English

• 1.   引 言

  盐酸兰地洛尔为继艾司洛尔之后的β_1-肾上腺素能受体阻断剂，具有超短效、高选择性的特点，临床应用于手术时和手术后心动过速性心律失常的紧急治疗^[1]。盐酸兰地洛尔在临床上起效快，半衰期短，不良反应较其它同类产品少，疗效可靠^[2]。盐酸兰地洛尔由日本小野药品工业株式会社在2002年开发上市，临床常用的剂型为注射剂，在国内暂未被批准上市。

  在临床上应用的有确切疗效的盐酸兰地洛尔为单一的S,S-异构体，其分子结构式如图 1所示。盐酸兰地洛尔具有两个手性中心，另有3个立体异构体(R,R-、R,S-和S,R-)。从质量控制的角度，有必要对盐酸兰地洛尔样品中的立体异构体进行研究并限量控制。盐酸兰地洛尔立体异构体检查方法尚未见公开报道，建立能够有效拆分其立体异构体的方法，对盐酸兰地洛尔原料药和制剂的质量控制均具有重要意义。

  图 1

  

  图 1  盐酸兰地洛尔及其3种立体异构分子式

  Figure 1.  Stucture of landiolol hydrochloride and its stereoisomers

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  色谱法是手性药物分析和分离中应用最广、最有效的方法，主要包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、超临界流体色谱(Supercriticalfluid chromatography,SFC)、毛细管电泳(CE)等^[3]。2012年，Waters公司推出超高效合相色谱法(Ultra performance convergence chromatography，UPC²)，结合了超临界流体色谱技术与传统超高效液相色谱的优点，以超临界流体CO₂为流动相主体，同时混合一路助溶剂，依靠流动相的溶剂化能力进行分离与分析^{[4, 5]}。UPC²对分离手性异构、位置异构、结构相似和共轭等“相似”化合物具有独特的优势，并具有操作温度低、有机溶剂使用量少、灵敏度高、重现性好、分析速度快等优点^{[6, 7]}。UPC²已经在食品检测^[8~11]、中药研究和质量控制^{[12, 13]}及化学药手性检查^[14]等方面得到广泛应用。如Rao等^[14]采用UPC²进行氟维司群(Fulvestran)非对映体分析，经方法学验证符合ICH的相关要求，且与USP中的正相HPLC方法相比，效率提高了3 倍以上。UPC²技术应用于盐酸兰地洛尔对映体分离尚未见报道。

  本研究采用UPC²测定盐酸兰地洛尔的立体异构体，在10 min 内实现了盐酸兰地洛尔及其3个立体异构体的分离。实验结果表明，本方法快速、准确、灵敏度高、重复性好、回收率较高、实用性强，满足《手性药物质量控制研究技术指导原则》(国食药监注[2006]639号)中对立体异构体检查的相关要求，为盐酸兰地洛尔原料和注射用盐酸兰地洛尔中立体异构体检测提供了一种高效的色谱检测方法。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  Waters Acquity UPC²超高效合相色谱仪(美国Waters 公司)，配有Waters EmpowerTM3 数据处理系统；MS3 basic涡旋仪(德国IKA 公司)；Gilson-PIPETMAN移液枪(200~1000 μL,20~100 μL和1~10 μL)。

  盐酸兰地洛尔对照品(纯度98.9%，批号101721-201501)，R,R-异构体对照品(纯度100%，批号101722-201501)，R,S-异构体对照品(纯度100%，批号101723-201501)，S,R-异构体对照品(纯度100%，批号101722-201501)，均由中国食品药品检定研究院提供；盐酸兰地洛尔原料(代码A、B、C，企业送检样品)；注射用盐酸兰地洛尔(规格10 mg，代码D、E、F，企业送检样品)；CO₂(99.999%，上海振兴气体有限公司)；甲醇、乙腈、异丙醇、正丁醇，乙醇(色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司)；氨水(国药试剂公司)；蒸馏水(18.2 MΩ·cm)。

  2.2.   溶液的配制

  异构体标准贮备液：分别取盐酸兰地洛尔3个异构体各约10 mg，准确称定，以甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1000 mg/L溶液，4℃下贮存待用。

  异构体标准工作液：将标准贮备液分别稀释为300,200,100,50,25,10,5.0,2.0和1.0 mg/L 的溶液，4℃下贮存待用。

  测定分离度所用溶液：取盐酸兰地洛尔约10 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL；准确量取1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加入异构体标准储备液1.0 mL，以甲醇定容，4℃下贮存待用。

  测定分离度用模拟样品溶液：准确称取盐酸兰地洛尔5 mg，加入50 mg/L异构体标准工作液1.0 mL，以甲醇溶解并定容至5 mL，4℃下贮存待用。

  2.3.   超高效合相色谱条件

  Daicel CHIRALPAK^®IF手性色谱柱(150 mm × 4.6 mm，3.0 μm，大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)，流动相A为CO₂，流动相B为甲醇-正丁醇-乙腈(1:1:1，V/V)+0.5 % 氨水；流速: 2.8 mL/min。梯度洗脱：0～4 min，90 % A；4～6 min，80%～75% A；6～9 min，75%～55% A；9～11 min，55%～50% A；11～13 min，90% A。进样量： 8 μL；柱温： 50℃；检测波长： 223 nm；动态背压(Dynamic Back Pressure): 11.72 Pa。

  2.4.   样品处理

  盐酸兰地洛尔：称取盐酸兰地洛尔样品约10 mg，置于15 mL聚乙烯管中，加入10 mL甲醇溶解，涡旋振摇5 min充分混匀，经0.22 μm滤膜过滤后，直接进样分析。

  注射用盐酸兰地洛尔：称取适量样品(约相当于盐酸兰地洛尔10 mg)，加入10 mL甲醇溶解，涡旋振荡5 min充分混匀，经0.22 μm滤膜过滤后，直接进样分析。

  3.   结果与讨论

  3.1.   色谱分离条件的优化

  本研究中，色谱条件优化的目的是使盐酸兰地洛尔与其3个立体异构体的色谱峰有效分离。实验中，以这4个立体异构体色谱峰间的分离度(Rs)：

  \begin{document} $Rs=\frac{{{t}_{2}}-{{t}_{1}}}{{{w}_{1}}/2+{{w}_{2}}/2}$ \end{document}

  其中，t₁,t₂分别为两峰的保留时间，w₁,w₂分别为两峰的峰宽。以Rs和盐酸兰地洛尔的拖尾因子(T=W_{0.05 h}/2d₁,W_{0.05 h}为5%峰高处的峰宽，d₁为峰顶点至峰前沿之间的距离)为考察指标。

  3.2.   方法学考察

  3.3.   实际样品分析

  在最佳实验条件下，对盐酸兰地洛尔原料及注射用盐酸兰地洛尔各3批样品进行了分析，采用外标法定量分析样品中3个立体异构体的含量，分析结果见表 4。可见采用本方法，样品中各异构体色谱峰均能得到较好分离。

  表 4

  

  表 4  UPC²法盐酸兰地洛尔样品3个立体异构体检查分析结果

  Table 4.  Determination result of stereoisomers content in landiolol hydrochloride samples by UPC²

  下载: 导出CSV

  样品名称Sample name	代码Code	含量 Content(%，n=3)
  		R,R-异构体R,R-Stereoisomer	R,S-异构体R,S-Stereoisomer	S,R-异构体S,R-Stereoisomer
  盐酸兰地洛尔原料Landiolol hydrochloride drug substance	A	－*	－	－
  	B	0.05	－	－
  	C	－	－	－
  注射用盐酸盐酸兰地洛尔Landiolol hydrochloride for injection	D	－	－	－
  	E	－	－	－
  	F	－	－	－
  *－表示低于检出限按“未检出”计。“－” The content is less than the limits of detection.

  研究结果表明，利用超高效合相色谱(UPC²)对盐酸兰地洛尔中3个立体异构体进行检测，前处理过程简单，分析时间短，结果可靠，提高了异构体间的有效分离和分析的准确性。本研究为盐酸兰地洛尔及其立体异构体的手性拆分和检测分析提供了技术支持，可为其它手性药物分析提供借鉴。

  3.1.2.   动态背压选择

  动态背压决定CO₂在整个系统中的超临界流体状态。随着动态背压升高，CO₂密度增加，流动相洗脱能力增强，分析物保留时间提前；当动态背压降低时，CO₂密度减少，流动相洗脱能力减弱，梯度减缓，分析物保留时间延后。如图 2所示，在其它色谱条件不变的情况下(见2.3节)，当动态背压为11.72 Pa时，各峰分离度都能达到最优。因此，盐酸兰地洛尔与异构体分离的最优动态背压选择11.72 Pa。

  图 2

  

  图 2  动态背压(ABPR)对分离效果的影响

  Figure 2.  Effect of chromatographic dynamic back pressure (ABPR) on separation capacity

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.1.4.   流速的选择

  根据Van Deemter方程，线速度与流量以及色谱柱的截面积有关，最佳流速对应最低理论塔板高度，在最佳流速范围内可以获得最高的理论塔板数(即最大柱效)。UPC²系统经过优化设计，在小粒径颗粒的填料基础上，拥有较宽的最佳流速范围。在其它色谱条件不变的情况下，考察了流速(2.0，2.5和2.8 mL/min)的影响。结果表明，各峰分离度没有明显差异，2.8 mL/min流速条件下各色谱峰出峰最快。因此本实验采用的流速为2.8 mL/min。

  3.1.1.   色谱柱及助溶剂选择

  为了使盐酸兰地洛尔及其3个立体异构体在较短时间内达到有效分离，采用6种适用于超临界流体分离的键合型色谱柱并结合4种混合助溶剂进行了初筛。用于初筛的6种键合型色谱柱均为大赛璐药物手性技术(上海)有限公司生产，规格均为150 mm×4.6 mm，3.0 μm，型号分别为Daicel CHIRALPAK^®IA、 Daicel CHIRALPAK^®IB、 Daicel CHIRALPAK^®IC、 Daicel CHIRALPAK^®ID、 Daicel CHIRALPAK^®IE和Daicel CHIRALPAK^®IF。用于初筛的4种混合助溶剂分别为：(1)甲醇-异丙醇(1:1，V/V)+0.2%氨水，(2)乙腈-异丙醇(1:1，V/V)+0.2%氨水，(3)乙腈-乙醇(1:1，V/V)+0.2%氨水，(4)乙腈-异丙醇(1:1，V/V)+0.2%氨水。结果表明，在其它色谱条件不变的情况(见2.3节)下，仅IF柱在甲醇-异丙醇(1:1，V/V)+0.2 %氨水或乙腈-乙醇(1:1，V/V)+0.2 %氨水条件下获得4个色谱峰，其余色谱柱则未能分离出4个色谱峰。因此，选择Daicel CHIRALPAK^®IF色谱柱(150 mm×4.6 mm)进行进一步的色谱条件优化。

  根据初筛实验结果，乙腈-乙醇(1:1，V/V)+0.2%氨水为助溶剂的条件下各峰分离度较好，但尚未实现完全分离。继续尝试从以下几个方面改善各峰分离度：(1)改变助溶剂乙腈-乙醇的混合比；(2)针对兰地洛尔为碱性化合物这一特性，改变添加剂胺的种类和浓度；(3)筛选更多种类助溶剂。以分离度和拖尾因子为指标比较各流动相条件的优劣，发现采用甲醇-乙腈-正丁醇(1:1:1，V/V)+0.5%氨水为助溶剂时能够获得最好分离分析效果，如表 1所示。并以这一新的助溶剂条件筛查了其余5根色谱柱(IA-IE)，结果表明，IF柱条件下各峰的分离结果仍为最优。因此选择Daicel CHIRALPAK^®IF色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.0 μm)进行盐酸兰地洛尔立体异构体的分离分析研究。

  表 1

  

  表 1  助溶剂筛选结果

  Table 1.  Result of solvent selection

  下载: 导出CSV

  	乙腈-乙醇Acetonitrile-Ethanol(3:2,V/V)+0.2%氨水Ammonia	乙醇-异丙醇Ethanol-Isopropanol(2:3,V/V)+0.2%氨水Ammonia	乙醇-乙腈Ethanol--Acetonitrile(1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia	乙醇-乙腈Ethanol--Acetonitrile(1:1,V/V)+0.5%二异丙基乙基胺Diisopropylamine	甲醇-正丁醇Methanol-n-Butanol(1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia	乙醇-正丁醇Ethanol-n-Butanol(1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia	甲醇-正丁醇-乙腈Methanol-n-Butanol-Acetonitrile(1:1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia
  Rs1	1.52	1.75	1.72	－	1.50	0.95	1.60
  Rs2	1.05	1.06	1.07	－	1.32	1.00	1.56
  Rs3	1.61	1.70	1.72	－	1.52	1.15	2.37
  T	－	1.65	－	1.32	1.28	－	1.32
  注：Rs1,Rs2,Rs3分别为盐酸兰地洛尔与R,S-异构体，R，S-异构体与S，R-异构体，S，R-异构体与R，R-异构体的峰的分离度，T为兰地洛尔拖尾因子(“－”表示系统未给出)。 Note: Rs1,Rs2,Rs3 is the resolution between the peak with landiolol hydrochloride and R,S-stereoisomer,R,S-stereoisomer and S,R-stereoisomer,S,R-stereoisomer and R,R-stereoisomer,respectively. T is the tailing factor with landiolol hydrochloride (The symbol “－” indicates “no result”).

  3.1.3.   柱温的选择

  柱温能够改变CO₂密度，进而改变整个流动相洗脱能力，因此对于手性化合物分离有着极大的影响。在其它色谱条件不变的情况下(同2.3节)，比较了30℃，40℃和50℃条件下色谱峰分离情况。如图 3所示，低温会使R,S-异构体与S,R-异构体峰的分离度变差。为了实现各异构体之间更好的分离，柱温选择50℃。

  图 3

  

  图 3  柱温对分离效果的影响

  Figure 3.  Effect of chromatographic column temperature on separation capacity

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.2.2.   样品加标回收率和精密度

  在未检出各立体异构体的注射用盐酸兰地洛尔样品D溶液(约1000 mg/L)中添加浓度分别为5，10和25 mg/L的异构体标准工作液(分别约相当于主成分的0.5%，1.0%和2.5%)，每个浓度制备3份加标样品，涡旋混合，放置20 min，以测定的浓度值计算加标回收率。取其中一份约相当于主成分1.0%浓度的样品重复测定6次，以获得3个立体异构体的进样精密度。各立体异构体的加标回收率(n=9)分别为103.4%±2.5%(R,R-异构体)，91.8%±2.5%(R,S-异构体)和101.7%±1.5%(S,R-异构体)。各立体异构体的进样精密度(n=6)分别为0.06%(R,R-异构体)，0.09%(R,S-异构体)和0.08%(S,R-异构体)。实验结果表明，本方法具有良好的精密度和重现性，能够满足立体异构体检查的相关要求。

  3.2.1.   线性范围和检出限

  在优化条件下，采用异构体标准工作溶液分别对盐酸兰地洛尔3个立体异构体进行分析，绘制样品浓度(X，mg/L)与峰面积(Y)标准曲线，进行线性回归分析。盐酸兰地洛尔3个立体异构体的检出限(LOD，S/N=3)和线性范围如表 3所示。

  表 3

  

  表 3  线性范围及检出限

  Table 3.  Linear range and limit of detection

  下载: 导出CSV

  样品Sample	回归方程Regression equation	相关系数Correlation coefficient(R2)	线性范围Linear range(mg/L)	检出限Limits of detection(mg/L)
  R，R-异构体 R,R-Stereoisomer	Y=2.8×103X－4.1×102	0.9998	2～300	0.3
  R，S-异构体 R,S-Stereoisomer	Y=2.6×103X－7.9×103	0.9997	5～300	0.4
  S，R-异构体 S,R-Stereoisomer	Y=2.5×103X－4.7×102	1.0	2～300	0.3

• 1. [1]

     ZHANG Qian, FENG Ming-Sheng, CAO Yu-Ping, YAO Qi-Zheng. Guide of China Medicine, 2012, 10(9): 7-9张倩, 冯明声, 曹于平, 姚其正. 中国医药指南, 2012, 10(9): 7-9

  2. [2]

     LI Mei, SUN Zheng, ZHUANG Ru-Lin, MA Teng-Fei, GU Shu-Ling, MA Xing, DAI Ti-Jun. Chin. J. Clin. Pharmacol., 2015, 31(8): 640-644李梅, 孙政, 庄儒麟, 马腾飞, 谷淑玲, 马行, 戴体俊. 中国临床药理学杂志, 2015, 31(8): 640-644

  3. [3]

     LU Ding-Qiang, LI Yan-Liang, LING Xiu-Quan, TU Qing-Bo, CHEN Jia. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2009, 20(7): 1731-1734卢定强, 李衍亮, 凌岫泉, 涂清波, 陈佳. 时珍国医国药, 2009, 20(7): 1731-1734

  4. [4]

     XU Yong-Wei, SUN Qing-Long, HUANG Jing, TAN Xiao-Jie. Modern Instruments, 2012, 18(5): 45-48徐永威, 孙庆龙, 黄静, 谭晓杰. 现代仪器, 2012, 18(5): 45-48

  5. [5]

     LI Zhong-Hao, WU Shuai-Bin, LIU Shan-Shan, FAN Zi-Yan, YANG Fei, BIAN Zhao-Yang, TANG Gang-Ling, CHEN Zai-Gen, HU Qing-Yuan. Chinese J. Anal. Chem., 2013, 41(12): 1817-1824李中皓, 吴帅宾, 刘珊珊, 范子彦, 杨飞, 边照阳, 唐纲岭, 陈再根, 胡清源. 分析化学, 2013, 41(12): 1817-1824

  6. [6]

     Gourmel C, Grand-Guillaume Perrenoud A, Waller L, Reqinato E, Verne J, Dulery B, Veuthey J L, Rudaz S, Schappler J, Guillarme D. J. Chromatogr. A, 2013, 1282: 172-177

  7. [7]

     Grand-Guillaume Perrenoud A, Veuthey J L, Guillarme D. J. Chromatogr. A, 2012, 1266: 158-167

  8. [8]

     Grand-Guillaume Perrenoud A, Boccard J, Veuthey J L. J. Chromatogr. A, 2012, 1262: 205-213

  9. [9]

     Gong X, Qi N L, Wang X X,Li J H, Lin L J. Food Anal Method, 2014, 7: 1572-1576

  10. [10]

      ZHOU Wei, WANG Bo, LIU Qian-Qian, YANG Sheng-Xin, WANG Li-Ting. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(1): 115-120周围, 王波, 刘倩倩, 杨盛鑫, 王丽婷. 分析化学, 2015, 43(1): 115-120

  11. [11]

      ZHU Rui-Juan, WANG Bo, HU Fang, LI Can, LIU Xiao-Ya, FENG Shi-Lan, ZHOU Wei. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(2): 288-293朱瑞娟, 王波, 胡芳, 李灿, 柳小亚, 封士兰, 周围. 分析化学, 2015, 43(2): 288-293

  12. [12]

      Chen R, Runco J, McCauley J. J. Sep. Sci., 2013, 5(6): 2-5

  13. [13]

      XU Yong-Wei, HUANG Jing, SUN Qing-Long, TAN Xiao-Jie, Kate Yu. World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, 2014, 16(3): 543-548徐永威, 黄静, 孙庆龙, 潭晓杰, Kate Yu. 世界科学技术-中医药现代化, 2014, 16(3): 543-548

  14. [14]

      Rao G V N, Gnanadev G, Bellam R, Dhananjaya D, Manoj P, Indu B, Venkata Nadh R. Anal. Methods, 2013, 18(5): 4832-4837

• 

  Figure 1  Stucture of landiolol hydrochloride and its stereoisomers

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 2  Effect of chromatographic dynamic back pressure (ABPR) on separation capacity

  1. S，S-异构体； 2. R，S-异构体； 3. S，R-异构体； 4. R，R-异构体

  1. S,S-stereoisomer； 2. R,S-stereoisomer； 3. S,R-stereoisomer； 4. R,R-stereoisomer

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 3  Effect of chromatographic column temperature on separation capacity

  1. S，S-异构体； 2. R，S-异构体； 3. S，R-异构体； 4. R，R-异构体

  1. S,S-stereoisomer； 2. R,S-stereoisomer； 3. S,R-stereoisomer； 4. R,R-stereoisomer

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  Table 1.  Result of solvent selection

  	乙腈-乙醇Acetonitrile-Ethanol(3:2,V/V)+0.2%氨水Ammonia	乙醇-异丙醇Ethanol-Isopropanol(2:3,V/V)+0.2%氨水Ammonia	乙醇-乙腈Ethanol--Acetonitrile(1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia	乙醇-乙腈Ethanol--Acetonitrile(1:1,V/V)+0.5%二异丙基乙基胺Diisopropylamine	甲醇-正丁醇Methanol-n-Butanol(1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia	乙醇-正丁醇Ethanol-n-Butanol(1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia	甲醇-正丁醇-乙腈Methanol-n-Butanol-Acetonitrile(1:1:1,V/V)+0.5%氨水Ammonia
  Rs1	1.52	1.75	1.72	－	1.50	0.95	1.60
  Rs2	1.05	1.06	1.07	－	1.32	1.00	1.56
  Rs3	1.61	1.70	1.72	－	1.52	1.15	2.37
  T	－	1.65	－	1.32	1.28	－	1.32
  注：Rs1,Rs2,Rs3分别为盐酸兰地洛尔与R,S-异构体，R，S-异构体与S，R-异构体，S，R-异构体与R，R-异构体的峰的分离度，T为兰地洛尔拖尾因子(“－”表示系统未给出)。 Note: Rs1,Rs2,Rs3 is the resolution between the peak with landiolol hydrochloride and R,S-stereoisomer,R,S-stereoisomer and S,R-stereoisomer,S,R-stereoisomer and R,R-stereoisomer,respectively. T is the tailing factor with landiolol hydrochloride (The symbol “－” indicates “no result”).

  下载: 导出CSV

  Table 3.  Linear range and limit of detection

  样品Sample	回归方程Regression equation	相关系数Correlation coefficient(R2)	线性范围Linear range(mg/L)	检出限Limits of detection(mg/L)
  R，R-异构体 R,R-Stereoisomer	Y=2.8×103X－4.1×102	0.9998	2～300	0.3
  R，S-异构体 R,S-Stereoisomer	Y=2.6×103X－7.9×103	0.9997	5～300	0.4
  S，R-异构体 S,R-Stereoisomer	Y=2.5×103X－4.7×102	1.0	2～300	0.3

  下载: 导出CSV

  Table 4.  Determination result of stereoisomers content in landiolol hydrochloride samples by UPC²

  样品名称Sample name	代码Code	含量 Content(%，n=3)
  		R,R-异构体R,R-Stereoisomer	R,S-异构体R,S-Stereoisomer	S,R-异构体S,R-Stereoisomer
  盐酸兰地洛尔原料Landiolol hydrochloride drug substance	A	－*	－	－
  	B	0.05	－	－
  	C	－	－	－
  注射用盐酸盐酸兰地洛尔Landiolol hydrochloride for injection	D	－	－	－
  	E	－	－	－
  	F	－	－	－
  *－表示低于检出限按“未检出”计。“－” The content is less than the limits of detection.

  下载: 导出CSV
•