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• 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能氧化多种酚类和非酚类底物。漆酶从底物吸收电子的同时将作为第二底物的氧分子还原成水^{[1, 2, 3]}，其产物具有环境友好性，是一种绿色环保、经济安全的酶催化剂，具有广阔的应用潜力^{[4, 5, 6, 7]}。但漆酶要求反应条件温和，容易失活。引起酶失活的因素有很多，比如温度、pH等，其中热失活是一种重要的酶失活形式。漆酶失活动力学的研究对于了解酶的性质、充分发挥酶的催化性能至关重要。过去的研究中，对于酶的热失活已经提出了许多失活机理。常见的热失活动力学模型有一步失活模型、平行失活模型和连串失活模型^[8]。一步失活模型又称为一级失活模型，其失活动力学方程为，Residual activity(剩余酶活)(%)=exp(-k_dt)；平行失活模型认为全部酶分子可划分为若干个热稳定性不同的组分，每个组分又均符合一步失活模型，其方程式为，Residual activity(%)=[αexp(-k_d1t) + (1-α)exp(-k_d2t)]；连串失活模型则认为酶的完全失活需要经过多个中间过渡状态，其失活动力学方程为，Residual activity(%)=[αexp(-k_d1t)+βexp(-k_d2t)]^[9~11]。对于酶的热失活已经提出了许多失活机理，可能是因为化学键的破坏或是活性中心离子被置换；除此之外，酶所处的环境也对酶的活性影响很大。本文就失活模型和失活机理两方面对三种体系下的漆酶进行了研究，以便更好地了解漆酶的酶学性质，为漆酶降解各种污染物提供理论支撑，为漆酶的实际应用提供理论指导。

  1.   材料与方法

  1.1   仪器与试剂

  紫外分光光度计；pH仪。100%纯度漆酶(0.89U/mg)购自Sigma公司；Britton-Robinson缓冲溶液、2, 2′ -联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、2, 4-二氯酚、吲哚、乙醇、异辛烷等均为市售分析纯级试剂。

  1.2   实验方法

  1.2.1   水溶液体系

  纯漆酶酶活测定：将1mL 1U/mL的漆酶溶液加入到1.5mL Britton-Robinson缓冲液中，测量时加入0.5mL ABTS溶液，分别于25、35、45、55、65、75 ℃下测定其酶活，找出最佳反应温度，在不同时间(0.5、1、2、4、6、8、10、12 h)后采用紫外分光光度计测定420nm处的吸光度。

  1.2.2   有毒有机物体系

  反应总体积为3mL：1mL 2, 4-二氯酚或吲哚、1mL Britton-Robinson缓冲液、0.5mL漆酶、0.5mL ABTS(测量时加入)混合放入烧杯，常温避光反应，重复1.2.1节实验流程，采用紫外分光光度计测定其吸光度。

  1.2.3   极性非极性体系

  反应总体积为3mL：1mL乙醇或异辛烷、1mL Britton-Robinson缓冲液、0.5mL漆酶、0.5mL ABTS(测量时加入)混合放入烧杯，常温避光反应，重复1.2.1节实验流程，采用紫外分光光度计测定其吸光度。

  2.   结果与讨论

  2.1   纯水溶液体系

  如图 1(a)所示，漆酶在不同温度下的酶活变化较大，这是因为升高温度会诱导漆酶分子去折叠，改变肽链在溶液中特定的空间排布，进而影响其活性^[12]。随着反应温度的升高，漆酶酶活先下降后升高，在65℃达到最大值，75℃又急剧下降，所以时间实验在65℃下进行。由图 1(b)可得，在65℃下随着反应时间的延长，漆酶活性呈明显下降趋势，一方面是由于对漆酶的持续加热，导致漆酶活性损失越来越快，另一方面是由于体系的溶解氧随持续加热而随之减少，不利于酶的反应^[13]。对不同反应时间下的剩余酶活的对数与热处理时间作图，并进行线性拟合，如图 1(c)所示，所得线性方程为lnA=-0.1353t-2.2522，R²为0.9278，可判断得出漆酶的失活符合一级失活动力学模型。

  图 1

  

  图 1.  (a) 漆酶在纯水溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶失活数据的线性拟合

  Figure 1.  (a)Enzyme activity of laccase in pure aqueous solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 65℃ for different reaction times; (c) Linear fit of laccase inactivation data

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  2.2   有毒有机物体系中漆酶的失活及其机理分析

  有毒有机物在环境中分布广泛，对人体健康产生极大危害，研究者一直在探索清洁有效的去除方法。生物酶法去除有机污染物是近年来研究的热点，本实验试探索有毒有机物对漆酶的影响。其中2, 4-二氯酚广泛应用于化工、农药、造纸等工业，具有很高毒性，而且酚类化合物是典型的漆酶底物^[14]。吲哚是典型的氮杂环类化合物，其水溶性和扩散性好，是废水中常见的污染物，且吲哚毒性高，对环境危害大，生物去除性差^{[15, 16]}，所以实验选择的另一种有机物是吲哚。

  2.2.1   2, 4-二氯酚溶液

  如图 2(a)所示，漆酶在28~75 ℃温度范围内酶活变化为0.0022~0.0578，当升高温度时，漆酶活性下降，其中，漆酶在28℃时酶活性最高，所以选择在此温度下进行时间实验。由图 2(b)可知，在28℃下随着反应时间的延长，漆酶酶活逐渐减小，酶活性呈明显下降趋势，将各个时间点的失活数据按照一步失活模型进行线性拟合，得到漆酶的失活方程为lnA=-0.0585t-2.8137，R²为0.9611，表明漆酶的失活符合一级反应动力学模型。

  图 2

  

  图 2.  (a) 漆酶在2, 4-二氯酚溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合

  Figure 2.  (a)Enzyme activity of laccase in 2, 4-dichlorophenol solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; (c) Linear fit of laccase inactivation data

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  2.2.2   吲哚溶液

  如图 3(a)所示，漆酶在吲哚溶液中温度越高，酶活性越小，在28℃有最大酶活，所以时间实验在此温度下进行。如图 3(b)所示，随着反应时间的延长，漆酶酶活越来越小，在0~12 h漆酶活性呈明显下降趋势。将漆酶在12h内的酶活数据按照一步失活动力学模型进行线性拟合，得到lnA=-0.0449t-2.8253，R²为0.9210，据此判断可知漆酶的失活符合一级失活动力学模型。

  图 3

  

  图 3.  (a) 漆酶在吲哚溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合图

  Figure 3.  (a) Enzyme activity of laccase in indole solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; (c) Linear fit of laccase inactivation data

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  2.2.3   有毒有机物体系对漆酶酶活的影响机理分析

  在2, 4-二氯酚体系中，由图 2(b)可知，随着反应时间的延长，漆酶在逐渐失活，漆酶酶活呈明显下降趋势。漆酶不断降解2, 4-二氯酚，其反应过程^[17]如图式 1所示。

  图式 1

  

  图式 1.  2, 4-二氯酚降解流程示意图

  Scheme 1.  Schematic diagram of 2, 4-dichlorophenol degradation process

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  在此过程中漆酶持续降解2, 4-二氯酚，漆酶酶活越来越小。反应过程中，漆酶在2, 4-二氯酚溶液中的反应速率常数为0.0585s^-1，半衰期为11.8466h，与纯漆酶溶液比较，其反应速率减小，半衰期增大，说明漆酶在2, 4-二氯酚溶液中反应减慢，失活也变慢了。这可能是因为溶液中存在着大量的漆酶催化底物2, 4-二氯酚，其能够与漆酶紧密结合进而可以阻止漆酶肽链的伸展^[18]。

  由图 3(c)可得，漆酶在吲哚溶液中的反应速率为0.0449s^-1，比水溶液和2, 4-二氯酚溶液中的反应速率低，说明漆酶在吲哚溶液中反应变慢；其半衰期为15.4513h，大于水溶液中的半衰期，说明漆酶在吲哚溶液中比较稳定；但漆酶在溶液中的最大活性只有0.06，说明漆酶在吲哚中活性受到抑制。在反应体系中，漆酶与吲哚相互作用，其作用过程分两步，第一步形成氧化吲哚和靛红，第二步为环的断裂，直至最后矿化^[19]，期间两物质被不断消耗，漆酶活性越来越小。

  2.3   极性、非极性溶液中漆酶的失活动力学及其机理分析

  漆酶常被用来降解水中酚类化合物^[120]，但酚类物质通常难溶于水，因此在实际实验过程中，往往先采用微量乙醇溶解，然后再溶于水，因此探究乙醇对漆酶的影响很有必要。此外，大量文献探索了水溶的物质对漆酶的影响，本实验试探究难水溶物质对漆酶活性的影响，因此选择非极性体系。

  2.3.1   乙醇溶液

  乙醇溶液中，漆酶在不同温度下的酶活值范围0.001~0.06，漆酶在各个温度下的酶活都不高，在28℃时酶活最大，所以时间实验在此温度下进行。由图 4(b)可知，在28℃下随着反应时间的延长，漆酶逐渐失活，酶活值呈明显下降趋势。对0~12h的漆酶酶活数据按照一步失活模型进行线性模拟，得到方程lnA=-0.0458t-2.9774，R²为0.9452，判断得出漆酶的失活符合一级失活动力学模型。

  图 4

  

  图 4.  (a) 漆酶在乙醇溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合图

  Figure 4.  (a) Enzyme activity of laccase in ethanol solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; (c)Linear fit of laccase inactivation data

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  2.3.2   异辛烷溶液

  漆酶在异辛烷溶液中不同温度下的酶活如图 5(a)所示，酶活变化范围为0.0004~0.0376，漆酶酶活整体较小，其活性受到抑制。各个温度下漆酶酶活值差异很大，75℃时漆酶酶活为0.0004，几乎完全失活，28℃时有最大酶活为0.0376，所以时间实验选择在28℃下进行。在28℃下，随着反应时间的延长，漆酶酶活越来越小，漆酶酶活呈明显下降趋势。将28℃下的漆酶失活数据按照一步失活模型进行线性拟合，失活方程为lnA=-0.05776t-3.0553，R²为0.9828，表明漆酶的失活符合一级反应动力学模型。

  图 5

  

  图 5.  (a) 漆酶在异辛烷溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合图

  Figure 5.  (a) Enzyme activity of laccase in isooctane solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; 00(c)Linear fit of laccase inactivation data

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  2.3.3   极性、非极性体系中漆酶失活的影响机理分析

  在极性体系，反应过程中底物能溶解于反应体系，与催化剂充分接触，不存在任何传质障碍，可以大大提高反应效率^[21]。但实验所测反应速率常数为0.0458s^-1，比水溶液的反应速率小，可能是因为外部环境为乙醇溶液，导致酶分子内部的作用力发生了很大变化^[22]，所以反应变缓；乙醇溶液中半衰期为15.1243h，比水溶液的长，说明漆酶在乙醇中比较稳定，不容易失活，其活性能够较好地被保存。

  漆酶在非极性体系的反应速率较小，但同时这种体系是由水-疏水有机溶剂形成的水-有机两相体系，有利于酶的稳定。在这种体系中，酶存在于水相，疏水物质存在于有机相中，酶促反应发生于水相，减少了酶与有机溶剂的接触，减少了对酶的伤害，有利于酶的稳定^[23]，所以漆酶在此体系下半衰期延长。但漆酶在异辛烷溶液中的酶活比水溶液和乙醇溶液的低，这可能是因为异辛烷溶液环境不利于漆酶的表达，抑制了漆酶活性。

  3.   结论

  研究了三种体系漆酶的热失活行为并求出了相应的动力学参数。在纯水溶液体系、有毒有机物体系以及极性、非极性体系中漆酶的失活均符合一级失活动力学模型。漆酶在有毒有机物体系、极性、非极性体系的反应速率常数比水溶液中的小、半衰期比水溶液中的长，说明漆酶在这两种体系中比较稳定，不易失活，原因却各有不同。有毒有机物体系是因为溶液中存在着大量的漆酶催化底物，其能够与漆酶紧密结合进而可以阻止漆酶肽链的伸展，从而影响了漆酶活性；极性非极性体系则是因为漆酶外部环境改变，导致酶分子内部的作用力发生了很大变化，从而影响了漆酶活性。

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  图 1  (a) 漆酶在纯水溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶失活数据的线性拟合

  Figure 1  (a)Enzyme activity of laccase in pure aqueous solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 65℃ for different reaction times; (c) Linear fit of laccase inactivation data

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  图 2  (a) 漆酶在2, 4-二氯酚溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合

  Figure 2  (a)Enzyme activity of laccase in 2, 4-dichlorophenol solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; (c) Linear fit of laccase inactivation data

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  图 3  (a) 漆酶在吲哚溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合图

  Figure 3  (a) Enzyme activity of laccase in indole solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; (c) Linear fit of laccase inactivation data

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  图式 1  2, 4-二氯酚降解流程示意图

  Scheme 1  Schematic diagram of 2, 4-dichlorophenol degradation process

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  图 4  (a) 漆酶在乙醇溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合图

  Figure 4  (a) Enzyme activity of laccase in ethanol solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; (c)Linear fit of laccase inactivation data

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  图 5  (a) 漆酶在异辛烷溶液中不同温度条件下的酶活；(b)漆酶在28℃下不同反应时间下的酶活；(c)漆酶的失活数据线性拟合图

  Figure 5  (a) Enzyme activity of laccase in isooctane solution at different temperature condition; (b) Enzyme activity of laccase at 28℃ for different reaction times; 00(c)Linear fit of laccase inactivation data

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