⁺)浓度为10 mmol·L^-1，过渡金属离子(Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Zn²⁺)浓度为10 μmol·L^-1，溶液配制完成后直接进行荧光光谱测试，激发波长设置为454 nm，扫描范围为500~850 nm。

  1.6   配合物的水解

  在298 K下通过紫外-可见光谱测定配合物的水解曲线。将配合物Ru-1、Ru-2配制成浓度为45 μmol·L^-1的溶液(DMSO和H₂O的体积分数分别为5%和95%)，置于1 cm光路路径的石英比色皿中，测定波长范围为250~450 nm，在24 h内记录吸光度值，间隔时间为10 min~4 h。

  1.7   配合物与CT-DNA相互作用

  用PBS(5 mmol·L^-1, pH=7.4, 含10 mmol·L^-1 NaCl)将CT-DNA溶解，储存在269 K温度下。溶液在PBS稀释后，进行浓度测定：置于1 cm路径的石英比色皿中通过紫外-可见光谱在波长为260 nm处测定吸光度，计算其浓度(ε=6 600 L·mol^-1·cm^-1)。其在260与280 nm处的吸光度比值约为1.9，说明CT-DNA不含蛋白质，可正常使用。在298 K下，将25 μmol·L^-1配合物溶液(DMSO和H₂O的体积分数分别为5%和95%)置于1 cm光路路径的石英比色皿中，依次加入16 μL CT-DNA溶液，CT-DNA与配合物的浓度比例r为0.2~1.4，其浓度为5~35 μmol·L^-1，并将混合物室温孵育7 min以达到平衡，测试时以相应浓度的CT-DNA溶于测试溶液体系作为空白对照进行基线扫描，测定波长范围为200~600 nm。

  1.8   配合物对DNA粘度的影响

  控制恒温水浴槽温度为(25±0.1) ℃，使用乌氏粘度计对配合物影响的CT-DNA粘度进行测量。用上述PBS配制50 μmol·L^-1的DNA溶液。测定时需固定DNA的浓度，依次向DNA溶液(10 mL)中依次加入2 mmol·L^-1配合物溶液5~25 μL，即配合物与DNA的浓度之比r为0.02~0.1。室温孵育7 min后记录样品流经毛细管所需的时间。

  1.9   配合物与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用

  将BSA溶解在PBS(5 mmol·L^-1，pH=7.4，含10 mmol·L^-1 NaCl)中并于269 K冰箱保存。测试时，在室温条件下将BSA(3 μmol·L^-1)溶液置于1 cm光路路径的石英比色皿中，依次加入等体积的配合物溶液，使配合物与BSA的比例r为0~6.7，其浓度为0~ 20.0 μmol·L^-1。室温孵育15 min达到平衡后，于BSA的激发波长280 nm处测定荧光强度，测定发射波长范围为300~550 nm。

  1.10   配合物的单线态氧产率

  使用1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)标定Ru-2的单线态氧产率^[32]，[Ru(bpy)₃]²⁺用作标准物。在29>K下，将DPBF、标准物[Ru(bpy)₃]²⁺、Ru-1、Ru-2均溶于CH₃OH/H₂O(1:4，V/V)中，使DPBF在411 nm处的吸光度约为1.0；标准物、配合物的吸光度为0.2~0.3(Ru-2与BSA的混合溶液的浓度比为1:1，先将等浓度混合的Ru-2/BSA水溶液在室温孵育15 min，再加入DPBF配制为上述溶液)。待溶液配制好后，依次使用波长为450 nm的光源照射3 s后测试，照射时间为0~24 s，测定吸收波长范围为200~600 nm。

  1.11   配合物Ru-2的细胞成像

  取对数生长期的A549细胞，以每孔5×10⁴个接种于12孔细胞培养板中，在体积分数为5%的CO₂的气氛和310 K条件下孵育24 h，将配合物Ru-2用培养基稀释成浓度为25 μmol·L^-1的溶液(DMSO和DMEM的体积分数分别为1%和99%)，在相同条件下与A549细胞共孵育9 h，随后移除培养基，用PBS洗涤细胞3次，使用激光共聚焦显微镜观察，激发波长设置为488 nm，发射通道为570~620 nm。

  2.   结果与讨论

  2.1   配体及配合物的合成及结构表征

  将具有多种生物活性的天然产物反式阿魏酸进行化学改造，并结合金属中心钌，获得了2种全新钌配合物。如图 1所示，配体(L)是由反式阿魏酸与(4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl) methanamine通过酰胺化反应制得；配合物Ru-1是由芳基钌二聚体[Ru(η⁶-p-cym)Cl₂]₂与配体L在甲醇中制备得到，配合物Ru-2是由环金属钌前驱体cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]与配体L在乙醇/水(2:1，V/V)中制备得到。2种配合物均通过柱层析提纯，并利用¹H NMR、ESI-MS对化合物进行了表征。结果显示2个配合物均为单核钌配合物，含有一个化学修饰的反式阿魏酸配体。

  图 1

  

  图 1.  目标化合物的合成路线

  Figure 1.  Synthetic route of the target complexes

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  2.2   配合物的脂水分配系数

  由Lipinski规则可知，化合物的亲脂性与亲水性是很重要的性能指标^[33]。较低的亲脂性会使化合物穿过细胞磷脂双分子层能力的下降，但较高的亲脂性又使得化合物水溶性变差，进而导致在实际应用时的困难^[34]。因此我们测定了2种配合物的脂水分配系数，以配合物在有机相与水相中的吸光度(315与287 nm处)的比值取对数即可得到相应的脂水分配系数lgP_O/W，Ru-1和Ru-2的分别为0.378 9和-1.036 3，说明2种配合物均具有很高的亲水性，这是由于其结构中羟基(-OH)较强的亲水性造成的；同时，Ru-2的lgP_O/W甚至为负值，说明在配体相同的情况下，多联吡啶的结构使其具有更强的亲水性。与文献报道的其他芳基金属配合物[(η⁶-p-cym)Ru(N^N)Cl]PF₆(lgP_O/W=1.80)^[35]和多联吡啶钌配合物[Ru(bpy)(phpy)dppz]⁺(lgP_O/W=1.00)^[21]相比，Ru-1与Ru-2都具有更好的亲水性。

  2.3   配合物Ru-2的荧光光谱

  三联吡啶钌配合物因其较大的共轭平面，表现出良好的荧光性质^[36]，因此我们进一步研究了Ru-2的荧光性质。Ru-2的激发与发射光谱如图 2A所示，其最大激发波长为454 nm，最大发射波长为631nm，均属于可见光，其近红外的最大发射波长比已报道的用于成像治疗的环金属钌配合物[Ru(phen)₂dppz](ClO₄)₂^[37]大(λ_em=618nm)。Ru-2具有比已知的环金属钌配合物[Ru(bpy)₂L](PF₆)₂^[38] (166 nm)更大的Stokes位移(177 nm)，这表明Ru-2具有较好的光学特性，可以有效避免光学测试时自发荧光的干扰。

  图 2

  

  图 2.  (A) Ru-2的激发与发射光谱; (B) Ru-2在不同pH值条件下的荧光强度变化; (C)根据Henderson-Hasselbach方程将631 nm处荧光强度对pH值进行拟合所得曲线图; (D) Ru-2在不同金属离子条件下于631 nm处的相对荧光强度

  Figure 2.  (A) Fluorescence spectra of Ru-2; (B) Emission spectra of Ru-2 under different pH values; (C) Curve obtained by fitting the fluorescence intensity at 631 nm to pH value according to Henderson-Hasselbach equation; (D) Relative fluorescence intensity of Ru-2 at 631 nm with different metal ions

  c_Ru-2=10 μmol·L^-1; V_DMSO:V_H2O=1:99; λ_ex=454 nm; Inset: fitting curve of fluorescence intensity (631 nm) vs pH (8~10)

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  此外，酚羟基(-OH)是一种pH敏感基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱电子给体，但是碱性条件下，去质子化的O^-会改变分子内的电子转移^[39]，导致Ru-2的荧光光谱发生改变。因此，我们进一步对Ru-2在不同pH值(pH=3.00~11.99)条件下的荧光强度进行了测定。如图 2B所示，Ru-2的荧光发射波长始终未见移动，但Ru-2在pH=3.00~8.56之间的荧光强度发生了少许减弱，荧光强度下降比率为11.7%，说明Ru-2在酸性至弱碱性环境中有相对稳定且较强的荧光；随着pH值增大至10.01时，其荧光强度由2.56×10⁵急剧下降至8.49×10⁴，比率高达66.8%，根据插图中其最大发射强度与pH的拟合直线图可发现较好的线性关系，表明Ru-2可以有效地对该范围内的pH进行快速的响应；当pH值增大至11.99时，Ru-2的荧光强度在强碱性环境中降低至5.60×10⁴后再次趋于稳定。造成Ru-2荧光强度发生上述变化的原因是溶液的碱性提高，羟基的去质子化作用增强从而发生了光致电子转移效应(PET)。将Ru-2在631 nm处的荧光强度对pH作图，得到其荧光pH滴定曲线(图 2C)。根据Henderson-Hasselbach方程对该滴定曲线进行拟合，可得Ru-2的pK_a约为9.41，即该配合物在酸性至弱碱性条件下可以保持荧光的相对稳定，在稍高碱性环境下实现快速pH响应。

  配合物的pH响应能力可能会被其他离子所干扰。溶液中存在的其他离子可能会与质子发生竞争，进而影响配合物的荧光响应，其中高浓度的K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺及一些过渡金属离子影响更为明显^[40]。我们研究了配合物Ru-2在不同阳离子存在条件下的荧光强度(图 2D)。结果发现，当过渡金属离子(Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Zn²⁺)及碱金属与碱土金属(K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺)浓度为配合物浓度的1 000倍时(10 mmol·L^-1)时，Ru-2的荧光强度均无明显变化(荧光强度变化率在0.13%~5.61%)，表明这些金属离子不影响Ru-2的荧光发射。上述结果表明Ru-2的荧光性质不受其他金属离子的干扰，只专一地对pH进行响应，具有较好稳定性，使其具有在复杂环境中应用的可能。

  2.4   配合物的紫外-可见光谱及水解

  配合物的紫外吸收光谱在PBS(5 mmol·L^-1，pH=7.4，含10 mmol·L^-1 NaCl)中测定。如图 3A所示，Ru-1的紫外光谱特征吸收峰在300和315 nm处，且在275 nm处出现肩峰。300 nm的特征峰是由于电子从Cl的π轨道跃迁到配体的π*轨道导致，即配体至配体电荷发生跃迁(LLCT)。Ru-2的紫外光谱特征吸收峰在287和455 nm处，且在325 nm处出现肩峰。455 nm处的吸收峰归因于金属中心Ru原子上4d轨道的电子跃迁至配体的π*轨道导致，即金属到配体的电荷跃迁(MLCT)^{[38, 41]}。

  图 3

  

  图 3.  图 3 (A)配合物Ru-1和Ru-2在PBS中的紫外-可见光谱; (B) Ru-1在水溶液中的紫外-可见光谱随时间变化图, 插图为配合物在281 nm处吸光度对时间的拟合曲线; 配合物Ru-1 (C)与Ru-2 (D)在PBS中滴加CT-DNA前后的紫外-可见光谱变化图, 插图为c_DNA/(ε_a-ε_f)对浓度的拟合曲线

  Figure 3.  (A)UV-Vis absorbance spectra of complexes Ru-1 and Ru-2 in PBS; (B)Time-dependent UV absorption spectra of Ru-1 measured in H₂O, inset:curve obtained by fitting the absorbance at 281 nm to time; UV spectra of Ru-1 (C) or Ru-2 (D) in the absence and presence of CT-DNA in PBS, inset: fitting curve of c_DNA/(ε_a-ε_f) vs concentration

  (A) c_complex=35 μmol·L^-1; (B) c_Ru-1=45 μmol·L^-1; (C, D) c_complex=25 μmol·L^-1, c_CT-DNA=0~35 μmol·L^-1, c_complex/c_CT-DNA=0~1.4; V_DMSO:V_H2O=5:95

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  配合物的水解会影响其药理性质，包括细胞摄取、与DNA结合、代谢以及毒性等^[42]。芳基金属配合物与生物分子反应的潜在重要激活机制是水解，而水解是通过协调的配体交换机制发生的^[43]，因此研究配合物的水解可以通过紫外-可见光谱协助探究配合物与细胞内生物分子的结合。Ru-1在5% (体积分数)的DMSO水溶液中的水解如图 3B所示，在0~24 h之内，其最大吸收峰316 nm处的吸光度增加很少(从1.023增加至1.036)；但在259 nm处发生了增加(从0.609增加至0.626)；在281 nm处发生了较大减弱(从0.716减少至0.673)，说明Ru-1在水溶液发生了部分内界配位离子Cl^-的离去。按照281 nm处的吸光度与时间的拟合曲线，结合一级反应动力学方程，计算出配合物Ru-1的水解速率常数和半衰期(t_1/2)分别为0.63 h^-1和1.10 h，与已报道的β - carboline生物碱芳基钌配合物[(η⁶- benzene)Ru(L3) Cl] (PF₆)相比^[44]，后者具有极快的水解速率(t_1/2=5.1 min)，表明配合物Ru-1在298 K的水溶液环境中具有较好的稳定性，水解速率较慢。同时，无内界配位阴离子的Ru-2在相同条件下其紫外-可见吸收光谱如图S10所示，Ru-2在0~24 h之内未发生明显的变化，并未出现水解过程中常见的等电子点，只在该体系中存在丰度的相对升高。说明Ru-2在水溶液中具有更高的稳定性，不会发生芳基金属配合物类似的水解行为。

  2.5   配合物与CT-DNA作用

  紫外-可见光谱是研究配合物和DNA相互作用中常见且便捷的测试方法，其原理在于若配合物插入DNA的碱基对，其π*轨道可以与DNA的π轨道耦合，从而减少π-π*跃迁能量；另一方面，耦合的p*轨道部分地被电子填充，降低了电子跃迁几率，这些相互作用会导致明显的减色效应或红移^[45]，即紫外光谱吸收峰会出现减弱的现象，其强弱可以表示配合物与DNA相互作用的强度。如图 3C和3D所示，通过紫外-可见光谱可以观察到Ru-1在310~325 nm处有较强吸收，最强吸收峰出现315 nm。Ru-2在287、321、422及457 nm处均有较强吸收，最强吸收峰出现287 nm。2个配合物的紫外吸收强度在其浓度为35 μmol·L^-1时出现了12.2%和8.3%的减色效应，表明二者都与CT-DNA出现了一定程度的相互作用。通过Benesi-Hildebrand方程可以计算配合物与CT-DNA的结合常数K_b：

  c_DNA/(ε_a-ε_f)=c_DNA/(ε_b-ε_f)+1/[K_b(ε_b-ε_f)]^[46]

  其中c_DNA 是DNA 的浓度，表观吸收系数ε_a 数值上对应于A/(bc_complex)，ε_b 和ε_f 分别表示结合态和游离态的配合物的消光系数。利用上述公式计算得配合物Ru-1和Ru-2与CT - DNA的结合常数K_b分别为：1.210×10⁴和1.233×10³ L·mol^-1，说明Ru-1与DNA的结合能力较Ru-2强，造成这种现象的原因可能是Ru-1含有可离去的Cl^-，可以在水中进行缓慢水解，其结合常数与文献报道在同一数量级([(η⁶-p-cym)Ru (L1)Cl]PF₆：7.8×10³ L·mol^-1；[(η⁶-p-cym)Ru(L2)Cl]PF₆：1.86×10⁴ L·mol^-1)^[47-48]。

  配合物对DNA粘度影响中样品溶液的相对粘度结合以下公式计算：

  η=(t-t₀)/t₀^[49]

  其中 t₀ 为缓冲体系流经毛细管所需时间，t为样品 DNA溶液流经毛细管所需时间，η₀为无配合物时DNA的相对粘度。以(η/η₀)^1/3对配合物与DNA的比例r 作图，可得图 4。溴化乙锭(EB)作为一种DNA 插入剂，其与DNA发生相互作用时，会使其双螺旋链增长，显著增加DNA溶液的粘度^[50]。实验结果显示，DNA溶液体系的(η/η₀)^1/3随配合物的加入而逐渐增大(Ru-1：1.092 8；Ru-2：1.053 6)，即DNA粘度出现不同程度的增加，2种配合物插入DNA的能力为Ru-1强于Ru-2，与上述紫外结果相符。这也证明2种配合物与DNA都以嵌入方式作用。

  图 4

  

  图 4.  在(25±0.1) ℃下DNA在PBS体系中相对粘度随EB、配合物Ru-1和Ru-2加入的变化

  Figure 4.  Effect of addition of EB, Ru-1 and Ru-2 on relative viscosity of CT-DNA in PBS at (25±0.1) ℃

  c_DNA=50 μmol·L^-1; c_compound=0~5 μmol·L^-1; r=c_compound/c_DNA=0~0.1

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  2.6   配合物与BSA的相互作用

  研究表明, 分子-蛋白质相互作用可能对于分子的运输、释放、生物分布或者药物的毒性来说至关重要^[16], 而血清白蛋白可作为金属离子和配合物的运输物质, 其与配合物之间相互作用会影响配合物的生物反应活性。研究配合物与蛋白的相互作用有助于我们理解配合物在生物体内的作用机理。血清白蛋白(SA)是血浆中的主要蛋白质之一, 牛血.清白蛋白(BSA)的结构类似于人血清白蛋白(HSA), 其中的色氨酸(Trp)与络氨酸(Tyr)使其具有荧光^[51], 蛋白质变性或与底物结合都使其发生荧光淬灭。我们以BSA为模型, 研究了2种配合物与白蛋白的结合作用。静态淬灭机制通常是由猝灭剂(配合物)和荧光团之间的基态结合物形成引起的，因此会引起荧光团发射光谱的变化; 而在动态淬灭机制中，猝灭剂和荧光团在激发态下相互接触, 因此在BSA的发射光谱中没有明显的强度变化^[52]。当配合物与BSA的内源性荧光基(Trp-212, Trp-134)结合时，会使处于疏水腔的Trp-212暴露于亲水环境中, 造成荧光淬灭。如图 5所示, 随着Ru-1的加人, BSA在335nm处的荧光明显降低(下降比率为31.6%)，并且荧光降低程度与配合物浓度在0~20 μmol·L^-1范围内呈现较佳的线性关系，表明Ru-1与BSA可以发生明显的结合作用。Ru-2的滴加使得BSA存在与Ru-1结合类似的变化趋势，在330 nm处荧光强度下降了51.8%。证明2种配合物都可与BSA结合，并且2种情况下吸收峰都发生了一定的红移(Δλ分别为7和11 nm)，这可归因于极性溶剂H₂O的影响^[35]。

  通过Stern-Volmer方程可对配合物的作用类型进行判断：

  I₀/I=1+K_sv=1+K_qτ₀^[52]

  式中：I与I₀ 分别表示淬灭剂(配合物)存在与不存在时溶液的荧光强度；K_sv 为Stern-Volmer 淬灭常数；K_q为双分子荧光淬灭常数；τ₀ 为不含淬灭剂时物质的荧光寿命。以 I₀/I 对 c_complex 作图，可求得配合物Ru-1、Ru-2与BSA的Stern-Volmer淬灭常数K_sv(表 1)分别为2.33×10⁴、5.40×10⁴ L·mol^-1；双分子荧光淬灭常数 K_q 分别为 2.33×10¹²、5.40×10¹² L·mol^-1·s^-1。碰撞过程导致动态猝灭，而蛋白与猝灭剂之间形成复合物会导致静态猝灭，上述淬灭常数均大于猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数2.00× 10¹² L·mol^-1·s^{-1 [53]}，所以其淬灭方式均为静态淬灭。在静态淬灭中，假设血清白蛋白上的独立结合位点数为n，根据Scatchard 方程即可计算配合物与血清白蛋白的结合常数K_b 与结合位点数n：

  表 1

  

  表 1  配合物与BSA的Stern-Volmer荧光猝灭数据

  Table 1.  Stern-Volmer fluorescence quenching data of BSA with complexes

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  Complex	Ksv / (L·mol-1)	Kq / (L·mol-1·s-1)	Ka	n
  Ru-1	2.33×104	2.33×1012	1.94×104	1.08
  Ru-2	5.40×104	5.40×1012	2.45×104	1.25

  lg(I₀/I-1)=lgK_a+nlg c_complex^[35]

  将lg(I₀/I-1)对lg c_complex作图可得图 5D和5F，根据截距和斜率分别可以求得配合物与BSA的结合常数K_a 和结合位点数n(表 1)，配合物Ru-1、Ru-2 的结合常数K_a 分别为1.94×10⁴、2.45×10⁴，结合位点数n分别为1.08、1.25。2种配合物与BSA的结合常数与文献报道在同一数量级(10⁴)^[54]，属于中等强度，也表明配合物造成BSA荧光静态淬灭的原因是配合物与BSA的结合造成其发光基团Trp-212疏水环境的改变，进而导致BSA二级结构的改变，使其荧光猝灭。

  图 5

  

  图 5.  在PBS中向BSA滴加Ru-1(A)或Ru-2(B)前后的荧光变化,插图为BSA荧光强度变化对配合物浓度的拟合曲线;(C、E) Ru-1、Ru-2与BSA结合的I₀/I vs c_complex关系图,对应K_sv和K_q; (D、F) Ru-1、Ru-2的lg(I₀/I-1)vs lg c_comple关系图,对应结合常数及结合位点数

  Figure 5.  Fluorescence spectra of BSA in the absence and presence of Ru-1 (A) or Ru-2 (B) in PBS, inset: fitting curve of BSA fluorescence intensity change to complex concentration; (C, E) Stern-Volmer plots of I₀/I against the concentration of complexes for K_sv and K_q; (D, F)Plots of lg(I₀/I-1) vs lg c_complx for the interaction data with BSA

  c_BSA=3 μmol·L^-1,c_comple =0~20 μmol·L^-1 , c_BSA/c_complex=0~6.7

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  2.7   配合物的单线态氧产率

  将配合物与DPBF的CH₃OH/H₂O(1:4，V/V)溶液>用450 nm照射以研究Ru-2的单线态氧生成能力。标准物[Ru(bpy)₃]²⁺在甲醇中的量子产率为0.81^[55]。DPBF紫外吸收强度变化如图 6所示，在添加Ru-2并照射后，DPBF在411 nm处的吸光度迅速由1.11下降至0.36，说明在此过程中，Ru-2在溶液中产生了活性氧类似物种，使其捕捉剂DPBF被大量消耗。通过以下公式即可计算Ru-2的单线态氧产率：

  图 6

  

  图 6.  DPBF在CH₃OH/H₂O(1:4, V/V)中与Ru-2 (A)、Ru-2+BSA(1:1, c/c) (B)和标准物[Ru(bpy)₃]²⁺ (C)共混后在450 nm光照条件下的紫外-可见光谱变化; (D)标准物[Ru(bpy)₃]²⁺、Ru-2和Ru-2+BSA(1:1, c/c)分别与DPBF共混后在411 nm下的随光照时间延长的紫外吸收变化强度统计

  Figure 6.  UV-Vis spectra of the mixture of Ru-2 (A), Ru-2+BSA (1:1, c/c) (B) and [Ru(bpy)₃]²⁺ (C) and DPBF upon irradiation in CH₃OH/H₂O (1:4, V/V); (D) ¹O₂ production via changes in the absorbance by DPBF at 411 nm vs irradiation time in the presence of Ru-2, Ru-2+BSA (1:1, c/c) and [Ru(bpy)₃]²⁺

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  Φ=Φ_s(k/k_s)(F_s/F)^[56]

  式中：下标s代表标准物[Ru(bpy)₃]²⁺；k为(A₀-A_t)/A₀对照射时间作图所得直线的斜率；A₀ 为DPBF 未照射时在411 nm处的吸光度，A_t为DPBF在依次照射后于411 nm处的吸光度；F为校正系数，数值上为1-10^-OD(OD是溶液在照射波长下的吸光度)。如图 6D所示，将1-A_t/A₀对照射时间t作图，通过标准物与Ru-2相应的直线斜率即可计算出甲醇中的单线态氧产率Φ 为0.70，这与文献报道的环金属钌光敏配合物[Ru(bpy)(dppn)(CH₃CN)₂](PF₆)₂的水平相当(Φ = 0.72)^[57]，表明Ru-2在体外产生¹O₂的能力较强，可能成为新型高效的金属光敏剂。且从图 6B可知，Ru-2与BSA按浓度比为1:1混合孵育后依然使DPBF的吸光度大大降低，且程度与不结合时相近(由1.10降至0.40)，即Ru-2的单线态氧产率未出现明显下降(Φ=0.68)，证明Ru-2具有稳定的单线态氧类物质生成能力。同时，我们也测定了芳基金属配合物Ru-1的单线态氧生成情况(图S10)，相同条件下芳基金属配合物Ru-1与DPBF共混后经过照射，DPBF在411 nm处的吸光度仅有少许下降(从0.98降至0.88)，与Ru-2相比几乎可以忽略，这表明Ru-1在相同条件下无法具有环金属配合物产生单线态氧的能力。这是由于Ru-1的“琴凳型”结构使其不具有环金属配合物的平面共轭结构，不能吸收光而使电子从激发态产生跃迁从而发生系间窜越，不能发生能量转移，因此导致配合物Ru-1无法生成单线态氧。

  2.8   配合物Ru-2的细胞成像

  上述结果显示，Ru-2具有优秀的pH响应且不受其他离子干扰, 在此我们希望将其用于细胞成像以实现配合物的细胞内造影, 我们通过激光共聚焦成像对其进行了细胞内荧光观察。如图 7所示，将Ru-2(25 μmol.L^-1)与人非小细胞肺癌(A549)细胞共孵育9h后, 细胞内几乎未观察到配合物的荧光, 表明Ru-2在高浓度、长时间孵育下依然无法被细胞大量摄取, 这可能是由于Ru-2良好的亲水性(lgP_o/w= -1.036 3)导致其难以穿过细胞的磷脂双分子层，从而造成极低的配合物摄取量, 也影响了Ru-2在细胞内的可视化。

  图 7

  

  图 7.  配合物Ru-2与A549细胞于37 ℃孵育9 h后的共聚焦显微镜图

  Figure 7.  Confocal microscopy images of A549 cells treated by Ru-2 for 9 h at 37 ℃

  c_Ru-2=25 μmol·L^-1, λ_ex=488 nm

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  3.   结论

  我们在修饰反式阿魏酸的基础上合成、表征了2种新型钌配合物并研究了其荧光性质及其与DNA/蛋白的相互作用。配合物均具有很好的亲水性。环金属配合物Ru-2发射波长达到近红外的631 nm，不但具有良好的荧光性能，可实现对pH值在8~10之间的实时响应，还具有较高的单线态氧量子产率(Φ=0.70)，有望成为一类高效的光敏剂。2种配合物都以中等强度与CT-DNA发生嵌入作用，但Ru-1作用更强；配合物均与BSA以中等强度结合但仅有一个结合位点，并使其荧光发生静态淬灭。但配合物由于较强的亲水性，无法进入细胞，使Ru-2在细胞内荧光成像无法实现。上述结果有助于理解配合物亲水性与细胞摄取的关系，对开发能顺利进入细胞并保持荧光性质的配合物有一定的指导意义。

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  图 1  目标化合物的合成路线

  Figure 1  Synthetic route of the target complexes

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  图 2  (A) Ru-2的激发与发射光谱; (B) Ru-2在不同pH值条件下的荧光强度变化; (C)根据Henderson-Hasselbach方程将631 nm处荧光强度对pH值进行拟合所得曲线图; (D) Ru-2在不同金属离子条件下于631 nm处的相对荧光强度

  Figure 2  (A) Fluorescence spectra of Ru-2; (B) Emission spectra of Ru-2 under different pH values; (C) Curve obtained by fitting the fluorescence intensity at 631 nm to pH value according to Henderson-Hasselbach equation; (D) Relative fluorescence intensity of Ru-2 at 631 nm with different metal ions

  c_Ru-2=10 μmol·L^-1; V_DMSO:V_H2O=1:99; λ_ex=454 nm; Inset: fitting curve of fluorescence intensity (631 nm) vs pH (8~10)

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  图 3  图 3 (A)配合物Ru-1和Ru-2在PBS中的紫外-可见光谱; (B) Ru-1在水溶液中的紫外-可见光谱随时间变化图, 插图为配合物在281 nm处吸光度对时间的拟合曲线; 配合物Ru-1 (C)与Ru-2 (D)在PBS中滴加CT-DNA前后的紫外-可见光谱变化图, 插图为c_DNA/(ε_a-ε_f)对浓度的拟合曲线

  Figure 3  (A)UV-Vis absorbance spectra of complexes Ru-1 and Ru-2 in PBS; (B)Time-dependent UV absorption spectra of Ru-1 measured in H₂O, inset:curve obtained by fitting the absorbance at 281 nm to time; UV spectra of Ru-1 (C) or Ru-2 (D) in the absence and presence of CT-DNA in PBS, inset: fitting curve of c_DNA/(ε_a-ε_f) vs concentration

  (A) c_complex=35 μmol·L^-1; (B) c_Ru-1=45 μmol·L^-1; (C, D) c_complex=25 μmol·L^-1, c_CT-DNA=0~35 μmol·L^-1, c_complex/c_CT-DNA=0~1.4; V_DMSO:V_H2O=5:95

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  图 4  在(25±0.1) ℃下DNA在PBS体系中相对粘度随EB、配合物Ru-1和Ru-2加入的变化

  Figure 4  Effect of addition of EB, Ru-1 and Ru-2 on relative viscosity of CT-DNA in PBS at (25±0.1) ℃

  c_DNA=50 μmol·L^-1; c_compound=0~5 μmol·L^-1; r=c_compound/c_DNA=0~0.1

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  图 5  在PBS中向BSA滴加Ru-1(A)或Ru-2(B)前后的荧光变化,插图为BSA荧光强度变化对配合物浓度的拟合曲线;(C、E) Ru-1、Ru-2与BSA结合的I₀/I vs c_complex关系图,对应K_sv和K_q; (D、F) Ru-1、Ru-2的lg(I₀/I-1)vs lg c_comple关系图,对应结合常数及结合位点数

  Figure 5  Fluorescence spectra of BSA in the absence and presence of Ru-1 (A) or Ru-2 (B) in PBS, inset: fitting curve of BSA fluorescence intensity change to complex concentration; (C, E) Stern-Volmer plots of I₀/I against the concentration of complexes for K_sv and K_q; (D, F)Plots of lg(I₀/I-1) vs lg c_complx for the interaction data with BSA

  c_BSA=3 μmol·L^-1,c_comple =0~20 μmol·L^-1 , c_BSA/c_complex=0~6.7

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  图 6  DPBF在CH₃OH/H₂O(1:4, V/V)中与Ru-2 (A)、Ru-2+BSA(1:1, c/c) (B)和标准物[Ru(bpy)₃]²⁺ (C)共混后在450 nm光照条件下的紫外-可见光谱变化; (D)标准物[Ru(bpy)₃]²⁺、Ru-2和Ru-2+BSA(1:1, c/c)分别与DPBF共混后在411 nm下的随光照时间延长的紫外吸收变化强度统计

  Figure 6  UV-Vis spectra of the mixture of Ru-2 (A), Ru-2+BSA (1:1, c/c) (B) and [Ru(bpy)₃]²⁺ (C) and DPBF upon irradiation in CH₃OH/H₂O (1:4, V/V); (D) ¹O₂ production via changes in the absorbance by DPBF at 411 nm vs irradiation time in the presence of Ru-2, Ru-2+BSA (1:1, c/c) and [Ru(bpy)₃]²⁺

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  图 7  配合物Ru-2与A549细胞于37 ℃孵育9 h后的共聚焦显微镜图

  Figure 7  Confocal microscopy images of A549 cells treated by Ru-2 for 9 h at 37 ℃

  c_Ru-2=25 μmol·L^-1, λ_ex=488 nm

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  表 1  配合物与BSA的Stern-Volmer荧光猝灭数据

  Table 1.  Stern-Volmer fluorescence quenching data of BSA with complexes

  Complex	Ksv / (L·mol-1)	Kq / (L·mol-1·s-1)	Ka	n
  Ru-1	2.33×104	2.33×1012	1.94×104	1.08
  Ru-2	5.40×104	5.40×1012	2.45×104	1.25

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