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• 噻唑并[3, 2-a]嘧啶化合物及其衍生物是一类重要的氮、硫杂环化合物，由于具有良好的生物活性和药理活性，如镇痛^[1]、抗氧化^[2]、抗惊厥^[3]、抗肿瘤^[4]、抗病毒^[5]、抗菌^[6~8]等，其研究备受人们的关注^[9]。

  铁离子是生命体必须的离子之一，很多细胞水平的生物及化学过程都需要铁的参与^[10]，一旦生物体内铁元素缺乏就会发生各种生理系统紊乱^[11~13]；同时，铁过量沉积会导致中枢神经系统出现疾病，如帕金森氏症和阿尔茨海默氏病^[14]。此外，过量的铁离子对环境也产生严重危害^[15]，如破坏植物体内代谢平衡，影响植被生长。因此，铁离子的检测对于环境及生命科学都具有重要的意义。目前，荧光检测法由于具有选择性好、灵敏度高、成本低、简便快捷等特点而得到快速发展^{[16, 17]}。近年来已经报道了许多小分子荧光探针来检测Fe^3+[18~21]，但开发不受其他离子干扰、能在水溶液中识别Fe³⁺的荧光探针，仍是重要的研究方向^[22]。

  本文在合成7-(3-氨基苯并呋喃-2-基)-噻唑并[3, 2-a]嘧啶-5-酮时，为改善其水溶性而引入三乙二醇单甲醚(合成路线见图式1)得到了化合物L，使其易溶于常规溶剂中，为该化合物在药理方面的研究提供了基础。同时，由于L中含有多个N、O、S杂原子，可为金属离子的螯合提供结合位点。荧光光谱研究表明，L在水溶液中能够选择性地识别Fe³⁺，而其他金属离子对识别作用没有干扰。本文为噻唑并[3, 2-a]嘧啶类化合物的应用开拓了新途径，具有较好的借鉴意义。

  图 图式 1  探针L的合成路线 Figure 图式 1.  Synthesis route of probe L

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  1   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  JY12001电子天平(塞多利斯科学仪器(北京)有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器和RE-2000旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；400 MHz核磁共振谱仪(美国Agilent公司)；970CRT荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司)，上海大普有限公司数字酸度计。

  本实验所用固体原料和溶剂均为市售分析纯级，其中三乙二醇单甲醚、丁二酸酐、二氯亚砜、4-二甲氨基吡啶均购自阿拉丁试剂股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷均需干燥处理后使用。柱色谱所用硅胶(100~200目)为青岛裕名化工厂产品；实验用水为去离子水。化合物b根据文献[23]方法制备。

  1.2   合成

  1.3   实验方法

  1.4   光谱测定

  1.2.2   化合物L的合成

  在单口瓶中加入2.64g (10mmol)化合物a和20mL CH₂Cl₂，常温搅拌，在N₂保护下滴加催化剂量(约1mL)的DMF，冰浴下用恒压滴液漏斗将溶于15mL CH₂Cl₂的氯化亚砜逐滴加入到单口瓶中，得黄色透明溶液。搅拌30min后撤去冰浴，常温下反应8h，反应液变为黄色混浊液。过滤，滤液旋干后得到1.07g (粗产率为38%)黄色油状物，不用提纯，直接溶解在30mL DMF中，然后加入1.13g (4.0mmol)化合物b，常温搅拌6h，停止反应后转移至分液漏斗中，加入大量水，用CH₂Cl₂萃取多次，有机溶剂干燥，过滤，所得产物用硅胶柱色谱分离提纯，以二氯甲烷：乙酸乙酯=2：1(体积比)为洗脱剂梯度分离，得到0.88g化合物L，产率为42.1%。¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：10.46(s，1H)，8.28(d，J=8.1Hz，1H)，8.04(d，J=4.9Hz，1H)，7.44(m，2H)，7.28(s，1H)，7.05(d，J=4.9Hz，1H)，6.79(s，1H)，4.28(t，3H)，3.53~3.73(m，10H)，3.37(s，3H)，2.87(s，4H)；¹³C NMR (101MHz，CDCl₃)δ：172.63，169.08，162.93，158.05，154.45，153.47，127.61，126.21，125.77，122.95，122.39，111.45，110.80，98.48，71.88，70.55，69.04，64.02，59.05，58.49，31.88，29.38；HRMS m/z：C₂₅H₂₇N₃O₈S [M+Na]⁺，计算值552.1519；实测值552.1409。

  1.2.1   化合物a的合成

  在100mL单口瓶中分别加入2.97g (18mmol)三乙二醇单甲醚、4.0g (40mmol)丁二酸酐和0.25g (2.0mmol)4-二甲氨基吡啶，用40mL氯仿溶解，回流12h。冷却、旋干溶剂、加入80mL蒸馏水溶解，用正己烷：乙酸乙酯=1：1(体积比)的混合溶剂萃取，再用CH₂Cl₂萃取，合并有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤，旋干溶剂，得到4.24g化合物a，粗产率为81.2%。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：12.24(s，1H)，4.13(t，2H)，3.61(t，2H)，3.53(m，6H)，3.44(m，2H)，3.26(s，3H)，2.52(m，4H)。

  1.3.2   探针L标准溶液的配制

  准确称取13.2570mg化合物L，用0.1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解，转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得到1×10^-3mol/L的母液，使用时根据所需浓度稀释。

  1.3.3   各种金属离子溶液的配制

  以Fe³⁺为例：准确称取0.1353g FeCl₃·6H₂O溶解后置于10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，既得5×10^-2mol/L的溶液，其他阳离子溶液配制方法相同。

  1.3.1   4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液(1×10^-2mol/L)的配制

  在烧杯中加入1.192g HEPES和480mL去离子水，搅拌溶解后，在酸度计的监控下边搅拌边缓慢滴加氢氧化钠溶液，直至溶液达到所需的pH。

  1.4.2   探针L对金属阳离子的抗干扰实验

  将探针L用pH 6.4的HEPES溶液稀释成1×10^-5mol/L，向试管中分别加入2mL探针L溶液和40μL金属离子溶液，放置10min后再各加入40μL Fe³⁺溶液，摇匀后放置30min，测试荧光光谱。

  1.4.3   pH对探针L荧光光谱影响实验

  取适量探针L(1×10^-5mol/L，pH 6.4)的HEPES溶液，用1mol/L NaOH调节pH至11.4；再取适量探针L的HEPES溶液，用1mol/L的HCl调节pH至2.4。取三份L的HEPES溶液，一份为空白对照，一份加入Fe²⁺，另一份加入Fe³⁺，摇匀后放置30min，测试荧光光谱。

  1.4.1   探针L对金属阳离子选择性试验

  将探针L用HEPES溶液稀释成1×10^-5mol/L，向试管中加入2mL探针L(1×10^-5mol/L，pH=6.4)，用微量进样器加入40μL金属离子溶液，摇匀后静止放置30min，以350nm为激发波长，扫描330~700 nm范围内的荧光发射光谱(灵敏度为2，E_x缝宽为5nm，E_m缝宽为5nm)。

  2   结果与讨论

  2.1   化合物L的表征

  以三乙二醇单甲醚和丁二酸酐为原料，经过酯化、酰基化后，所得产物a与7-(3-氨基苯并呋喃-2-基)-噻唑并[3, 2-a]嘧啶-5-酮(b)反应，得到探针L，其¹H NMR如图 1所示。图中，δ 10.45归属于酰胺氮上的氢，6.79~8.29范围内的峰归属于芳香环上的氢，2.87处为丁二酰亚甲基上的氢，3.37处为醚链上甲基的氢，3.53~4.29的峰为醚链上亚甲基上的氢。探针L的¹³C NMR中，δ 172.63、169.08、162.93为3个羰基碳的化学位移峰，98.48~158.05为芳香环上碳的峰，58.49~71.88范围内为烷氧基碳的峰，31.88和29.38是丁二酰亚甲基碳的峰。此外，高分辨质谱实测值也与计算值吻合，进一步证明成功得到了所设计的目标分子L。

  图 1  探针¹H NMR spectra of probe L的¹H NMR谱 Figure 1.  ¹H NMR spectra of probe L

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  2.2   受体L对Fe³⁺的滴定

  不同浓度Fe³⁺对探针L的荧光强度的影响见图 3，当Fe³⁺的浓度逐渐增大时，体系荧光强度逐渐降低，直到加入的Fe³⁺达到2×10^-3mol/L时，荧光强度降到最低，继续增加Fe³⁺的浓度，荧光强度不再变化，即达到了平衡状态。Fe³⁺加入量为200倍时达到平衡，说明探针L识别Fe³⁺的灵敏性一般。

  图 3  探针L的HEPES缓冲溶液(1×10^-5mol/L，λ_ex=350nm)中加入不同浓度的Fe³⁺(0~2×10^-3mol/L)时的荧光光谱 Figure 3.  Fluorescence emission spectra of probe L (1×10^-5mol/L) upon addition different amounts of Fe³⁺(0~2×10^-3mol/L) in HEPES buffer (λ_ex=350nm)

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  为了确定探针L与Fe³⁺的结合模式，我们将探针L和Fe³⁺溶解在甲醇中进行了高分辨质谱测试，结果如图 4所示。[L-H⁺+CH₃O^-+Fe³⁺]的质核比为614.2200，而计算值为614.0957，这说明探针L与Fe³⁺是1：1结合的。其可能的结合模式如图 4内插图所示。我们推测可能是由于铁离子的顺磁性而导致探针L结合Fe³⁺后荧光猝灭。

  图 4  L-Fe³⁺的高分辨质谱(甲醇)；内插图：推测的探针L与Fe³⁺的结合模式 Figure 4.  High resolution mass spectrum of L-Fe³⁺ (methanol); inset: proposed binding mode of probe L with Fe³⁺

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  2.2   受体L对Fe³⁺的识别

  在波长350nm激发下，1×10^-5mol/L探针L的HEPES溶液(pH 6.4)在444nm处有很强的荧光发射峰。向探针L溶液中分别加入2×10^-3mol/L不同种类的金属阳离子，再次测定其荧光发射光谱。从图 2可看出，Hg²⁺和Cr³⁺可引起荧光强度轻微下降，而Fe³⁺引起荧光强度降低了98.7%，而加入其他阳离子，如Na⁺、Ni²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Ag⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺、Sr²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Al³⁺和Cu²⁺等，荧光强度均无明显变化，这表明探针L对Fe³⁺具有很高的识别能力，选择性比较专一。

  图 2  探针L (1×10^-5 mol/L)在HEPES缓冲溶液中分别加入各种阳离子后的荧光强度变化(λ_ex=350nm)；内插图：在365nm紫外灯照射下，探针L及加Fe³⁺后的颜色变化 Figure 2.  Fluorescence spectra of probe L in HEPES buffer (1×10^-5 mol/L) upon addition of various metal cations (λ_ex=350nm); Inset: The color changes of probe L without and with Fe³⁺ under a portable UV lamp at 365nm

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  2.3   共存离子对Fe³⁺识别的影响

  共存离子干扰是影响探针识别性能的一个重要因素，因此我们研究了在金属离子共存条件下探针L对Fe³⁺的识别性能，如图 5所示。L与Hg²⁺或Cr³⁺结合后荧光强度略有降低，随后加入Fe³⁺，也发生了显著荧光猝灭；其他金属离子存在下，探针L对Fe³⁺的荧光响应不受影响，说明L识别Fe³⁺具有较好的抗干扰能力。

  图 5  探针L(1×10^-5mol/L)加入各种金属离子(2×10^-3mol/L)及继续加入Fe³⁺(2×10^-3mol/L)后440nm处荧光强度的变化(λ_ex=350nm) Figure 5.  Fluorescence intensities of L (1×10^-5 mol/L) in the presence of various metal ions (2×10^-3 mol/L, black) and additional Fe³⁺ (2×10^-3 mol/L, red). Intensity was recorded at 444nm, excitation at 350nm

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  2.4   受体L对Fe³⁺的检测限

  为了验证探针L的灵敏度和实际应用价值，以log[Fe³⁺]为横坐标，以(I_max-I)/(I_max-I_min)为纵坐标，利用Origin软件对荧光滴定数据进行线性拟合，结果见图 6。得到线性相关系数为0.9934的一条直线，检测限为4.35×10^-5mol/L^[24]，达到了微摩尔级，说明该受体有较好的灵敏度和潜在的实际应用价值。

  图 6  探针L的荧光比值(I_max-I)/(I_max-I_min)对log[Fe³⁺]的线性关系图 Figure 6.  Normalized response of the fluorescence signed to change Fe³⁺ concentrations

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  2.5   pH对受体L荧光光谱的影响

  为了考察探针L识别Fe³⁺的pH适用范围，以及同系Fe²⁺的影响，测试了不同pH下探针L及其加入Fe³⁺和Fe²⁺后444nm处的荧光强度变化，如图 7所示。从图中可看出pH在2.4至11.4，探针L都表现出较强的荧光；而加入Fe³⁺后荧光强度在此范围内都发生明显猝灭，但是探针L加入Fe²⁺后在8.4至11.4范围内荧光强度也显著猝灭，说明在这个范围内Fe²⁺会对Fe³⁺的识别产生干扰。综合以上分析，可得出探针L识别Fe³⁺的适用pH范围是3.4至6.4，在此pH范围内不受Fe²⁺的干扰。

  图 7  探针L、L-Fe²⁺和L-Fe³⁺在不同pH下的荧光强度(λ_ex=350nm) Figure 7.  The fluorescence intensity of L, L-Fe²⁺ and L-Fe³⁺ solution at the different pH (λ_ex=350 nm)

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  3   结论

  本文以7-(3-氨基苯并呋喃-2-基)-噻唑并[3, 2-a]嘧啶-5-酮为荧光团和螯合基团，设计合成了一种新型水溶性荧光探针L。在HEPES溶液中，探针L对Fe³⁺表现出了较高的选择性，其他阳离子没有干扰，检测限可达4.35×10^-5mol/L。通过高分辨质谱证明该探针与Fe³⁺的结合模式是1：1。探针L适用于酸性环境(pH 3.4~6.4)中对Fe³⁺的检测，有一定的实际应用价值。

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  图式 1  探针L的合成路线

  Scheme 1  Synthesis route of probe L

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  图 1  探针¹H NMR spectra of probe L的¹H NMR谱

  Figure 1  ¹H NMR spectra of probe L

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  图 2  探针L (1×10^-5 mol/L)在HEPES缓冲溶液中分别加入各种阳离子后的荧光强度变化(λ_ex=350nm)；内插图：在365nm紫外灯照射下，探针L及加Fe³⁺后的颜色变化

  Figure 2  Fluorescence spectra of probe L in HEPES buffer (1×10^-5 mol/L) upon addition of various metal cations (λ_ex=350nm); Inset: The color changes of probe L without and with Fe³⁺ under a portable UV lamp at 365nm

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  图 3  探针L的HEPES缓冲溶液(1×10^-5mol/L，λ_ex=350nm)中加入不同浓度的Fe³⁺(0~2×10^-3mol/L)时的荧光光谱

  Figure 3  Fluorescence emission spectra of probe L (1×10^-5mol/L) upon addition different amounts of Fe³⁺(0~2×10^-3mol/L) in HEPES buffer (λ_ex=350nm)

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  图 4  L-Fe³⁺的高分辨质谱(甲醇)；内插图：推测的探针L与Fe³⁺的结合模式

  Figure 4  High resolution mass spectrum of L-Fe³⁺ (methanol); inset: proposed binding mode of probe L with Fe³⁺

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  图 5  探针L(1×10^-5mol/L)加入各种金属离子(2×10^-3mol/L)及继续加入Fe³⁺(2×10^-3mol/L)后440nm处荧光强度的变化(λ_ex=350nm)

  Figure 5  Fluorescence intensities of L (1×10^-5 mol/L) in the presence of various metal ions (2×10^-3 mol/L, black) and additional Fe³⁺ (2×10^-3 mol/L, red). Intensity was recorded at 444nm, excitation at 350nm

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  图 6  探针L的荧光比值(I_max-I)/(I_max-I_min)对log[Fe³⁺]的线性关系图

  Figure 6  Normalized response of the fluorescence signed to change Fe³⁺ concentrations

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  图 7  探针L、L-Fe²⁺和L-Fe³⁺在不同pH下的荧光强度(λ_ex=350nm)

  Figure 7  The fluorescence intensity of L, L-Fe²⁺ and L-Fe³⁺ solution at the different pH (λ_ex=350 nm)

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