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海绵放线菌Nocardiopsis dassonvillei OUCMDZ-4534的活性天然产物

刘海珊 ,  朱国良 ,  赵水鸽 ,  付鹏 ,  朱伟明

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引用本文: 刘海珊, 朱国良, 赵水鸽, 付鹏, 朱伟明. 海绵放线菌Nocardiopsis dassonvillei OUCMDZ-4534的活性天然产物[J]. 有机化学, 2019, 39(2): 507-514. doi: 10.6023/cjoc201806045 shu
Citation:  Liu Haishan, Zhu Guoliang, Zhao Shuige, Fu Peng, Zhu Weiming. Bioactive Natural Products from the Marine Sponge-Derived Nocardiopsis dassonvillei OUCMDZ-4534[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2019, 39(2): 507-514. doi: 10.6023/cjoc201806045 shu

海绵放线菌Nocardiopsis dassonvillei OUCMDZ-4534的活性天然产物

  • 中国海洋大学医药学院 海洋药物教育部重点实验室 青岛 266003

    • 通讯作者: 朱伟明, weimingzhu@ouc.edu.cn
  • 基金项目:

    国家自然科学基金（Nos.81561148012，U1501221，U1606403）资助项目

摘要: 拟诺卡氏菌（Nocardiopsis dassonvillei）OUCMDZ-4534分离自西沙贪婪倔海绵（Dysidea avara），其发酵提取物表现出生物碱显色、系列紫外吸收及抑菌和肿瘤细胞毒活性.从其发酵产物中分离到12个化合物.通过质谱（MS）、紫外（UV）、红外光谱（IR）、电子圆二色谱（ECD）、核磁共振（NMR）和化学计算等方法，首次确定了外消旋体1中对映体的绝对构型分别为（3aS，7aS）-3a-羟基-3a，7a-二氢苯并呋喃-2（3H）-酮（1a）和（3aR，7aR）-3a-羟基-3a，7a-二氢苯并呋喃-2（3H）-酮（1b），其它化合物依次被确定为吩嗪（2）、1-羟基吩嗪（3）、1-甲氧基吩嗪（4）、1，6-二羟基吩嗪（5）、1-羟基-6-甲氧基吩嗪（6）、1，6-二羟基吩嗪-5-氧化物（7）、2-（4-甲基-2，6-二羟基-3，5-二氯）苯甲酰基-3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯（8）、N-（2-羟基苯基）乙酰胺（9）、N-（2-羟基苯基）苯甲酰胺（10）、（E）-3-（4-羟基）苯丙烯酸（11）和（E）-3-（4-羟基-3-甲氧基）苯丙烯酸（12）.化合物1和9分别对A549和K562细胞有选择性抑制作用，半数抑制浓度（IC50）分别为0.47和0.46 μmol·L-1；化合物4~8对K562、A549和MCF-7细胞表现出不同程度抑制作用，IC50值在0.02~1.48 μmol·L-1之间；化合物11对K562细胞以及化合物12对K562和MCF-7细胞有较强抑制活性，IC50分别为1.14、0.88和0.62 μmol·L-1.化合物7和8分别对烟曲霉（Aspergillus fumigates）和交替假单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）有抑制活性，其最小抑菌浓度（MIC）分别为25.00和2.00 μg·mL-1.化合物4~6和9还表现出对甲型流感H1N1病毒的抑制活性，IC50分别为0.04、0.15、0.06和0.30 mmol·L-1.

English

  • 人们已从海洋动植物中发现了大量结构新奇、活性显著的化合物, 这些最初来自动植物的化合物, 实际上可能由其共附生微生物产生[1].这些海洋微生物与海洋动植物存在共附生、寄生、共栖等多种类型的相互关系，在从宿主获取营养的同时[2], 还可产生活性物质协助寄主抵御天敌或促进寄主生长与代谢[3].有报道显示, 存在于海洋动植物表面或内部的微生物能产生具有抑菌或细胞毒活性的天然产物[4], 是药物先导化合物的主要来源之一.

    根据本课题组对2015~2016年中国天然产物的统计分析[5], 海洋放线菌天然产物的出新骨架率和活性率最高, 分别为19%和27%.有研究表明, 15%的海洋放线菌新天然产物来源于拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)[6].拟诺卡氏菌是经典的丝状放线菌类群, 从海洋来源的拟诺卡氏菌中已分离到多种结构类型的天然产物, 包括大环内酯[7]、吡喃酮[8]、二酮哌嗪[9]等, 表现出多样的生物活性.在继续开展海洋放线菌活性天然产物的研究中[10~12], 我们发现西沙贪婪倔海绵(Dysidea avara)来源的拟诺卡氏菌(N. dassonvillei) OUCMDZ-4534, 其发酵产物对肿瘤细胞株具有选择性抑制作用, 浓度为0.1 mg·mL-1时对K562、A549和MCF-7细胞株的抑制率分别为86.6%、49.1%和5.3%.运用多种色谱手段, 从OUCMDZ-4534发酵产物的乙酸乙酯提取物中分离得到12个化合物, 包括外消旋体1、吩嗪类2~7及其它化合物8~12(图 1).通过波谱学手段, 确定了外消旋化合物1的结构分别为(3aS, 7aS)-3a-羟基-3a, 7a-二氢苯并呋喃-2(3H)-酮(1a)和(3aR, 7aR)-3a-羟基-3a, 7a-二氢苯并呋喃-2(3H)-酮(1b), 这是首次确定该化合物的绝对构型.其它化合物依次被确定为吩嗪(2)[13]、1-羟基吩嗪(3)[14, 15]、1-甲氧基吩嗪(4)[14]、1, 6-二羟基吩嗪(5)[15, 16]、1-羟基-6-甲氧基吩嗪(6)[17]、1, 6-二羟基吩嗪-5-氧化物(7)[18]、2-(4-甲基-2, 6-二羟基-3, 5-二氯)苯甲酰基-3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯(8)[19]、N-(2-羟基苯基)乙酰胺(9)[20]、N-(2-羟基苯基)苯甲酰胺(10)[21]、(E)-3-(4-羟基)苯丙烯酸(11)[22]和(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基)苯丙烯酸(12)[22](图 1).化合物1和9能够选择性抑制A549细胞和K562细胞, 其IC50分别为0.47和0.46 μmol·L-1, 化合物11能够抑制K562细胞, IC50为1.14 μmol·L-1; 化合物12能抑制K562和MCF-7细胞, IC50分别为0.88和0.62 μmol·L-1; 化合物4~8对K562、A549和MCF-7肿瘤细胞株均有抑制作用, IC50介于0.02~0.60 μmol·L-1之间.此外, 化合物7和8有抗菌活性, 化合物7抑制烟曲霉的最小抑菌浓度(MIC)为25.00 μg·mL-1、化合物8抑制交替假单胞菌的MIC为2.00 μg·mL-1.化合物4~6及9还表现出抗病毒活性, 抑制甲型流感H1N1病毒的IC50分别为0.04、0.15、0.06和0.30 mmol·L-1, 与阳性药利巴韦林(IC50为0.14 mmol·L-1)相当.

    图 1

    图 1.  化合物1~12的结构
    Figure 1.  Structures of compounds 1~12
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    1.   结果与讨论

    1.1   菌株鉴定结果

    OUCMDZ-4534的16S rDNA基因PCR扩增序列长度为1464bp, 该基因系列(GenBank登录号MH540129)与EzTaxon-e数据库中的菌株N. dassonvillei strain DSM 43111[23]的16S rDNA基因序列同源性为99%, 亲缘关系最近, 且系统发育树处于同一分支.加之在ISP2培养基上, 菌株基丝发达致密、边缘丝状、气丝粉状、颜色白色至微灰色, 培养2周以上可产生微黄至褐色水溶性色素, 与N. dassonvillei的形态特征相一致, 故鉴定其为达松维尔拟诺卡氏菌N. dassonvillei.

    1.2   化合物的结构鉴定

    化合物1为白色无定形粉末, 高分辨质谱HRESIMS在m/z 151.0405给出准分子离子峰[M－H]-, 故分子式被确定为C8H8O3.红外光谱提示分子中存在酯羰基(1769 cm-1)、羟基(3415 cm-1)、双键(1649 cm-1)等结构片段; 紫外光谱在λmax 257 nm处的吸收带表明分子中含有同环共轭双烯的发色团. 1H NMR、13C NMR、DEPT(表 1)及HSQC谱显示分子中含有1个酯羰基信号(δC 174.3)、4个双键碳氢信号(δC/H 121.3/5.91, 125.4/6.08, 123.8/5.85, 132.1/5.90)、1个O-sp3季碳信号(δC 72.9)、1个O-sp3碳氢信号(δC/H 84.8/5.07)、一个sp3亚甲基信号(δC/H 41.9/2.73 & 2.61)以及1个醇羟基信号(δH 5.96). 1H-1H COSY中从H-7a (δH 5.07)/H-7 (δH 5.85)/H-6 (δH 6.08)/H-5 (δH 5.91)/H-4 (δH 5.90)的信号, 结合HMBC谱(图 2)中从H-7a和H-4到C-3a (δC 72.9)信号可以确认结构中含有1, 3-环己二烯片段, 而从H-3 (δH 2.73 & 2.61)到C-3a/C-4/C-2, 以及3a-OH (δH 5.96)到C-3a/C-3的信号可以判断亚甲基为C-3位, 结合分子式可以推出化合物1的构造为3a-羟基-3a, 7a-二氢苯并呋喃-2(3H)-酮[24].化合物1的实测旋光值为零、ECD曲线在基线附近波动, 判断为外消旋体.对其进行手性拆分[Chiralpac IC柱, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, 1 mL·min-1, V(EtOH): V(he-xane)=70: 30], 获得光学纯的左旋体(－)-1 (1a)和右旋体(+)-1 (1b), 比旋光值分别为[α]D16-15.0 (c 0.10, MeOH)和+10.3 (c 0.10, MeOH).

    表 1

    表 1  化合物1的1H NMR (600 MHz)和13C NMR (150 MHz)数据(DMSO-d6)
    Table 1.  1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) data for compound 1 (DMSO-d6)
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    Position δC δH (J in Hz)
    2 174.3, C
    3 41.9, CH2 2.61 (d, 17.4), 2.73 (d, 17.4)
    3a 72.9, C
    4 132.1, CH 5.89 (d, 10.2)
    5 121.3, CH 5.91 (dd, 4.7, 10.2)
    6 125.4, CH 6.08 (dd, 4.7, 9.7)
    7 123.8, CH 5.85 (dd, 3.4, 9.7)
    7a 84.8, CH 5.07 (d, 3.4)
    3a-OH 5.96 (br s)

    图 2

    图 2.  化合物1的COSY和HMBC相关图
    Figure 2.  Selected COSY and HMBC correlations of compound 1
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    为确定化合物1中C-3a与C-7a位的相对构型, 即HO-3a与H-7a是顺式还是反式, 分别计算了cis-1以及trans-1的13C NMR, 并进行了DP4 (developed parameter of comparison parameter 3)分析[25].结果表明cis-1的计算值与实测值误差较小, 线性拟合较好(表 2、图 3), 证明化合物1相对构型为顺式.进一步计算了cis-1的一对对映体(3aS, 7aS)-1以及(3aR, 7aR)-1的电子电子圆二色谱(CD), 并与实测值相比较, 结果显示(3aS, 7aS)-1与(－)-1 (1a)实测的ECD吻合(图 4), 而(3aR, 7aR)-1与(+)-1 (1b)实测的ECD吻合(图 4), 从而确定了化合物1中左右旋体的绝对构型.

    表 2

    表 2  cis-1和trans-1的13C NMR及其DP4分析
    Table 2.  DP4 analysis of 13C NMR for cis-1and trans-1
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    Position Calcd 13C Expt. 13C Scaled shift Corrected error Probability
    trans-1 cis-1 trans-1 cis-1 trans-1 cis-1 trans-1 cis-1
    2 186.5 185.8 174.3 172.9 172.3 1.4 2.0 0.28 0.20
    3 44.8 44.8 44.7 42.8 42.9 1.9 1.8 0.22 0.22
    3a 80.5 81.5 72.9 75.6 76.6 -2.7 -3.7 0.13 0.07
    4 138.6 139.9 132.1 129.0 130.1 3.1 2.0 0.10 0.20
    5 134.7 131.2 121.3 125.3 122.2 -4.0 -0.9 0.05 0.36
    6 133.2 133.3 125.4 124.0 124.1 1.4 1.3 0.27 0.29
    7 135.6 132.9 123.8 126.2 123.7 -2.4 0.1 0.16 0.48
    7a 89.1 91.3 84.8 83.5 85.5 1.3 -0.7 0.30 0.38
    Products of probabilities 5.70×10-7 1.21×10-5
    Bayes's theorem probability/% 5 95

    图 3

    图 3.  基于B3LYP/6-31G(d, p)的13C NMR计算与实测分析
    Figure 3.  The analysis of experimental (expt.) and calculated (calcd.) 13C NMR at the B3LYP/6-31G(d, p) level

    (a) Linear correlation plots of calcd. vs expt. δC values for cis-1 and trans-1; (b) Relative errors between calcd. and expt. δC values for cis-1 and trans-1[25]

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    图 4

    图 4.  化合物1a和1b的实测及计算ECD曲线
    Figure 4.  Computed and measured ECD for 1a and 1b
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    1.3   化合物生物活性

    以人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人慢性髓系白血病细胞K562和人正常肝细胞L-02为模型, 测试了化合物1~12的细胞毒活性.其中MCF-7、A549和L-02采用噻唑蓝(MTT)比色法测试[26], K562细胞采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)法测试[27].结果表明, 化合物1和9表现出对肿瘤细胞株的选择性抑制作用.化合物1对A549细胞的IC50和选择性指数SI (相对于L-02细胞)分别为0.47 μmol·L-1和106, 化合物9对K562细胞的IC50和SI分别为0.46 μmol·L-1和0.8.化合物12则表现出对K562和MCF-7细胞的抑制作用, IC50和SI分别为0.88 μmol·L-1和56.8以及0.62 μmol·L-1和80.6.相对于人正常细胞L-02, 化合物11对K562有一定的选择性、其IC50和SI分别为1.14 μmol·L-1和8.8.化合物4~8对三种肿瘤细胞均有抑制活性, IC50值为0.02~0.60 μmol·L-1, 均强于阳性药阿霉素, 但对肿瘤细胞和正常细胞的选择性较差(表 3).

    表 3

    表 3  化合物1~12对A549、MCF-7、K562及L-02细胞株的IC50值
    Table 3.  IC50 and SI values of compounds 1~12 on A549, MCF-7, K562 and L-02 cell lines
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    Compd IC50 (μmol·L-1)/SI
    K562 A549 MCF-7 L-02
    1 ＞50 0.47/＞106 ＞50 ＞50
    2 0.60/0.6 0.23/1.6 5.5/0.1 0.37
    3 ＞10 ＞10 ＞10 ＞10
    4 0.25/0.6 0.02/8.0 1.48/0.1 0.16
    5 0.03/3.0 0.07/1.3 0.06/1.5 0.09
    6 0.24/0.5 0.14/0.9 0.09/1.3 0.12
    7 1.03/0.2 0.06/3.7 0.20/1.1 0.22
    8 0.02/3.5 0.10/7.0 0.07/1.0 0.07
    9 0.46/0.8 ＞50 ＞50 0.39
    10 ＞50 ＞50 ＞50 ＞50
    11 1.14/＞8.8 3.36/＞3.0 4.25/＞2.3 ＞10
    12 0.88/＞56.8 ＞50 0.62/＞80.6 ＞50
    阿霉素 0.73/1.2 0.63/1.3 1.00/0.8 0.84

    测试了化合物1~12对9种人体致病菌, 即金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC6538、耐甲氧西林金葡菌(Staphylococcus aureus) ATCC43300、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) ATCC10145、产气夹膜梭菌(Clostridium perfringens) ATCC13124、大肠埃希氏菌(Escherichia coli) ATCC11775、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC6051、白色假丝酵母菌(Candida albicanss) ATCC10231、光滑假丝酵母菌(C. glabrata) ATCC2001、烟曲霉(A. fumigatus)以及8种水产致病菌, 即黄海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)、蜡状芽孢杆菌(B. cereus) ATCC14579、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda) ATCC15947、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus) ATCC17802、创伤弧菌(V. vulnificus) ATCC27562、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、假交替单胞菌P. nigrifaciens)的抑制活性[28, 29].结果显示, 吩嗪类化合物7对烟曲霉有抑制活性, MIC为25.00 μg·mL-1, 弱于阳性药伊曲康唑(MIC为1.25 μg·mL-1); 化合物8对假交替单胞菌有抑制作用, MIC为2.00 μg·mL-1, 弱于阳性药环丙沙星(MIC为0.25 μg·mL-1).

    此外，还测试了化合物1~12对甲型H1N1流感病毒的抑制活性[30].其中, 化合物4~6及化合物9对甲型H1N1流感病毒的IC50分别为0.04、0.15、0.06和0.30 mmol·L-1, 与阳性药利巴韦林(IC50为0.14 mmol·L-1)相当.

    2.   结论

    利用含有燕麦粉和无机盐的寡营养培养基培养西沙海绵来源拟诺卡氏菌OUCMDZ-4534, 获得了12个天然产物, 其中6个为吩嗪类化合物.采用手性拆分、碳谱与ECD计算的方法, 首次确定了外消体3a-羟基-3a, 7a-二氢苯并呋喃-2(3H)-酮(1)中左、右旋体的绝对构型.首次发现化合物1对A549细胞株、化合物9对K562细胞株以及化合物12对K562和MCF-7细胞株具有选择性抑制活性, 化合物4~8对3株肿瘤细胞株均有强细胞毒活性; 化合物4和5还具有比利巴韦林更强的抗H1N1流感病毒活性, 化合物8对交替假单胞菌有弱抑制活性; 1, 6-二羟基吩嗪-5-氧化物(7)对烟曲霉有抗真菌活性, 可能与其分子中的氮氧化物相关.

    3.   实验部分

    3.1   仪器与试剂

    核磁共振仪为德国Bruker公司Avance 500和JEOL公司JNM-ECP 600;高分辨质谱仪为Waters公司Micromass EI-4000 (Autospec-Ultima-TOF); 普通一级质谱仪为Thermo Scientific公司LTQ Orbitrap XL; 紫外光谱仪为Beckman公司DU 640;红外光谱仪为美国NICOLET公司NEXUS 470FT-IR; 旋光仪为JASCO公司P-1020;电子电子圆二色谱仪为JASCO公司J-810;高效液相色谱仪为Waters公司1525泵、2998二极管阵列检测器, Empower Ⅲ工作站, YMC-Pack ODS-A柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)、Chiralpac IC柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm); 半制备高效液相色谱仪为Waters公司1525泵, 2487紫外检测器, Breeze工作站, YMC-Pack ODS-A柱(5 μm, 10 mm×250 mm), πNAP柱(5 μm, 10 mm×250 mm); 凝胶为Pharmacia公司Sephadex LH-20;薄层层析硅胶板、柱层析硅胶购于青岛海洋化工厂.提取、分离用试剂纯度为工业用化学纯; 分析用试剂纯度为色谱纯.

    3.2   菌株的分离和鉴定

    放线菌OUCMDZ-4534于2013年12月使用蔗糖密度梯度法分离自西沙贪婪倔海绵(D. avara)样品, 综合16s rDNA序列(GenBank登录号MH540129)及生长形态比对, 确定为达松维尔拟诺卡氏菌(N. dassonvillei).该菌株目前保藏于本课题组-80 ℃超低温冰箱.

    3.3   菌株的发酵萃取

    纯化菌株划线接种于高氏1号固体琼脂培养基中(组成为: 2%可溶性淀粉、0.1% KNO3、0.05% K2HPO4·3H2O、0.05% MgSO4·7H2O、0.001% FeSO4、0.05% NaCl, pH 7.5), 28 ℃倒置培养7 d.长势良好的菌株接种于无菌ISP3液体培养基中(组成为: 2%燕麦粉、0.0001% FeSO4·7H2O、0.0001% MnCl2·4H2O、0.0001% ZnSO4· 7H2O, pH 7.2), 于28 ℃、180 r·min-1条件下摇床培养11 d, 共发酵96 L.发酵结束后, 分离菌丝体和发酵液, 菌丝体使用85%丙酮-水体系浸泡后机械破碎, 超声处理60 min后萃取三次, 合并萃取液减压浓缩除去丙酮, 剩余水相采用等量乙酸乙酯萃取三次, 合并有机相减压浓缩蒸干, 得到菌丝体提取物12 g.发酵液用等量乙酸乙酯萃取三次, 合并有机相减压浓缩蒸干, 得到发酵液提取物61 g.

    3.4   菌株代谢产物的分离纯化

    菌丝体和发酵液提取物经HPLC分析发现, 组成基本相同, 合并得到总提取物73 g.使用石油醚溶解总浸膏, 得到不溶于石油醚的大极性组分Fr.1和溶于石油醚的小极性组分Fr.2.对组分Fr.2 (47.0 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH2Cl2): V(MeOH)＝1: 1]洗脱得到5个亚组分Fr.2-1~Fr.2-5.对亚组分Fr.2-4 (1.8 g)采用Sephadex LH-20凝胶柱层析, 经甲醇洗脱, 得到Fr.2-4-1、化合物5 (tR 10.6 min, 630.0 mg)和化合物7 (tR 12.0 min, 16.0 mg).组分Fr.2-4-1 (0.7 g)经HPLC分离[ODS柱, V(CH3CN): V(H2O)＝15: 85, 含0.5%三氟乙酸]得到化合物6 (tR 10.2 min, 450.0 mg).对Fr.1 (26.0 g)运用减压硅胶柱层析, 采用梯度洗脱[V(石油醚): V(CH2Cl2)=75: 1, 50: 1, 35: 1, 30: 1, 25: 1, 15: 1, 9: 1, 5: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 7, 1: 20]得到组分Fr.3~Fr.15.组分Fr.6 (0.1 g)经Sephadex LH-20凝胶柱层析甲醇洗脱得到4个亚组分Fr.6-1~Fr.6-4.组分Fr.6-1 (12.0 mg)经加压硅胶柱层析[V(石油醚): V(CH2Cl2)=1: 1]纯化后, 经半制备HPLC分离[πNAP柱, V(MeOH): V(H2O)=55: 45]得到化合物3 (tR 11.0 min, 1.0 mg).组分Fr.9 (2.0 g)经Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH2Cl2): V(MeOH)=1: 1]分离得到19个亚组分Fr.9-1~Fr.9-19. Fr.9-13 (8.0 mg)经半制备HPLC分离[πNAP柱, V(MeOH): V(H2O)=80: 20]得到化合物2 (tR 16.3 min, 2.0 mg). Fr.9-14 (6.2 mg)经半制备HPLC分离[πNAP柱, V(MeOH): V(H2O)=67: 33]得到化合物10 (tR 15.0 min, 1.6 mg).组分Fr.11 (0.8 g)经Sephadex LH-20凝胶柱层析甲醇洗脱得到14个亚组分Fr.11-1~Fr.11-14. Fr.11-8 (52.0 mg)经半制备HPLC分离[ODS柱, V(MeOH): V(H2O)=40: 60]得到化合物1 (tR 6.0 min, 1.6 mg)和化合物9 (tR 8.0 min, 32.0 mg).外消旋化合物1 (1.6 mg)经过手性拆分[Chiralpac IC柱, V(EtOH): V(hexane)=70: 30]得到1a (tR 9.2 min, 0.6 mg)和1b (tR 15.8 min, 0.6 mg). Fr.11-9 (12.0 mg)经半制备HPLC分离[ODS柱, V(MeOH): V(H2O)=60: 40]得到化合物4 (tR 17.1 min, 3.8 mg). Fr.11-11 (66.0 mg)经半制备HPLC分离[πNAP柱, V(MeOH): V(H2O)=67: 33, 含0.5%三氟乙酸]得到化合物11 (tR 12.5 min, 3.8 mg)和化合物12 (tR 17.0 min, 40.0 mg). Fr.11-13 (20.0 mg)经半制备HPLC分离[ODS柱, V(MeOH): V(H2O)=60: 40]得到化合物4 (tR 17.0 min, 15.0 mg).

    (3aS, 7aS)-3a-羟基-3a, 7a-二氢苯并呋喃-2(3H)-酮(1a):白色无定形固体; [α]16 D-15.0 (c 0.10, MeOH); ECD (0.0060 mol·L-1, MeOH) λmax [Δε/(mdeg·mol-1·cm2)]: 200 (-0.23), 216 (+0.31), 257 (+0.76) nm, UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 257 (4.5) nm; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (126 MHz, DMSO-d6, 见表 1); IR (KBr) νmax: 1769, 3415, 1649 cm-1; HRESIMS calcd for C8H7O3 [M-H]- 151.0405, found 151.0405.

    (3aR, 7aR)-3a-羟基-3a, 7a-二氢苯并呋喃-2(3H)-酮(1b):白色无定形固体; [α]16 D+10.3 (c 0.10, MeOH); ECD (0.0060 mol·L-1, MeOH) λmax (Δε/(mdeg·mol-1·cm2)): 200 (+0.23), 216 (-0.31), 257 (-0.76) nm; UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 257 (4.5) nm; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (126 MHz, DMSO-d6)(表 1); IR (KBr) νmax: 1769, 3415, 1649 cm-1; HRESIMS calcd for C8H7O3 [M－H]- 151.0405, found 151.0405.

    吩嗪(2):淡黄色无定形粉末, m.p. 156~157 ℃ (lit.[31] 155~156 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 206 (4.7), 248 (4.8), 361 (4.1) nm; 1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ: 8.24 (dd, J=6.8, 1.3 Hz, 4H, H-1/4/6/9), 7.94 (ddd, J=6.8, 6.8, 1.3 Hz, 4H, H-2/3/7/8); 13C NMR (126 MHz, Pyridine-d5) δ: 131.1 (4×CH, C-1/4/6/9), 129.4 (4×CH, C-2/3/7/8), 142.9 (4×C, C-4a/ 5a/9a/10a); ESI-MS m/z: 181.1 [M+H]+.

    1-羟基吩嗪(3):白色无定形粉末, m.p. 172~173 ℃ (lit.[14] 172~174 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1· cm-1)]: 211 (4.6), 256 (5.0), 369 (3.8) nm; 1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ: 7.76~7.80 (m, 2H, H-2/4), 7.25 (dd, J=6.9, 1.5 Hz, 1H, H-3), 8.23~8.25 (m, 1H, H-6), 7.84~7.88 (m, 2H, H-7/8), 8.26~8.29 (m, 1H, H-9); 13C NMR (126 MHz, Pyridine-d5) δ: 151.8 (C, C-1), 109.0 (CH, C-2), 130.9 (CH, C-3), 120.1, (CH, C-4) 144.1 (C, C-4a), 144.0 (C, C-5a), 130.6 (CH, C-6), 129.3 (CH, C-7), 129.9 (CH, C-8), 132.0 (CH, C-9), 144.3 (C, C-9a), 134.8 (C, C-10a); ESI-MS m/z: 197.1 [M+H]+.

    1-甲氧基吩嗪(4):黄色无定形粉末, m.p. 171~172 ℃ (lit.[13] 169~171 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 210 (4.6), 345 (4.9), 360 (3.8) nm; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.10 (d, J=8.2 Hz, 1H, H-2), 7.75 (t, J=16.1, 8.2 Hz, 1H, H-3), 7.82~7.88 (m, 1H, H-4), 8.25 (d, J=8.0 Hz, 1H, H-6), 7.82~7.88 (m, 2H, H-7/8), 8.40 (d, J=8.0 Hz, 1H, H-9), 4.19 (s, 3H, CH3O-1); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ: 155.3 (C, C-1), 106.6 (CH, C-2), 130.7 (CH, C-3), 121.6 (CH, C-4), 143.7 (C, C-4a), 142.4 (C, C-5a), 130.4 (CH, C-6), 129.5(CH, C-7), 130.3 (CH, C-8), 131.0 (CH, C-9), 144.4 (C, C-9a), 137.1 (C, C-10a), 56.7 (CH3, CH3O-1); ESI-MS m/z: 211.1 [M+H]+.

    1, 6-二羟基吩嗪(5):黄色针状晶体, m.p. 278~279 ℃ (lit.[16] 278~279 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 216 (5.3), 272 (5.7) nm; 1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ: 7.48 (d, J=7.4 Hz, 2H, H-2/7), 7.83 (d, J=8.1 Hz, 2H, H-3/8), 7.77 (t, J=7.7 Hz, 2H, H-4/9); 13C NMR (126 MHz, Pyridine-d5) δ: 155.6 (2×C, C-1/6), 111.5 (2×CH, C-2/7), 132.3 (2×CH, C-3/8), 119.8 (2×CH, C-4/9), 143.4 (2×C, C-4a/9a), 137.3 (2×C, C-5a/10a); ESI-MS m/z: 211.1 [M－H]-.

    1-羟基-6-甲氧基吩嗪(6):黄色针状晶体, m.p. 190~191 ℃ (lit.[32] 190~191 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 212 (4.7), 271 (5.3), 369 (4.0) nm; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.08 (d, J=7.3 Hz, 1H, H-2), 7.72~7.76 (m, 2H, H-3/8), 7.93 (d, J=8.6 Hz, 1H, H-4), 7.22 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-7), 7.79 (d, J=8.8 Hz, 1H, H-9), 4.17 (s, 3H, CH3O-6), 7.25 (s, 1H, HO-1); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ: 151.5 (C, C-1), 109.4 (CH, C-2), 131.5 (CH, C-3), 120.6 (CH, C-4), 142.7 (C, C-4a), 134.8 (C, C-5a), 155.3 (C, C-6), 107.0 (CH, C-7), 130.6 (CH, C-8), 121.1 (CH, C-9), 142.1 (C, C-9a), 137.6 (C, C-10a), 56.7 (CH3, CH3O-6); ESI-MS m/z: 227.1 [M+H]+.

    1, 6-二羟基吩嗪-5-氧化物(7):红色无定形粉末, m.p. 245~246 ℃; UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 211 (4.6), 265 (5.3), 377 (4.3) nm; 1H NMR (500 MHz, Pyridine-d5) δ: 7.44 (d, J=7.7 Hz, 1H, H-2), 7.71 (t, J=7.8 Hz, 1H, H-3), 8.11 (d, J=9.1 Hz, 1H, H-4), 7.15 (dd, J=6.4, 2.1 Hz, 1H, H-7), 7.61~7.66 (m, 1H, H-8), 7.61~7.66 (m, 1H, H-9), 14.34 (brs, 1H, HO-6); 13C NMR (126 MHz, Pyridine-d5) δ: 156.5 (C, C-1), 113.3 (CH, C-2), 133.4 (CH, C-3), 107.9 (CH, C-4), 134.1 (C, C-4a), 125.7 (C, C-5a), 156.5 (C, C-6), 112.7 (CH, C-7), 132.6 (CH, C-8), 119.6 (CH, C-9), 145.2 (C, C-9a), 139.4 (C, C-10a); ESI-MS m/z: 227.1 [M－H]-.

    Dihydrogeodin (8):黄色针状晶体, m.p. 214~215 ℃ (lit.[33] 214~216 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 227 (5.1), 276 (4.7) nm; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 6.70 (d, J=1.4 Hz, 1H, H-4), 6.91 (d, J=1.4 Hz, 1H, H-6), 2.40 (s, 3H, H-7'), 3.63 (s, 3H, CH3O-3), 3.64 (s, 3H, CH3O-7), 10.11 (s, 1H, HO-5), 11.74 (s, 2H, HO-2'/6'); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ: 128.0 (C, C-1), 125.5 (C, C-2), 156.8 (C, C-3), 103.7 (CH, C-4), 158.7 (C, C-5), 107.5 (CH, C-6), 165.7 (C, C-7), 200.3 (C, C-8), 56.1 (CH3, CH3O-3), 52.3 (CH3, CH3O-7), 111.3 (C, C-1'), 155.2 (C, C-2'), 112.2 (C, C-3'), 141.8 (C, C-4'), 112.2 (C, C-5’), 155.2 (C, C-6'), 18.9 (CH3, C-7'); ESI-MS m/z: 402.0 [M+H]+.

    2-Acetamidophenol (9):白色无定形粉末, m.p. 208~209 ℃ (lit.[34] 210~212 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 241 (4.9), 283 (4.6) nm; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 7.66 (d, J=8.0 Hz, 1H, H-3), 6.75 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-4), 6.93 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-5), 6.86 (d, J=7.7 Hz, 1H, H-6), 2.10 (s, 3H, H-8), 9.31 (s, 1H, HN-1), 9.74 (s, 1H, HO-2); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ: 147.9 (C, C-1), 126.4 (C, C-2), 122.4 (CH, C-3), 119.0 (CH, C-4), 124.7 (CH, C-5), 116.0 (CH, C-6), 169.0 (C, C-7), 23.6 (CH3, C-8); ESI-MS m/z: 152.1 [M+H]+.

    2-Benzamidophenol (10):淡黄色无定形粉末, m.p. 170~171 ℃ (lit.[35] 168~169 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 245 (5.2), 296 (5.0) nm; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.08 (d, J=8.2 Hz, 1H, H-3), 6.93 (t, J=7.5 Hz, 1H, H-4), 7.17 (t, J=7.9 Hz, 1H, H-5), 7.20 (d, J=7.9 Hz, 1H, H-6), 7.92 (d, J=7.5 Hz, 2H, H-9/13), 7.53 (t, J=7.5 Hz, 2H, H-10/12), 7.61 (d, J=7.5 Hz, 1H, H-11); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ: 149.0 (C, C-1), 133.3 (C, C-2), 120.0 (CH, C-3), 120.8 (CH, C-4), 127.5 (CH, C-5), 122.5 (CH, C-6), 167.3 (C, C-7), 139.3 (C, C-8), 127.5 (2×CH, C-9/13), 129.1 (2×CH, C-10/12), 132.7 (CH, C-11); ESI-MS m/z: 214.1 [M+H]+.

    (E)-7-Hydroxycinnamic acid (11):白色无定形粉末, m.p. 212~213 ℃ (lit.[36] 208~209 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 309 (4.9) nm; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 7.47 (d, J=14.6 Hz, 1H, H-2), 6.29 (d, J=14.6 Hz, 1H, H-3), 6.79 (d, J=8.0 Hz, 1H, H-5/9), 7.50 (d, J=7.5 Hz, 1H, H-6/8), 12.12 (s, 1H, HO-1), 9.99 (s, 1H, HO-7); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ: 168.0 (C, C-1), 144.6 (CH, C-2), 115.7 (CH, C-3), 125.3 (C, C-4), 130.1 (2×CH, C-5/9), 115.8 (2×CH, C-6/8), 159.6 (C, C-7); ESI-MS m/z: 165.1 [M+H]+.

    (E)-7-Hydroxy-6-methoxycinnamic acid (12):白色无定形粉末, m.p. 171~172 ℃ (lit.[37] 171~172 ℃); UV (MeOH) λmax [log ε/(L·mol-1·cm-1)]: 323 (5.1) nm; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 7.47 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2), 6.38 (d, J=15.8 Hz, 1H, H-3), 7.27 (s, 1H, H-5), 6.80 (d, J=8.1 Hz, 1H, H-8), 7.07 (d, J=8.2 Hz, 1H, H-9), 3.81 (s, 3H, CH3O-6), 12.13 (s, 1H, HO-1), 9.55 (s, 1H, HO-7); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ: 168.0 (C, C-1), 144.6 (CH, C-2), 115.7 (CH, C-3), 125.8 (C, C-4), 111.2 (CH, C-5), 147.9 (C, C-6), 149.1 (C, C-7), 115.6 (CH, C-8), 122.9 (CH, C-9), 55.7 (CH3, CH3O-6); ESI-MS m/z: 195.2 [M+H]+.

    3.5   化合物活性测试

    3.5.1   细胞毒活性

    生长期的细胞(贴壁细胞MCF-7、A549、L02、悬浮细胞K562)分散为单个细胞, 调整细胞悬液浓度分别为贴壁细胞3×104 cell·mL-1, 悬浮细胞5×104 cell·mL-1, 于96孔板中每孔加入100 μL, 置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养.化合物采用细胞级二甲基亚砜(DMSO)溶解, 初浓度2 mmol·L-1, 加药前, 采用RPMI-1640培养基将化合物DMSO溶液梯度稀释, 得到浓度依次为20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 μmol·L-1的溶液.阳性药阿霉素采用细胞级DMSO溶解, 初浓度为200 μmol·L-1, 加药前, 用RPMI-1640培养基将阳性药的DMSO溶液稀释为2 μmol·L-1的溶液. 96孔板中细胞培养12 h后, 在空白对照组、阳性对照组及实验组分别加入RPMI-1640培养基、2 μmol·L-1阿霉素溶液及梯度化合物溶液, 体积均为100 μL, 使得阿霉素浓度1 μmol·L-1, 化合物浓度10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313 μmol·L-1, 每组三个复孔.继续培养72 h后, 贴壁细胞每孔加入20 μL 0.5% MTT溶液, 继续培养4 h后, 吸干孔内培养液, 每孔加入150 μL DMSO, 低速振荡10 min, 在酶联免疫检测仪波长570 nm处测量吸光度, 并计算细胞增殖抑制率和IC50.细胞增殖抑制率(%)=(空白对照组OD570 nm-实验组OD570 nm)/空白对照组OD570 nm×100%.悬浮细胞每孔加入10 μL CCK-8溶液, 继续培养6 h, 在酶联免疫检测仪波长405 nm处测量吸光度, 并计算细胞增殖抑制率和IC50.细胞增殖抑制率(%)=(空白对照组OD405 nm－实验组OD405 nm)/空白对照组OD405 nm×100%.

    3.5.2   抑菌活性

    致病真菌接种于YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose, 也缩写为YEPD)培养基, 致病细菌接种于LB培养基, 摇床(28 ℃, 180 r·min-1)分别培养24和12 h, 使用相应培养基将菌悬液稀释到浓度为2×105 cell·mL-1.化合物和阳性药(真菌为酮康唑, 细菌为环丙沙星)使用细胞级DMSO配制，并使用对应培养基二倍稀释成梯度浓度, 最高初浓度为512 μg·mL-1. 96孔板内每孔加入菌液100 μL, 再分别加入100 μL化合物或阳性药溶液, 每组三个复孔, 样品浓度为256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 μg·mL-1.将96孔板置于28 ℃培养箱中, 细菌培养12 h, 真菌培养24 h后观察结果, 以每组复孔中液体的浑浊程度为判断依据, 菌液由浑浊变澄清的第一个梯度即为化合物的MIC.

    3.5.3   烟曲霉活性

    烟曲霉接种于PDA (Potato Dextrose Agar)培养基, 在28 ℃培养箱中培养3~4 d, 刮取孢子于无菌研钵, 以灭菌生理盐水溶解研磨, 形成烟曲霉悬液.计数并用RMPI-1640培养基将菌悬液稀释到2×104 cell·mL-1.化合物和阳性药伊曲康唑用细胞级DMSO溶解, 并用RMPI-1640培养基二倍稀释成梯度浓度, 最高初浓度为512 μg·mL-1.在96孔板内加入致病菌液100 μL, 再分别加入100 μL化合物或阳性药溶液, 每组三个复孔, 化合物浓度为256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 μg·mL-1.加药结束后, 将96孔板置于28 ℃培养箱中, 培养2~3 d后观察, 以每组复孔中液体的浑浊程度作为判断依据, 菌液由浑浊变澄清的第一个梯度即为待测样品的MIC.

    3.5.4   抗甲型H1N1流感病毒活性

    将对数生长期的狗肾上皮MDCK (Madin-Daby canine kidney cells)细胞使用胰蛋白酶消化, 调整细胞悬液浓度为10×104 cell·mL-1, 于96孔板中加入100 μL, 置于含有5% CO2的37 ℃培养箱中培养18 h.化合物及阳性药利巴韦林采用细胞级DMSO配制成10 mg·mL-1, 用PBS缓冲液稀释20倍, 浓度为500 μg·mL-1.将96孔板中的液体全部吸出, 已测定毒力的病毒稀释至100 TCID50 (Tissue culture infective dose, 半数组织培养感染剂量), 实验组和空白对照组加入150 μL病毒悬液, 阴性对照组加入等量不含病毒的稀释液.置于含5% CO2的37 ℃培养箱培养60 min.感染后, 将液体吸出130 μL弃去, 并补充细胞维持液160 μL, 阴性对照组和空白对照组加入PBS缓冲液20 μL, 阳性对照组和实验组分别加入利巴韦林和化合物溶液20 μL, 各组平行3个复孔, 阳性药及化合物浓度50 μg·mL-1.继续培养24 h后, 弃去孔内全部液体, 加多聚甲醛50 μL常温固定9 min, 弃去多聚甲醛, 加入50 μL结晶紫染色剂37 ℃染色25 min.用细水流冲洗孔底, 吸干水分后在酶联免疫检测仪波长570 nm处测量各孔吸光值(OD), 并计算活性率和IC50.抗H1N1病毒活性率(%)=(实验组OD570 nm－空白对照组OD570 nm)/(阴性对照组OD570 nm－空白对照组OD570 nm)×100%.

    辅助材料(Supporting Information)  化合物1的谱图数据、ECD数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  • 图 1  化合物1~12的结构

    Figure 1  Structures of compounds 1~12

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    图 2  化合物1的COSY和HMBC相关图

    Figure 2  Selected COSY and HMBC correlations of compound 1

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    图 3  基于B3LYP/6-31G(d, p)的13C NMR计算与实测分析

    Figure 3  The analysis of experimental (expt.) and calculated (calcd.) 13C NMR at the B3LYP/6-31G(d, p) level

    (a) Linear correlation plots of calcd. vs expt. δC values for cis-1 and trans-1; (b) Relative errors between calcd. and expt. δC values for cis-1 and trans-1[25]

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    图 4  化合物1a和1b的实测及计算ECD曲线

    Figure 4  Computed and measured ECD for 1a and 1b

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    表 1  化合物1的1H NMR (600 MHz)和13C NMR (150 MHz)数据(DMSO-d6)

    Table 1.  1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) data for compound 1 (DMSO-d6)

    Position δC δH (J in Hz)
    2 174.3, C
    3 41.9, CH2 2.61 (d, 17.4), 2.73 (d, 17.4)
    3a 72.9, C
    4 132.1, CH 5.89 (d, 10.2)
    5 121.3, CH 5.91 (dd, 4.7, 10.2)
    6 125.4, CH 6.08 (dd, 4.7, 9.7)
    7 123.8, CH 5.85 (dd, 3.4, 9.7)
    7a 84.8, CH 5.07 (d, 3.4)
    3a-OH 5.96 (br s)
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    表 2  cis-1和trans-1的13C NMR及其DP4分析

    Table 2.  DP4 analysis of 13C NMR for cis-1and trans-1

    Position Calcd 13C Expt. 13C Scaled shift Corrected error Probability
    trans-1 cis-1 trans-1 cis-1 trans-1 cis-1 trans-1 cis-1
    2 186.5 185.8 174.3 172.9 172.3 1.4 2.0 0.28 0.20
    3 44.8 44.8 44.7 42.8 42.9 1.9 1.8 0.22 0.22
    3a 80.5 81.5 72.9 75.6 76.6 -2.7 -3.7 0.13 0.07
    4 138.6 139.9 132.1 129.0 130.1 3.1 2.0 0.10 0.20
    5 134.7 131.2 121.3 125.3 122.2 -4.0 -0.9 0.05 0.36
    6 133.2 133.3 125.4 124.0 124.1 1.4 1.3 0.27 0.29
    7 135.6 132.9 123.8 126.2 123.7 -2.4 0.1 0.16 0.48
    7a 89.1 91.3 84.8 83.5 85.5 1.3 -0.7 0.30 0.38
    Products of probabilities 5.70×10-7 1.21×10-5
    Bayes's theorem probability/% 5 95
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    表 3  化合物1~12对A549、MCF-7、K562及L-02细胞株的IC50值

    Table 3.  IC50 and SI values of compounds 1~12 on A549, MCF-7, K562 and L-02 cell lines

    Compd IC50 (μmol·L-1)/SI
    K562 A549 MCF-7 L-02
    1 ＞50 0.47/＞106 ＞50 ＞50
    2 0.60/0.6 0.23/1.6 5.5/0.1 0.37
    3 ＞10 ＞10 ＞10 ＞10
    4 0.25/0.6 0.02/8.0 1.48/0.1 0.16
    5 0.03/3.0 0.07/1.3 0.06/1.5 0.09
    6 0.24/0.5 0.14/0.9 0.09/1.3 0.12
    7 1.03/0.2 0.06/3.7 0.20/1.1 0.22
    8 0.02/3.5 0.10/7.0 0.07/1.0 0.07
    9 0.46/0.8 ＞50 ＞50 0.39
    10 ＞50 ＞50 ＞50 ＞50
    11 1.14/＞8.8 3.36/＞3.0 4.25/＞2.3 ＞10
    12 0.88/＞56.8 ＞50 0.62/＞80.6 ＞50
    阿霉素 0.73/1.2 0.63/1.3 1.00/0.8 0.84
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  • 发布日期:  2019-02-25
  • 收稿日期:  2018-06-29
  • 修回日期:  2018-08-08
  • 网络出版日期:  2018-02-05
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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