聚肽是由单一的天然氨基酸及其衍生物通过酰胺键链接而成的仿生于天然多肽或聚氨基酸的一类聚合物材料，具有良好的生物相容性[1]、可降解性[2, 3]、自组装行为[4, 5]和液晶现象[6]等。聚肽可以在一定条件下形成稳定的次级结构，如α-螺旋和β-折叠结构[7]。聚肽因其独特结构在生物应用高分子材料领域具有很大潜在应用前景，受到了广泛关注[8]。
L-苯丙氨酸是一种α-氨基酸，含有疏水侧链。聚L-苯丙氨酸具有良好的生物相容性、生物可降解性。李丽颖[9]在聚L-苯丙氨酸的链段中引入亲水性聚乙二醇链段，得到一种具有双亲性的嵌段共聚物。这种自组装的两亲共聚物在药物
输运、靶向载体[10, 11]等方面有着广泛的应用。合成聚氨基酸的方法有固相法[12]、α-氨基酸-N-羧酸酐(NCA)法[13, 14]和酶催化法[15, 16]。其中酶催化氨基酸聚合法具有反应条件温和、步骤简单、副反应少、底物结构选择性高的优点，而且避免了化学合成法繁琐的保护和去保护步骤[17]。催化氨基酸聚合的酶有菠萝蛋白酶[18]、木瓜蛋白酶[15, 19]等。酶催化聚氨基酸的合成反应常以氨基酸酯盐酸盐为反应底物。根据反应机理(图式 1)，在聚合反应体系中，每生成1个酰胺键就会产生1分子HCl和1分子甲醇。由于反应体系中水的存在，从而会促进水解副反应的进行，不利于酶催化氨基酸聚合反应。
本文研究菠萝蛋白酶于非水体系中催化合成齐聚L-苯丙氨酸，并考察了共溶剂二甲亚砜(DMSO)用量、反应时间、反应温度、菠萝蛋白酶浓度和磷酸缓冲溶液(PBS)的pH对催化聚合得率的影响。
菠萝蛋白酶(酶活力单位64.16U)购自源叶生物；L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(购自上海笛柏生物科技有限公司)；二甲亚砜(DMSO)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等均为分析纯级试剂，购自上海国药集团化学有限公司。
在0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH=8.0)中加入0.43g(2.0mmol)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和15% DMSO，反应混合物的总体积为3mL。然后加入2.44U菠萝蛋白酶于40℃下振荡反应3h，反应结束后，离心去除上清液，沉淀用去离子水洗两次，冷冻干燥后得到齐聚L-苯丙氨酸，称重记为m1，计算得率。在相同条件下，以不加酶的反应混合物进行对照实验。
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$ W = \frac{{{m_1}}}{{{m_2}}} \times 100\% $ |
其中，m2为L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的质量。
(1) 反应体系中共溶剂DMSO的含量对聚合得率的影响：在总体积为3mL的反应混合物中加入0.43g L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和体积分数分别为0、5%、10%、15%、20%、25%、30%的DMSO磷酸缓冲液(pH=8，0.2mol/L)。然后加入2.44U的菠萝蛋白酶于40℃恒温振荡器中(1000r/min)反应3h后终止反应，收集产物，计算齐聚L-苯丙氨酸的得率。
(2) 反应时间对聚合得率的影响：在总体积为3mL的反应混合物中加入0.43g L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和体积分数为15%的DMSO磷酸缓冲液，然后加入2.44U的菠萝蛋白酶于40℃恒温振荡器中(1000 r/min)反应，在反应1、2、3、4、5、6 h后终止反应，收集产物，计算齐聚L-苯丙氨酸的得率。
(3) 酶活力对聚合得率的影响：在总体积为3mL的反应混合物中加入0.43g L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和体积分数为15%的DMSO磷酸缓冲液。然后分别加入0.5、0.98、1.48、1.96、2.44、2.94、3.44U的菠萝蛋白酶于40℃恒温振荡器中(1000r/min)反应3h后终止反应，收集产物，计算齐聚L-苯丙氨酸的得率。
(4) 反应温度对聚合得率的影响：在总体积为3mL的反应混合物中加入0.43g L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和体积分数为15%的DMSO磷酸缓冲液。然后加入2.44U的菠萝蛋白酶分别于20、25、30、35、40、45、50 ℃恒温振荡器中(1000r/min)反应3h后终止反应，收集产物，计算齐聚L-苯丙氨酸的得率。
(5) 缓冲溶液pH对聚合得率的影响：在总体积为3mL的反应混合物中加入0.43g L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和体积分数为15%的DMSO磷酸缓冲液(0.2mol/L)，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。然后加入2.44U的菠萝蛋白酶于40℃恒温振荡器中(1000r/min)反应3h后终止反应，收集产物，计算齐聚L-苯丙氨酸的得率。
使用Nicolet 6700全反射傅里叶红外光谱仪(FT-IR)测定产物的红外谱图，扫描次数为16次，分辨率为4cm-1，扫描范围为4000~400 cm-1。
使用AVANCEⅢ HD-400MHz核磁共振谱仪以DMSO-d6为溶剂，TMS为内标，在室温下测定聚合物的1H NMR谱图。
将齐聚L-苯丙氨酸配制成1mg/mL的甲醇溶液。采用LCZ/2690XE/996液相色谱质谱联用仪(Waters，Milford，USA)分析产物的分子量分布。质谱测试条件为：离子方式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；锥孔电压：20V；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：400℃；质量范围m/z为20~2000；探测器电压：1800V。
配制饱和的R-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)溶液。将聚合产物样品溶于DMSO溶液(20μL)中，将总体积为15μL的聚合产物样品溶液与R-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)基质溶液混合，移取0.5μL合物到钢靶上，干燥后测试。通过软件收集m/z的各个峰值，计算聚合产物的链长和聚合度。
在氮气氛围保护下进行测试，升温速率为40℃/min，温度测量范围为25~800℃。
图 1中的齐聚L-苯丙氨酸在1740cm-1处未见吸收峰，而是在1660cm-1处出现明显的C＝O特征吸收峰，说明有酰胺键的存在。这是由于酰胺键上的羰基(C＝O)直接与-NHR相连，共轭效应使C＝O双键性下降，从而使C＝O向低频方向位移。因此，证明了L-苯丙氨酸发生聚合。
齐聚L-苯丙氨酸的1H NMR分析结果如图 2所示。谱图符合齐聚L-苯丙氨酸的结构特征，图 2中各数字对应的各个峰归属分别是：1(Ar)；2(-NH2)；3(ArCH2)；4，6，8(-CH)；5，7(-NHCO)；9(-CH3)。以齐聚L-苯丙氨酸的端位上-CH3为基准，由酰胺键上氢的峰面积算出齐聚L-苯丙氨酸的平均聚合度约为4。
图 3、图 4分别为齐聚L-苯丙氨酸的ESI-MS和MALDI-TOF谱图。组成齐聚L-苯丙氨酸结构单元的m/z为147。聚合物的主要分子量集中在915{[M+H]+，图 3}附近，即齐聚L-苯丙氨酸的主要聚合度为6。m/z 1062处的峰是齐聚L-苯丙氨酸聚合度为7时的峰。由图 4可知，聚合物的主要分子量集中在937{[M+Na]+}附近，即齐聚L-苯丙氨酸的主要聚合度为6。在m/z 790、937、1084、1231处的峰分别为齐聚L-苯丙氨酸聚合度为5、6、7、8的峰。质谱和MALDI-TOF的结果表明菠萝蛋白酶催化聚合得到了齐聚L-苯丙氨酸。Viswanathan等[18]以L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐为反应底物，菠萝蛋白酶进行催化得到齐聚L-苯丙氨酸的主要聚合度为5，其中最大聚合度为7。
DMSO是水解酶如糖苷酶和蛋白酶催化逆水解反应合成化合物的常用共溶剂[20]。其作用有两个方面，一是提高底物的相容性[21]，二是降低水活度[22]。当在反应体系中加入一定量的DMSO后形成非水体系，体系中的水活性下降，从而降低了底物发生水解的能力[22]。由图 5结果可知，随着体系中DMSO的量的增加，聚合产率先增大再降低。在DMSO体积分数为15%时，产率最大为29.16%。当DMSO的体积分数为15%~30%时，聚合产率明显下降，这是因为体系中过多的DMSO会降低菠萝蛋白酶的活性[22]。Viswanathan等[18]报道以其购得的菠萝蛋白酶催化该聚合反应，当DMSO的用量为10%时，齐聚L-苯丙氨酸的得率为18%。本研究中，不添加DMSO时得率约为18.63%；加入DMSO后，得率提高到35.67%。这说明不同来源的菠萝蛋白酶催化合成齐聚L-苯丙氨酸的最佳反应条件和得率不同，在将来的研究中有必要对不同来源的菠萝蛋白酶进行筛选，以获得最佳聚合得率。
由图 6结果可知，聚合反应产率在3h时达到最大，超过3h后得率有所降低。其原因在于，一方面长时间反应会导致酶活性下降；另一方面，蛋白酶催化氨基酸聚合反应是可逆反应，随着产物浓度的增加，聚合产物分解的逆反应趋势增加，也会造成聚合反应得率下降。
由图 7结果可知，在总体积为3mL的反应混合物中加入0.43g L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和体积分数为15%的DMSO磷酸缓冲液(pH=8，0.2mol/L)，当反应体系中加入的菠萝蛋白酶酶活力为2.44U时得率达到最大。使用过多的菠萝蛋白酶催化，齐聚L-苯丙氨酸的产率反而明显降低。菠萝蛋白酶是水解酶，既能催化聚合，又能使肽键水解。所以，随着反应体系中菠萝蛋白酶催化用量的增大，体系中能催化水解反应的酶活性提高，造成齐聚L-苯丙氨酸得率下降。
与典型的化学反应相比，酶催化反应的温度一般比较温和。由图 8可知，聚合反应的得率在40℃时达到最大。当反应温度超过40℃时，聚合反应得率降低，这可能与菠萝蛋白酶在高温条件下的活性下降有关。
非水体系中常需要一定的水量来维持酶的活性构象，从而发挥催化功能[23]，所加缓冲液的pH对酶的催化活性有着重要的影响。由图 9结果可知，酶催化反应在pH为8.0时收率达到最大。根据反应机理(图式 1)，菠萝蛋白酶催化L-苯丙氨酸甲酯分子间发生氨解反应，属于亲核取代反应。这与脂肪酶催化聚酯合成的机理相似[23]，可认为在菠萝蛋白酶催化合成L-苯丙氨酸聚合物时，酶活性中心氨基酸残基提供羧基用于结合并活化L-苯丙氨酸甲酯的氨基进攻另一分子L-苯丙氨酸甲酯的酯基进行氨解反应，生成酰胺键。因此，酶催化环境中的pH会影响菠萝蛋白酶的催化活性中心与L-苯丙氨酸甲酯的结合，导致聚合得率发生变化。此外，当反应在酸性条件下进行时，体系中大量的质子会与L-苯丙氨酸甲酯分子的端位-NH2结合，使-NH2的亲核性下降，造成氨解反应活性下降。因此在弱碱性条件下反应更有利于齐聚L-苯丙氨酸分子中酰胺键的生成。
齐聚L-苯丙氨酸的TGA和DSC分析结果如图 10所示。由TGA曲线可以看出，齐聚L-苯丙氨酸存在两个失重阶段，第一个阶段在200℃内，质量损失大约69.22%，这是齐聚L-苯丙氨酸末端酯基在高温下发生分解，释放甲醇；第二个阶段在200~400℃，质量损失大约20.91%，这是齐聚L-苯丙氨酸中的酰胺键在高温下发生断裂。由DSC曲线可以看出，在121℃时，齐聚L-苯丙氨酸的DSC曲线出现一个吸热峰，这是其发生晶型转变的温度点。
本文以菠萝蛋白酶为催化剂，在非水相中催化L-苯丙氨酸甲酯聚合合成齐聚L-苯丙氨酸。通过单因素试验考察了菠萝蛋白酶催化聚合的反应最优条件。结果表明，在40℃下用2.44U菠萝蛋白酶于15% DMSO的磷酸缓冲液(pH=8.0)中催化L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐聚合，反应3h后产物齐聚L-苯丙氨酸的得率达到最大值，为35.67%。MALDI-TOF图谱显示，齐聚L-苯丙氨酸的最大聚合度为8。由于获得寡肽生物相容性好、易功能化并且可作为聚氨基酸材料的聚合单元，而蛋白酶催化合成聚氨基酸步骤简单、条件温和。所以，酶催化合成聚氨基酸将成为新材料领域重点研究的方法之一，应用潜力巨大。
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图式 1 菠萝蛋白酶催化L-苯丙氨酸甲酯聚合的反应机理
Scheme 1 Reaction mechanism of polymerization of L-phenylalanine methyl ester catalyzed by Bromelain
图 1 L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐与齐聚L-苯丙氨酸的红外图谱
Figure 1 FT-IR spectrum of oligo-L-phenylalanine and L-phenylalanine methyl ester hydrochloride
图 9 反应体系pH对聚合得率的影响
Figure 9 Effect of pH of the reaction system on polymerization yield
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