多巴胺(DA)是一种重要的神经递质,广泛分布于肾脏、心血管和中枢神经系统中,其浓度异常会导致亨廷顿疾病、迟发性运动障碍及精神性疾病等[1]。多巴胺和亚硝酸根(NO2-)通常共存于生物体内,NO2-易生成强致癌性的亚硝胺类物质,同时血液中NO2-过多会导致高铁血红蛋白血症[2]。因此,定量检测人体体液中DA和NO2-对相关疾病诊断和药物开发具有重要意义。
近年来,电化学方法由于简便、灵敏、快速、成本低等特点,在生物小分子检测方面已引起广泛关注[3]。然而,DA和NO2-在裸电极上的过电位较高,且其氧化产物会污染电极表面,导致较差的选择性和灵敏性[4]。为此,可将复合纳米材料应用于电极修饰,如采用Fe3O4磁性纳米棒/还原型氧化石墨烯(rGO)超灵敏检测DA[5],利用Co3O4/rGO实现NO2-的痕量测定[6]。目前,复合材料修饰电极用于DA和NO2-等的同时测定也有一些报道,如聚巯基苯并噻唑[7]、CTAB功能化氧化石墨烯(GO)/多壁碳纳米管(MWCNTs)[8]、碳纳米管(CNTs)/La(OH)3纳米棒[9]、铁卟啉功能化MWCNTs[10]、3-氨基-5-巯基-1,2,4-苯三唑包裹的金纳米簇[11]、羧基化GO/镧[12]、石墨烯-壳聚糖／金纳米粒子[13]等,但所测组分越多,相互之间的峰电位差就越小,这就意味着多组分同时测定的分离效果不佳。因此,寻找新型复合材料是实现DA、NO2-等多组分同时测定的研究趋势。
作为聚阳离子,聚二烯二甲基氯化铵(PDDA) 是一种水溶性、带正电荷的高分子导电聚合物[14],其功能化的金属纳米颗粒不易团聚,具有良好的电化学活性[15]。而通过PDDA功能化的立方体银纳米材料用于DA、NO2-同时测定却少有报道。基于此,本研究制备了形状规整的立方体银纳米颗粒(C-AgNPs),形成C-AgNPs-PDDA/GO复合膜,用于体液中DA和NO2-的同时测定,峰电位差大,分离效果好,具有实际应用价值。
电化学工作站(CHI-760B,上海辰华仪器有限公司); 常规三电极系统:表面修饰的玻碳电极(GCE)为工作电极,铂丝为对电极,Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极作为参比电极; 扫描电子显微镜(JSM-6700,日本电子株式会社)。
氧化石墨烯(GO,南京吉仓纳米科技有限公司); 聚二烯二甲基氯化铵(PDDA,上海阿拉丁公司); 多巴胺(DA,Sigma公司); NaNO2、AgNO3、乙二醇、抗坏血酸、尿酸、K3Fe(CN)6、K4Fe(CN)6、KI、ZnSO4、Al(NO3)3、醋酸镁、甘氨酸、亮氨酸、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-丙氨酸(上海国药集团化学试剂有限公司); 人体血清样品由中南大学湘雅附一医院(长沙)提供; 0.10 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS),采用0.10 mol/L HCl调节pH值。所用试剂均为分析纯,实验用水均为超纯水(电阻率≥18.3 MΩ·cm)
如图 1所示,以聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)作还原剂和保护剂,配制5%(V/V)PDDA溶液。将10 mL AgNO3溶液(20 mmol/L)与10 mL乙二醇溶液超声混合,于120℃下搅拌10 min,缓慢加入5% PDDA溶液,溶液由乳白色变为灰色,再持续回流16 h,制得PDDA功能化的银纳米颗粒(AgNPs-PDDA)。
l mg氧化石墨烯(GO)加人l mL超纯水,超声2 h使GO分散均匀。再取5mL已制好的AgNPs-PDDA与5 mL GO超声混合,静置一段时间后重结晶得到立方体形状规整的PDDA功能化银纳米/氧化石墨烯(C-AgNPs-PDDA/GO)复合材料。
将玻碳电极(GCE)分别用0.1,0.3和0.05 μm的α-Al2O3粉抛光成镜面,再依次用超纯水、乙醇和超纯水分别超声清洗。取5 μL C-AgNPs-PDDA/GO分散液滴涂在GCE表面,晾干后于4℃保存备用。
通过SEM对GO/GCE,AgNPs-PDDA/GCE,C-AgNPs-PDDA/GO/GCE的表面形貌进行表征知,单层片状GO呈褶皱状,较好地附着在电极表面(图 2A); 无GO时,PDDA聚阳离子功能化的银纳米粒子(AgNPs-PDDA)的直径较小(直径约336 nm),呈颗粒块状,粒子在电极表面分散的比较均匀(图 2B); 而加入GO后,颗粒块状的银纳米转变为有规整形状的立方体结构(边长约519 nm),且GO很好地包裹在立方体银纳米周围(图 2C),这是由于GO的加入使得AgNPs-PDDA纳米颗粒发生重结晶,形貌发生改变,在GO表面结晶成立方体。图 2D是C-AgNPs-PDDA/GO放大倍数的SEM图,可以明显地看出GO包裹在立方体表面。
采用循环伏安法(CV)考察了GCE (a)、GO/GCE (b),AgNPs-PDDA/GCE (c),C-AgNPs-PDDA/GO/GCE (d)在含0.10 mol/L KCl的1.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的伏安特性,发现[Fe(CN)6]3-/4-将针分子在电极表面呈现一对可逆的氧化还原峰,且氧化峰电流依次增大,表明GO、AgNPs-PDDA成功修饰到电极表面,提高了电极表面与溶液之间的电子传递速率,且加入GO后形成的PDDA功能化立方体纳米银有效增加了电极导电性。
采用CV考察了5.0×10-5 mol/L DA和2.0×10-4 mol/L NO2-在不同修饰电极上的电化学行为(图 3)。由图 3可见,GCE(曲线a)对多巴胺和NO2-基本没有响应,而GO/GCE(曲线b)对DA (Epa=0.45 V)的响应较小,但对NO2-(Epa=0.94 V)有较大响应,且均为不可逆氧化还原过程,说明DA和NO2-在GO/GCE电极表面的电子传递速率较慢。AgNPs-PDDA/GCE(曲线c)对DA(Epa=0.47 V)和NO2-(Epa=0.98 V)氧化峰电流分别为1.341和6.353 μA,分别比GO/GCE增大1.82倍和1.52倍,且二者氧化峰电位都发生了明显移动,表明AgNPs-PDDA/GCE对DA和NO2-有较好的电催化氧化能力。与GO/GCE、AgNPs-PDDA/GCE相比,C-AgNPs-PDDA/GO/GCE(曲线d) 检测DA(Epa=0.49 V)的峰电流为1.511 μA,峰电流分别增大2.18倍和1.13倍; 而检测NO2-(Epa=1.01 V)的峰电流为7.390 μA,峰电流分别增大1.89倍和1.16倍,说明C-AgNPs-PDDA/GO复合膜有良好的导电性及有效的催化活性,能很好地促进DA和NO2-氧化,且二者氧化峰间距很大,能很好地实现DA和NO2-的同时检测。
考察了不同pH值对C-AgNPs-PDDA/GO/GCE检测DA和NO2-催化氧化活性的影响。当pH=6.0时,DA的峰电流最大; 当pH > 6.0或pH＜6.0时,DA的峰电流都有所下降。而NO2-在pH值4.5~5.5范围内,峰电流随pH值的增加而增大,当pH=5.5~6.5时,峰电流缓慢减小。综合考虑,选择检测DA和NO2-的最佳pH=6.0。
同时,DA和NO2-的氧化峰电位也随pH值的增大而变小,其线性方程分别为: Epa(V)=0.539-0.05029pH (r＝0.9933)、Epa(V)=1.489-0.07706pH (r＝0.9904)。根据Ep=E0-0.059(m/n)pH,其中,m、n分别为电极反应过程中转移的质子数和电子数。计算知,二者均存在m≈n,说明DA和NO2-在C-AgNPs-PDDA/GO/GCE上的氧化过程是一个等电子等质子的反应过程。
在20~180 mV/s范围内,DA和NO2-在电极上的氧化峰电流都随扫速的增大而增大。DA氧化峰电流与扫速成线性关系,方程为Ipa(μA)=0.6740+0.00947v(mV/s),r＝0.9970,揭示了DA在电极表面的氧化过程是吸附-解吸过程。而NO2-氧化峰电流与扫速的平方根呈线性关系,方程为Ipa(μA)=2.019+0.5075v1/2(mV/s),r＝0.9973,揭示了NO2-在电极表面的氧化过程是扩散控制过程。本实验选择80 mV/s为最佳扫速。
在优化条件下,采用差分脉冲伏安法(DPV)检测不同浓度的DA和NO2- (图 4),同时响应50.0 μmol/L DA和80.0 μmol/L NO2-的氧化峰电位分别为0.27和1.11 V,峰分离电位差(ΔE)达到0.84 V(图 4B),远大于文献报道值[7~12] (表 1),说明此修饰电极对这两种物质有很好的分离效果,可进行同时测定。
保持NO2-浓度为200 μmol/L,DA的DPV氧化峰电流随浓度的增加而增大(图 4A),其峰电流与浓度在0.030~ 0.300 μmol/L和0.300~300 μmol/L呈良好的线性关系(图 4A内插图),其线性方程分别为I(μA)=0.7752+0.08608lgc (μmol/L)、I(μA)=5.124+ 0.7665lgc (μmol/L),相关系数r分别为0.9935和0.9957,检测下限达到9.8 nmol/L (S/N=3)。
固定DA浓度为50.0 μmol/L,NO2-的DPV氧化峰电流随浓度的增加而增大(图 4B),其峰电流与浓度在30.0~2300 μmol/L范围内呈线性关系(图 4B内插图),其线性方程为I(μA) =6.166+1.311lgc (μmol/L),r＝0.9941,检测下限达到12.6 μmol/L (S/N=3)。此外,将制备的修饰电极与其它修饰电极[7~12]进行比较(表 1)发现,制备的电极对DA的检测有优越的线性范围和检测下限。
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| 电极Electrode | DA-NO2-峰电位差Peak separation for DA and NO2- (V) | 线性范围 Linear range (μmol/L)DA | 检测下限 Detection limit (μmol/L)DA | 文献Ref. | |||
| NO2- | NO2- | ||||||
| PMBT/GCE | 0.58 a | 0.8~45 | 60~1000 | 0.05 | 0.30 | [7] | |
| CTAB-GO/GCE | 0.56 a | 5.0~500 | 5.0~800 | 1.5 | 1.5 | [8] | |
| La(OH)3NRs/CNT/GCE | 0.53 b | 0.05~35.4 | 0.55~720 | 0.016 | 0.18 | [9] | |
| Fe(Ⅲ)P/MWCNT/GCE | 0.36 b | 0.7~3600 | 1.0~600 600~1600 | 0.09 | 0.50 | [10] | |
| Nano-Au/p-TA/GCE | 0.44 a | 0.6~340 | 15.9~277 | 0.05 | 0.89 | [11] | |
| GO-COOLa/GCE | 0.72 a | 0.01~196 196~1230 | 1.0~2750 | 0.018 | 0.070 | [13] | |
| C-AgNPS-PDDA/GO/GCE | 0.84 a | 0.03~0.300 0.30~300 | 30~2300 | 0.0098 | 13 | 本方法 This work | |
| 注:a 差分脉冲伏安法; b 循环伏安法. CNT: 碳纳米管; CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵; FeP: 铁卟啉; GCE: 玻碳电极; GO: 氧化石墨烯; GO-COOLa: 羧基化氧化石墨烯/镧; MWCNT: 多壁碳纳米管; Nano-Au: 纳米金; NRs:纳米棒; p-TA: 3-氨基-5-巯基-1,2,4-苯三唑; PMBT: 聚2-巯基苯并噻唑。 Note:a Differential pulse voltammetry; b Cyclic voltammetry. CNT: Carbon nanotubes; CTAB: hexadecyltrimethylammonium bromide; FeP: Iron porphyrins; GCE: glassy carbon electrode; GO: graphene oxide; GO-COOLa: carboxylated graphene oxide/lanthanum; MWCNT: multi-walled carbon nanotubes; Nano-Au: Au-nanoclusters; NRs: nanorods; p-TA: poly(3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole); PMBT: Poly (2-mercaptobenzothiazole). | |||||||
在优化条件下,考察了一些常见物质对DA和NO2-测定的影响,当DA为5.0 μmol/L时,500 μmol/L 的L-精氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、甘氨酸对测定无影响,200μmol/L L-半胱氨酸、300 μmol/L抗坏血酸、400 μmol/L尿酸对测定无影响(信号改变量在±5%以内); 当NO2-为20.0 μmol/L时,500 μmol/L的碘化钾、醋酸镁、硝酸铝、硫酸锌、尿酸以及300 μmol/L抗坏血酸对测定基本上不干扰(信号改变量在±10%以内)。说明该电极的选择性好,可用于实际样品中DA和NO2-的直接测定。
相同条件下,采用同一批次制备的7支修饰电极检测混合样品1(含3.00 μmol/L DA、50.0 μmol/L NO2-)中DA和NO2-的相对标准偏差(RSD)分别为1.5%和3.5%,检测混合样品2(含50.0 μmol/L DA、200.0 μmol/L NO2-)中DA和NO2-的RSD分别为4.0%和5.7%,表明此电极具有良好的重现性。而同一支修饰电极在上述溶液中反复测定7次后,测定混合样品1中DA和NO2-的RSD分别为1.3%和3.0%,检测混合样品2中DA和NO2-的RSD分别为2.7%和4.0%,表明此电极对DA和NO2-的检测具有良好的重复性。
将制备好的修饰电极每隔一天对8.0 μmol/L DA和200.0 μmol/L NO2-进行一次检测,连续使用27天后,电流响应分别是初始电流响应的94%和92%,31天后分别为初始电流响应的87%和83%,说明此电极可重复使用一个月左右,具有较好的稳定性。
采用此修饰电极对人体血清样品中多巴胺和NO2-含量进行测定。用灭菌的PBS(0.10 mol/L,pH 6.0)将血清样品稀释10倍,采用标准加入法对DA和NO2-进行检测,与分光光度法[16, 17]进行比较,二者数据列于表 2。由表 2可知,修饰电极与分光光度法的测定结果一致,此电极检测DA和NO2-的回收率分别为97.4%~104.2%和 98.0%~102.8%,能基本满足临床测定要求。
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| 样品Sample | 初始值Initial value(μmol/L) | 加入量Added(μmol/L) | 光度法检出值Found by spectro- photometry (μmol/L) | 电极法检出值Found by electrode (μmol/L) | 相对偏差Relative deviation (%)DA | 回收率Recovery(%) | |||||||||||
| DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | ||||||
| 血清 Serum 1 | - | - | 2.00 | 40.0 | 1.98 | 40.1 | 2.04 | 40.7 | 2.8 | 1.4 | 101.8 | 101.8 | |||||
| 血清 Serum 2 | - | - | 4.00 | 60.0 | 4.00 | 60.2 | 4.17 | 61.6 | 4.3 | 2.4 | 104.2 | 102.8 | |||||
| 血清 Serum 3 | - | - | 6.00 | 100 | 6.05 | 99.96 | 6.02 | 100.2 | 0.5 | 0.3 | 100.4 | 100.2 | |||||
| 血清 Serum 4 | - | - | 20.0 | 400 | 20.1 | 399.5 | 19.95 | 392 | 0.9 | 1.9 | 99.8 | 98.0 | |||||
| 血清 Serum 5 | - | - | 60.0 | 600 | 60.2 | 600.2 | 58.5 | 596 | 2.9 | 0.7 | 97.4 | 99.3 | |||||
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Figure 1 Schematic diagram for construction of poly(dienedimethylammonium chloride) (PDDA) functionalized cubic silver nanoparticles (C-AgNPs)/graphene oxide (GO)/glassy carbon electrode (GCE)[C-AgNPs-PDDA/GO/GCE]
Figure 2 SEM images of the electrode surfaces of (A) GO/GCE,(B) AgNPs-PDDA/GCE,(C) C-AgNPs-PDDA/GO/GCE,and (D) Magnification of the C-AgNPs-PDDA/GO/GCE
Figure 3 CV curves of (a) bare GCE,(b) GO/GCE,(c) AgNPs-PDDA/GCE ,(d) C-AgNPs-PDDA/GO/GCE in PBS (0.1 mol/L,pH=6.0) containing 5.0×10-5 mol/L of dopamine (DA) and 2.0×10-4 mol/L nitrite. Scan rate=80 mV/s.
Figure 4 DPV curves of C-AgNPs-PDDA/GO/GCE responding to different concentrations of DA (A) and NO2-(B),and corresponding linear plots (inert) of response current vs. logarithmic concentration.
Table 1. Comparison of performance with different modified electrodes
| 电极Electrode | DA-NO2-峰电位差Peak separation for DA and NO2- (V) | 线性范围 Linear range (μmol/L)DA | 检测下限 Detection limit (μmol/L)DA | 文献Ref. | |||
| NO2- | NO2- | ||||||
| PMBT/GCE | 0.58 a | 0.8~45 | 60~1000 | 0.05 | 0.30 | [7] | |
| CTAB-GO/GCE | 0.56 a | 5.0~500 | 5.0~800 | 1.5 | 1.5 | [8] | |
| La(OH)3NRs/CNT/GCE | 0.53 b | 0.05~35.4 | 0.55~720 | 0.016 | 0.18 | [9] | |
| Fe(Ⅲ)P/MWCNT/GCE | 0.36 b | 0.7~3600 | 1.0~600 600~1600 | 0.09 | 0.50 | [10] | |
| Nano-Au/p-TA/GCE | 0.44 a | 0.6~340 | 15.9~277 | 0.05 | 0.89 | [11] | |
| GO-COOLa/GCE | 0.72 a | 0.01~196 196~1230 | 1.0~2750 | 0.018 | 0.070 | [13] | |
| C-AgNPS-PDDA/GO/GCE | 0.84 a | 0.03~0.300 0.30~300 | 30~2300 | 0.0098 | 13 | 本方法 This work | |
| 注:a 差分脉冲伏安法; b 循环伏安法. CNT: 碳纳米管; CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵; FeP: 铁卟啉; GCE: 玻碳电极; GO: 氧化石墨烯; GO-COOLa: 羧基化氧化石墨烯/镧; MWCNT: 多壁碳纳米管; Nano-Au: 纳米金; NRs:纳米棒; p-TA: 3-氨基-5-巯基-1,2,4-苯三唑; PMBT: 聚2-巯基苯并噻唑。 Note:a Differential pulse voltammetry; b Cyclic voltammetry. CNT: Carbon nanotubes; CTAB: hexadecyltrimethylammonium bromide; FeP: Iron porphyrins; GCE: glassy carbon electrode; GO: graphene oxide; GO-COOLa: carboxylated graphene oxide/lanthanum; MWCNT: multi-walled carbon nanotubes; Nano-Au: Au-nanoclusters; NRs: nanorods; p-TA: poly(3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole); PMBT: Poly (2-mercaptobenzothiazole). | |||||||
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Table 2. Determination result of dopamine and nitrite in human serum samples (n=6)
| 样品Sample | 初始值Initial value(μmol/L) | 加入量Added(μmol/L) | 光度法检出值Found by spectro- photometry (μmol/L) | 电极法检出值Found by electrode (μmol/L) | 相对偏差Relative deviation (%)DA | 回收率Recovery(%) | |||||||||||
| DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | DA | NO2- | ||||||
| 血清 Serum 1 | - | - | 2.00 | 40.0 | 1.98 | 40.1 | 2.04 | 40.7 | 2.8 | 1.4 | 101.8 | 101.8 | |||||
| 血清 Serum 2 | - | - | 4.00 | 60.0 | 4.00 | 60.2 | 4.17 | 61.6 | 4.3 | 2.4 | 104.2 | 102.8 | |||||
| 血清 Serum 3 | - | - | 6.00 | 100 | 6.05 | 99.96 | 6.02 | 100.2 | 0.5 | 0.3 | 100.4 | 100.2 | |||||
| 血清 Serum 4 | - | - | 20.0 | 400 | 20.1 | 399.5 | 19.95 | 392 | 0.9 | 1.9 | 99.8 | 98.0 | |||||
| 血清 Serum 5 | - | - | 60.0 | 600 | 60.2 | 600.2 | 58.5 | 596 | 2.9 | 0.7 | 97.4 | 99.3 | |||||
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