English

• 1.   引 言

  蜂蜜是一种营养价值很高的纯天然食品，含有转化酶、矿质元素和维生素等人体代谢所需要的多种营养物质，广泛应用于胃肠道、肝脏、心脏、呼吸系统、神经系统等多种疾病的调理治疗^{[1, 2]}。但蜂蜜中化学污染物残留^{[3, 4]}给蜂蜜市场和食用者健康带来极大隐患，许多国家都制订了严格的检测标准。蜂蜜中化学污染物的来源主要是蜜蜂采集了含有化学污染物(如农药)的蜜源植物。敌敌畏(Dichlorvos,DDVP)是一种广谱的杀虫剂，人过量摄入会导致头晕、呕吐、腹泻和呼吸困难甚至死亡，但是由于敌敌畏廉价、药效好，在治疗蜜源植物病虫害时仍常常被滥用，导致蜂蜜中敌敌畏残留量超标。

  检测蜂蜜中敌敌畏的常规方法有气相色谱(GC)法^[5~7]、液相色谱-质谱联用(LC-MS)法^{[8, 9]}、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法^[3]，这些检测方法通常需要经过提取、净化等繁琐的样品预处理过程，难以适应蜂蜜的快速检测要求，因此迫切需要建立蜂蜜中敌敌畏的直接、快速检测方法，以满足对蜂蜜质量监管的需要。中性解吸-电喷雾萃取电离质谱技术^[10](Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry,ND-EESI-MS)结合了样品解吸方法与三维空间内萃取电离的优点，将采样过程从时间和空间上截然分开：带电液滴与样品液滴在空间进行碰撞融合，发生液-液萃取和电荷转移，继而发生去溶作用，从而获得待测物离子供后续质谱分析。ND-EESI-MS已被应用于水果成熟度^[11]、鱼肉的新鲜程度^[12]、蔬菜受大肠杆菌污染情况^[13]以及蜂蜜中氯霉素的检测^[14]等。EESI-MS^[15]技术已被应用于蒜瓣组织中多种化学成分分析^[16]、蛋白组学分析^[17]、人体呼出气体一氧化氮的定量测定^[18]等方面。本研究采用ND-EESI-MS技术，在无需样品预处理的前提下，实现了蜂蜜中敌敌畏的直接质谱检测。本研究建立的蜂蜜中化学污染物快速检测的实验平台，可为其它复杂样品中化学污染物的直接、快速分析提供借鉴和参考。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  中性解吸装置和EESI离子源^{[16, 17]}(江西省质谱科学与仪器重点实验室研制); LTQ-XL线性离子阱质谱仪，配有Xcali-bur数据处理系统(美国Finnigan公司); GC-2010 Plus气相色谱仪，配有火焰光度检测器(GC-FPD)、AOC-20i自动进样器(日本SHIMADZU公司); Rtx-1701型弹性石英毛细管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm，美国RESTEK公司); 低速离心机(上海安亭公司); XW-80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司); DC-24氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司); 电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司); 精密电子天平(Mettler Toledo); 纯水制备仪(赛默飞世尔科技)。

  敌敌畏标准品(纯度98.8%，百灵威科技有限公司); 甲醇(美国Tedia公司); 乙醇、乙酸乙酯、苯(西陇化工股份有限公司); 乙腈(迪马科技有限公司); 乙酸(如意科技有限公司)。以上试剂均为色谱纯; 丙酮、甲酸、二甲苯均为国产分析纯试剂; 蜂蜜由江西农业大学蜂蜜研究所提供。

  2.2.   实验方法

  2.2.2.   质谱条件和色谱条件

  为保证样品分子最大限度与试剂离子进行碰撞并发生反应，实验装置^[16]中EESI离子源样品通道口与质谱口水平夹角30°，两喷雾通道夹角60°，距离质谱口0.5 cm; 采用正离子检测模式，质量范围m/z 60~300，碰撞能量25%。敌敌畏定性测定的实验条件：中性解吸剂和萃取剂为甲醇，电喷雾电压3.5 kV，萃取剂流速4 μL/min，雾化气(N₂，纯度99.999%)压力1.2 MPa，样品端辅助端气压(N₂)1.2 MPa，离子传输管温度150℃，定量实验参数通过实验优化获得。

  GC进样口温度：250℃，检测器温度：260℃; 程序升温：初始温度60℃，以25℃/min升至150℃，保持1 min，以3℃/min升至200℃，保持1 min，以8℃/min升到260℃，保持8 min; 载气：高纯氮气(纯度99.999%); 进样量：1 μL，分流比5:1。

  GC-FPD检测：按照文献^[3]和国家标准^[19]，采用乙酸乙酯对加标蜂蜜样品进行提取。

  2.2.1.   标准溶液和加标蜂蜜的配制

  (1)标准溶液的配制 取适量敌敌畏标准品，用甲醇配制成400 μg/mL的储备液，4℃保存; 实验时稀释为0.5~100 μg/mL不同梯度浓度的敌敌畏溶液，现用现配。(2)加标蜂蜜的配制 称量19.80 mL蜂蜜于50 mL锥形瓶，45℃水浴5 min，加入200 μL一定浓度的敌敌畏标准品，搅拌均匀，冷却待用。

  3.   结果与讨论

  3.1.   ND-EESI-MS加标蜂蜜定性实验

  按照2.2.2 质谱条件，对敌敌畏甲醇溶液(400 ng/mL)进行EESI-MS检测，每个浓度测定6次。敌敌畏分子含有2个氯原子，在正离子模式下，出现m/z 221、223和 225离子峰。选择相对丰度较高的m/z 223作为母离子进行串联质谱分析，得到m/z 109、127、145和147 碎片离子^[20]，分别为母离子丢失C₂HOCl₂,C₂HCl₂,C₂HO³⁷Cl和C₂HO³⁵Cl。选择m/z 109和127作为定性离子，m/z 127相对丰度最高，作为定量离子。按照2.2.1节配制加标蜂蜜(400 ng/mL)并进行ND-EESI-MS检测，与EESI-MS的谱图吻合(图 1)。

  图 1

  

  图 1  敌敌畏质谱图 (a)敌敌畏甲醇溶液(400 ng/mL)电喷雾萃取电离质谱(EESI-MSⁿ)图; (b) 敌敌畏加标(400 ng/mL)蜂蜜中性解吸电喷雾萃取电离质谱(ND-EESI-MSⁿ)图

  Figure 1.  Mass spectra of dichlorvos: (a) Extractive electrospray ionization tandem mass spectrum (EESI-MSⁿ) of dichlorvos in methanol (400 ng/mL); (b) Neutral desorption (ND)-EESI-MSⁿ spectra of honey spiked with dichlorvos (400 ng/mL)

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  3.2.   加标蜂蜜ND-EESI-MS实验条件优化

  3.3.   ND-EESI-MS检测蜂蜜基质中敌敌畏的线性范围、回收率和精密度

  按照2.2.1 节配制5~1000 ng/mL不同梯度浓度的敌敌畏加标蜂蜜样品，在优化条件下，进行ND-EESI-MS检测，每个浓度测定6次，标准曲线见图 2。蜂蜜基质中敌敌畏在5~1000 ng/mL范围内，与m/z 127的平均信号强度线性关系良好，线性方程为y=7.63x(ng/mL)－13.81，相关系数(R²)为0.998，检出限为1.0 ng/mL(S/N≥3)。在蜂蜜中添加10,30和400 ng/mL的敌敌畏，进行标准加入回收实验，并与气相色谱(GC)方法进行比较性实验，结果见表 1。GC方法的线性范围5~1000 ng/mL，检出限为1.6 ng/mL。两种方法检测性能相比，ND-EESI-MS的检出限略低，两种方法的回收率、精密度差异不大。相对于GC-FPD方法，ND-EESI-MS方法操作更简便，检测时间更短，节省样品预处理时间，检测速度快。

  图 2

  

  图 2  采用ND-EESI-MS检测蜂蜜中敌敌畏的标准曲线

  Figure 2.  Standard curve for detection of dichlorvos in honey using ND-EESI-MS technique

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  表 1

  

  表 1  ND-EESI-MS方法与GC-FPD方法标准加入的回收率和精密度比较表

  Table 1.  Recoveries and RSDs of ND-EESI-MS and GC-FPD methods for dichlorvos detection in honey

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  加入量Added(ng/mL)	ND-EESI-MS方法			GC-FPD方法
  	回收率Recovery(%)	RSD(%，n=3)		回收率Recovery(%)	RSD(%，n=3)
  10	93.0	4.4		105.5	7.6
  30	96.0	3.3		110.3	4.2
  400	103.0	4.3		94.9	3.0

  3.4.   实际蜂蜜样品测定

  采用ND-EESI-MS和GC-FPD对9种市售蜂蜜中的敌敌畏残留进行测定。结果表明，ND-EESI-MS检出4种蜂蜜(百花¹、枣花、洋槐、百花²)含有敌敌畏，GC-FPD检出2种(百花¹、洋槐)含有敌敌畏，其它5种蜂蜜(苜蓿、芙蓉、油菜、槐花、紫云英)均未检出敌敌畏。可能是GC-FPD预处理过程存在误差导致部分样品未检出敌敌畏，ND-EESI-MS无需样品预处理，一定程度上可减小样品预处理过程中导致的误差等问题。

  3.5.   蜂蜜中敌敌畏检测方法对比

  将本研究的ND-EESI-MS方法与文献报道的对蜂蜜中敌敌畏检测的常规方法进行对比，结果如表 2。

  表 2

  

  表 2  蜂蜜中敌敌畏检测方法的检出限、检测时间、回收率及精密度

  Table 2.  LODs,detection time,recoveries and RSDs of methods for dichlorvos detection in honey

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  序号No.	方法Method	检出限LOD	检测时间Detection time	回收率 Recovery(%)	精密度 RSD (%)	参考文献Reference
  1	GC-FPD	0.02~0.10μg/mL	~1.0 h	86.6~94.4	4.5	[6]
  2	GC-FPD	—	~1.0 h	103.1~106.2	2.8~4.0	[5]
  3	GC-FPD	0.10 ng/g	~3.0 h	78.2	12.1	[6]
  4	GC-ECD	6.00 μg/kg	~3.0 h	77.0,97.0	6.2,5.7	[7]
  5	GC-MS	1.00μg/L	~2.5 h	84.0~86.0	6.8~7.1	[3]
  6	LC-MS	0.10 μg/kg	~1.0 h	78.5~80.5	9.1~12.3	[8]
  7	LC-MS	21.54 ng/kg	~1.0 h	92.0~110.4	＜9.2	[9]
  8	ND-EESI-MS	1.0 ng/mL	1 min	93.0~103.0	＜4.4	本工作This wok
  FPD: Flame photometric detection; ECD: Electron capture detection.

  常规方法部分检出限较高，样品检测时间约1~3 h。本研究中，采用GC-FPD做对照，进行了蜂蜜中敌敌畏的检测，其检出限、精密度和回收率等指标和ND-EESI-MS相近，而单个样品的检测时间约0.5 h，样品预处理时间约0.5 h; 相比之下，ND-EESI-MS检测单个蜂蜜样品中敌敌畏的分析时间仅需约1 min，大大缩短了样品分析时间，可以用于蜂蜜品质的快速鉴定，实现快速、高通量检测的目的。

  3.2.1.   萃取剂优化

  以甲醇-水(1:1，V/V)、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、苯、二甲苯和乙酸乙酯作为萃取剂进行实验。结果表明，乙腈、苯、二甲苯和乙酸乙酯作萃取剂，m/z 127的信号较弱; 甲醇/水、水、甲醇、乙醇、丙酮作萃取剂，m/z 127的信号较强，其中甲醇/水的信号最强。分别向甲醇/水(1:1，V/V)中加入甲酸和乙酸(1%,5%,10%,15%,20%,V/V)，发现随着乙酸浓度的增加，m/z 127的信号增强，在5%达到最高(1.6×10³); m/z 127的信号强度随甲酸浓度的增加而增强，在20%达到最高，且为加入5%乙酸时信号强度的2倍。因此，本实验选择甲醇-水-甲酸(2:2:1，V/V)作为定量测定的萃取剂。

  3.2.3.   其它参数优化

  以甲醇-水-甲酸(2:2:1,V/V)作萃取剂，甲醇-水(2:3,V/V)为解吸剂，进行电喷雾电压、萃取剂流速等参数的优化。结果表明，定量分析最适实验条件为：电喷雾电压3.8 kV、萃取剂流速5.0 μL/min、雾化气压力和样品端辅助气压1.2 MPa、离子传输管温度200℃。

  3.2.2.   中性解吸剂优化

  以甲醇-水-甲酸(2: 2: 1，V/V)作萃取剂，考察了不同比例的甲醇-水(10:0,4:1,3:2,1:1,2:3,1:4; 0:10,V/V)作中性解吸剂，m/z 127的信号强度。发现甲醇-水(2:3，V/V)时m/z 127的信号强度最高。选择甲醇-水(2:3,V/V)作为定量测定的解吸剂。

  4.   结 论

  常规的质谱、色谱等检测样品中化学污染物之前，一般均需提取、净化等步骤，因而存在操作繁琐、耗时长等问题。本研究采用ND-EESI-MS方法，在无需样品预处理的条件下，实现了蜂蜜中敌敌畏的快速检测。本方法具有操作简单、检测速度快的特点，可实现蜂蜜品质的快速鉴定，有望为其它复杂基体中化学污染物的高通量检测提供借鉴和依据，在对复杂基质样品中化学污染物的直接快速分析方面具有良好的应用前景。

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  Figure 1  Mass spectra of dichlorvos: (a) Extractive electrospray ionization tandem mass spectrum (EESI-MSⁿ) of dichlorvos in methanol (400 ng/mL); (b) Neutral desorption (ND)-EESI-MSⁿ spectra of honey spiked with dichlorvos (400 ng/mL)

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  Figure 2  Standard curve for detection of dichlorvos in honey using ND-EESI-MS technique

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  Table 1.  Recoveries and RSDs of ND-EESI-MS and GC-FPD methods for dichlorvos detection in honey

  加入量Added(ng/mL)	ND-EESI-MS方法			GC-FPD方法
  	回收率Recovery(%)	RSD(%，n=3)		回收率Recovery(%)	RSD(%，n=3)
  10	93.0	4.4		105.5	7.6
  30	96.0	3.3		110.3	4.2
  400	103.0	4.3		94.9	3.0

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  Table 2.  LODs,detection time,recoveries and RSDs of methods for dichlorvos detection in honey

  序号No.	方法Method	检出限LOD	检测时间Detection time	回收率 Recovery(%)	精密度 RSD (%)	参考文献Reference
  1	GC-FPD	0.02~0.10μg/mL	~1.0 h	86.6~94.4	4.5	[6]
  2	GC-FPD	—	~1.0 h	103.1~106.2	2.8~4.0	[5]
  3	GC-FPD	0.10 ng/g	~3.0 h	78.2	12.1	[6]
  4	GC-ECD	6.00 μg/kg	~3.0 h	77.0,97.0	6.2,5.7	[7]
  5	GC-MS	1.00μg/L	~2.5 h	84.0~86.0	6.8~7.1	[3]
  6	LC-MS	0.10 μg/kg	~1.0 h	78.5~80.5	9.1~12.3	[8]
  7	LC-MS	21.54 ng/kg	~1.0 h	92.0~110.4	＜9.2	[9]
  8	ND-EESI-MS	1.0 ng/mL	1 min	93.0~103.0	＜4.4	本工作This wok
  FPD: Flame photometric detection; ECD: Electron capture detection.

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