English

• 半胱氨酸(Cysteine, Cys)又称2-氨基-3-巯基丙酸, 是人体内20种基本氨基酸之一, 可由人体内甲硫氨酸转化而来. Cys在厌氧环境中在脱氢酶的作用下分解成丙酮酸、H₂S和氨, 亦可通过转氨酶作用, 发生氨基转移, 经由中间产物β-巯基丙酮酸分解产生丙酮酸和硫磺^[1].在氧化条件下, Cys氧化成半胱氨酸亚磺酸残基后, 可经过转氨基作用分解成为SO₂和丙酮酸^[2]. Cys是一种含有巯基的具有一定还原性的氨基酸, 具有较强的亲核能力, 很容易在体内被氧化, 在很多生理活动中发挥着重要的作用, 其在细胞内氧化还原平衡和新陈代谢方面起着非常重要的作用^[3]. Cys在生物体内对毒性物质例如醛类、氯仿、重金属离子、过氧化脂、河豚毒、酒精等具有解毒作用^{[4, 5]}; 还可以预防和治疗放射性物质对人体的伤害; 具有维持皮肤正常新陈代谢、调节底层黑色素的生成和改善皮肤性质的作用; 同时, 还具有防止生物体衰老的功能^[6].因此, Cys在生理活动中表现出独特和重要的作用, 是人体内必不可少的组成氨基酸.但是异常的Cys水平会引起一些疾病的产生.例如Cys不足会延缓儿童生长, 头发脱色, 水肿, 嗜睡, 肝损伤, 脂肪损失, 皮肤损伤以及虚弱等症状; Cys含量过高则会引起神经毒性相关疾病^[7~10].因此, 发展一种快速灵敏、操作简单、可对活体内Cys水平实时监测的方法具有重要的意义.

  近年来, 有关Cys荧光探针的报道增长很快, 但是多数Cys荧光探针受到来自含有巯基的Hcy和GSH的干扰, 无法进行区分^[11~14].同时许多报道的探针发射波长处于非近红外区域^[15~18], 因此大大限制了探针的应用.基于此, 我们构建了一例基于罗丹明类似物的近红外Cys荧光探针CS-Cys, 该探针可以特异性识别Cys, 而Hcy和GSH与探针没有响应.该探针具有较快的响应速度与较低的检测限, 而且荧光发射在近红外区域, 有较好的活体成像应用潜力.

  1.   结果与讨论

  1.1   探针分子的设计与合成

  罗丹明类染料是一类常见的荧光分子, 具有优良的荧光性质, 如Stokes位移大, 荧光量子产率高, 稳定性好等, 被广泛应用于荧光探针的设计.以罗丹明类似物为荧光团, 共轭桥连苯环, 有可能构建出近红外荧光团.该荧光团上引入丙烯酸酯作为Cys响应基, 即得近红外Cys荧光探针.基于上述思路, 我们设计合成了探针CS-Cys, 合成路线如Scheme 1所示.中间体S2和S1参考文献报道的方法^[19~22]制得, 在二氯甲烷溶液中, 三乙胺为席夫碱条件下, 荧光团S1与丙烯酰氯室温反应后经提纯得到探针CS-Cys.在目标探针的¹H NMR中, 分别在δ 6.06, 6.33~6.44观察到丙烯酸酯C＝C双键上三个氢的化学位移.在¹³C NMR中观察到新的羰基碳化学位移, 核磁氢谱与碳谱的峰个数均与目标化合物结构相符, 高分辨质谱测试值m/z: 534.2274 [M]⁺与理论值534.2275相符, 这些结果证明得到目标化合物.正如预期, 探针与Cys反应后, 羟基裸露出, 由于发生分子内ICT过程, 可观察到荧光发射增强.探针对Cys具有较好的选择性识别, 其他活性硫包括GSH、Hcy与探针不反应.

  图式 1

  

  图式 1.  探针CS-Cys的合成路线

  Scheme 1.  Synthetic route of probe CS-Cys

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  1.2   探针CS-Cys不同pH环境中紫外吸收研究

  最先, 探究了单独探针在不同pH缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱测试.单独探针溶液在不同pH的PBS缓冲溶液中, 在pH＝1~10时, 10 μmol/L探针吸收主要在556 nm处, 在pH＝11~13处, 吸收红移到630 nm, 并且吸收增强, 主要是因为在强碱性环境中, 丙烯酸酯键断开造成的. pH＝14时, 探针氧鎓负离子结构被破坏, 整体共轭被破坏, 630 nm处吸收几乎消失.当在含有10 μmol/L的不同pH探针溶液中, 加入100 μmol/L Cys后, 紫外吸收在pH＝1~7时, 吸收由556 nm移动到562 nm, pH＝8时, 吸收红移到570 nm, pH＝9~13时, 吸收在630 nm, 其中pH＝11~14基本和不加Cys吸收一致.在pH＝9~10时, 在弱碱环境中, 酚羟基形成氧负离子, 供电子能力增强, 探针ICT效应增强, 结构共轭变大, 吸收发生较大红移.

  随后选择了pH＝8和10作为探针检测Cys的测试条件.在pH＝8时, 对于不同浓度的Cys (0~10 equiv.)的吸收探针CS-Cys (10 μmol/L), 随着Cys浓度增加, 探针CS-Cys的吸收发生红移至570 nm, 并且吸收强度增加.接下来探究了在pH＝10时不同Cys浓度对探针吸收的影响.随着Cys浓度的增加, 探针CS-Cys的吸收由556 nm红移至630 nm, 同时吸收逐渐增强.紫外-可见吸收光谱研究表明, 探针在复杂的pH环境中对Cys有较好的识别效果.

  1.3   探针CS-Cys不同pH环境中荧光发射研究

  探究了单独探针CS-Cys在不同pH的PBS缓冲溶液中, 以及其与Cys反应后的荧光发射规律.在pH＝1~10时, 激发波长在570和630 nm时, 探针分别在660和720 nm有微弱的荧光发射; 而在pH＝11~13和激发波长为570 nm时, 荧光发射570 nm红移到720 nm, 激发波长为630 nm时, 在720 nm有较明显的荧光发射峰出现. pH＝14时没有荧光发射.当加入100 μmol/L Cys后, 在pH＝1~8时, 激发波长在570, 660 nm荧光强度增加, 激发波长在660 nm时, 720 nm没有明显的荧光发射出现; pH＝9~10时, 660 nm荧光强度下降, 并在720 nm处荧光强度增加, 同时在激发波长在660, 720 nm荧光增强; pH＝11~14时与单独探针CS-Cys荧光发射几乎一致.该研究结果与探针在不同pH中吸收基本一致, 进一步证明通过调节pH可调控基团的供电子能力, 进而调控荧光发射波长.

  1.4   探针CS-Cys检测Cys的选择性研究

  为了探究探针CS-Cys的选择性, 进行了选择性测试.在pH＝8的PBS缓冲溶液中, 单独探针溶液在660 nm有很弱的荧光发射, 再加入Cys后, 荧光强度增强约1倍.而加入其他活性氧、阴离子和Hcy/GSH后, 荧光发射几乎没有发生改变.在紫外吸收光谱中, 单独探针吸收在556 nm处, 而与Cys反应后, 吸收红移至570 nm处, 其他分析物不与探针CS-Cys发生反应, 吸收不变.由于丙烯酸酯吸电子能力较弱, 并没有完全造成探针分子本身荧光猝灭, CS-Cys作为一种荧光增强型的探针, 可以特异性地检测Cys, 有效地将Cys和其他巯基氨基酸(Hcy/GSH)区分开.

  1.5   探针CS-Cys检测Cys的竞争性研究

  考察了其他活性氧、活性硫和阴离子对探针识别Cys过程是否有干扰.在向含有10 μmol/L的探针溶液中加入10 equiv.其他竞争性离子后, 再加入10 equiv. Cys放置一段时间, 测试荧光光谱.结果表明加入Cys后荧光发射都出现显著增强, 其他竞争性离子不会干扰探针对Cys识别的过程, 证明探针具有较强的抗干扰能力.

  1.6   探针CS-Cys的荧光滴定实验和检测限计算

  分别在pH＝8和pH＝10 PBS缓冲溶液中研究了探针CS-Cys与Cys的浓度荧光变化规律.在pH＝8时, 激发波长为570 nm时, 660 nm处荧光强度随着Cys浓度增加而增强; 激发波长为630 nm时, 720 nm处荧光发射峰并没有发生明显的变化.以660 nm处荧光强度值为纵坐标, Cys浓度为横坐标, 进行线性拟合, 两者呈现出较好的线性关系(R²＝0.9977).由检测限公式DL＝3σ/k计算出探针CS-Cys对Cys的检测限为0.169 μmol/L.

  在含有10 μmol/L探针CS-Cys pH＝10的PBS缓冲溶液中, 用570 nm光激发时, 逐渐加入Cys, 660 nm处荧光强度增加的趋势很弱, 而用630 nm作为激发波长时, 在720 nm处荧光发射强度明显增强(增强大约2.5倍).分析720 nm处荧光强度值与Cys浓度的关系发现, 当Cys浓度在0至10 μmol/L区间, 两者显现出优良的线性拟合关系(R²＝0.9977), 经由检测限公式DL＝3σ/k计算, 检测限为0.402 μmol/L.

  1.7   探针CS-Cys检测Cys的动力学研究

  对pH＝8的PBS缓冲溶液中探针CS-Cys与Cys的反应过程进行动力学测试.激发波长为570 nm时, 以660 nm处荧光强度为纵坐标, 时间为横坐标作图.在1.5 h内, 单独探针CS-Cys溶液荧光强度几乎没有发生改变, 表明探针具有良好的稳定性.加入10 equiv.的Cys后, 在20 min时, 荧光强度趋于平衡.即探针CS-Cys对Cys具有较快响应速度, 具备在活体内检测Cys的潜力.

  1.8   探针CS-Cys检测Cys的可能机理

  根据文献[23]报道和上述实验结果, 我们推测响应机理如Scheme 2所示. Cys与丙烯酸酯通过迈克尔加成反应, 氨基接着进攻酯键, 进而发生分子内环化形成一种七元环内酰胺副产物并释放荧光.对探针CS-Cys与Cys反应后的溶液进行高分辨质谱测试, 发现出现一个新的质子峰m/z 480.2172, 这与化合物S1的理论分子量480.2169基本一致.以上结果证实了我们推测的机理, 即探针与Cys经过Michael加成环化反应, 释放荧光团S1.

  图式 2

  

  图式 2.  探针CS-Cys识别Cys的可能机理

  Scheme 2.  Possible mechanism of recognition of Cys by probe CS-Cys

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  2.   结论

  设计了一种新型基于罗丹明类似物的Cys近红外荧光探针CS-Cys, 探针结构经过核磁、高分辨质谱得到确证.该探针可在纯PBS缓冲溶液中对Cys快速灵敏、特异性识别, pH＝8时检测限为0.169 μmol/L, pH＝10时检测限为0.402 μmol/L.选择性实验发现, 探针不与其他巯基氨基酸发生反应, 仅与Cys反应.对探针与Cys反应后在不同pH环境中的荧光表现进行测试后发现, 在ICT过程中, 由于供电子能力不同, ICT效应也不同, 荧光发射会随着ICT效应的增强而发生红移.探针CS-Cys为Cys检测提供了一种有效的化学工具, 具有潜在的生物应用价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Q-Tof高分辨质谱仪购自Waters Micromassr; Bruker AvanceⅢ-400核磁共振仪购自Bruker; 安捷伦8453型紫外分光光度计购自安捷伦公司(Agilent); Milli-Q纯水机购自默克化工技术有限公司; FL4600荧光光谱仪购自日本日立高新技术公司; PHS-3C pH计购自上海悦丰仪器仪表有限公司.丙烯酰氯购自安耐吉化学.

  3.2   4-(4-丙烯酰氧基-苄烯基)-9-(2-羧酸苯基)-6-二乙胺基-1, 2, 3, 4-四氢氧杂蒽盐(CS-Cys)的合成

  于100 mL圆底烧瓶中, 准确称取580.0 mg (1 mmol) S1溶于50 mL无水二氯甲烷中, 加入三乙胺151.8 mg (1.5 mmol).将0.6 mL丙烯酰氯溶于10 mL无水二氯甲烷中, 于0 ℃下缓慢滴加到圆底烧瓶中.滴加完毕, 升至室温, N₂保护下, 搅拌过夜.旋转蒸发除去二氯甲烷, 粗产品柱层析[洗脱剂为V(甲醇):V(二氯甲烷)＝1:10, R_f＝0.25]分离得到352 mg深蓝色产物, 产率65.3%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.00 (d, J＝7.4 Hz, 1H), 7.67 (t, J＝7.3 Hz, 1H), 7.58 (t, J＝7.1 Hz, 1H), 7.46~7.44 (m, 3H), 7.25 (d, J＝7.5 Hz, 1H), 7.19 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 6.65 (d, J＝17.3 Hz, 1H), 6.56 (d, J＝8.8 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.44~6.33 (m, 2H), 6.06 (d, J＝11.2 Hz, 1H), 3.40 (q, J＝6.6 Hz, 4H), 2.84~2.65 (m, 2H), 2.12~2.09 (m, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.20 (t, J＝6.9 Hz, 6H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 169.9, 164.5, 152.7, 151.2, 149.8, 149.5, 147.9, 134.9, 134.3, 132.8, 130.7, 130.6, 129.3, 128.7, 127.9, 125.8, 125.5, 125.1, 123.8, 121.3, 109.5, 109.3, 105.8, 97.2, 97.1, 44.6, 27.1, 23.3, 22.3, 12.6; HRMS (ESI) calcd for C₃₄H₃₂NO₅: 534.2275, found 534.2274.

  3.3   溶液配制

  准确称取相应质量的探针CS-Cys, 溶于DMSO中, 配成1 mmol/L的溶液, 储存于冰箱中备用.阴离子和巯基氨基酸均是利用其对应钠盐或者直接溶于去离子水后使浓度为10 mmol/L.测试体系为纯PBS缓冲溶液(pH＝8和pH＝10).荧光光谱仪的激发波长: 570和630 nm, 狭缝: 5 nm, 电压: 700 V.

  辅助材料(Supporting Information)  探针CS-Cys的¹H NMR, ¹³C NMR, HR-MS, 紫外和荧光光谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图式 1  探针CS-Cys的合成路线

  Scheme 1  Synthetic route of probe CS-Cys

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  图式 2  探针CS-Cys识别Cys的可能机理

  Scheme 2  Possible mechanism of recognition of Cys by probe CS-Cys

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