English

• 1.   引 言

  合成分子印迹聚合物(MIP)的单体与模板之间存在相互作用，在聚合过程中，通过相互作用的协调与积累，最终在聚合物中形成了识别模板分子的空腔(或位点)。目前，已经被应用于许多领域^[1~3]。

  蛋白质作为生物遗传信息的翻译产物，在生命过程中行使着许多重要功能。蛋白质印迹一直是MIP研究的重点，在分子识别、固相萃取、疾病诊断/治疗、蛋白质组学研究、环境分析等方面具有重要意义^[3~10]。为了适应复杂多样的生物学功能，蛋白质分子的构象和外形会发生一定程度的改变。由于蛋白质分子具有相当的“柔性”，因此刚性聚合物不是蛋白质印迹的首选材料。另外聚合物的高交联度结构会导致模板分子难以去除^[11~14]，蛋白质印迹通常局限于纳米材料^{[15, 16]}或者表面印迹聚合物^[17~20]。

  冰胶(Cryogel)是一类(超)大孔材料，其合成方法之一是冰冻聚合，为了强调冰晶的膨胀、压缩作用，因此被称为冰胶^[21]。疏松、大孔结构使得材料内部传质阻力变得很小。冰胶中的印迹类似于表面或者纳米颗粒印迹，能够提高分子传质效率，有助于模板的洗脱^[22~26]。聚丙烯酰胺材料生物相容性好，适于处理蛋白质类生物大分子，在生命分析中应用广泛。除了通常使用的丙烯酰胺及其衍生物，其它单体如乙烯醇和甲基丙烯酸羟乙酯也被用于制备不同的分子印迹聚合物。

  将丙烯酸、烯丙基胺类单体引入，与丙烯酰胺类单体共聚，得到酸、碱性基团共同修饰的聚丙烯酰胺冰胶，这类材料与蛋白质分子一样，属于聚合两性电解质。本研究组曾使用复杂样品而非标准蛋白质作为“待定模板”，合成了基于两性聚丙烯酰胺的分子印迹聚合物，具有识别鸡蛋清中高峰度蛋白质的特异性吸附位点^[27]。通过自制的低压色谱系统，印迹聚合物能够有效脱除鸡蛋清中的部分高峰度蛋白质，包括卵清蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白^[28]。为了更好地理解两性聚丙烯酰胺冰胶材料，为进一步的研究提供有价值的信息，本研究考察了两性冰胶对不同蛋白质分子的印迹效应。制备了不同标准蛋白质分子印迹的毛细管色谱柱，用以考察模板分子的不同保留行为。实验结果表明，虽然所选蛋白质具有不同的分子量和等电点，但是冰胶材料对它们均显示出良好的印迹效果及特异性识别能力。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  TriSep-2100毛细管电色谱仪(上海通微分析技术有限公司)；S-4800扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)；Tensor27红外光谱仪(德国Bruker公司); FE20-K型pH计(Mettler Toledo公司); 毛细管(内径100 μm，外径360 μm，河北省永年锐沣色谱器件有限公司)。

  溶菌酶(来自鸡蛋清，北京Biotopped公司)；卵清蛋白(Sigma公司)；γ-球蛋白(来自牛血清，北京Solarbio公司)；胃蛋白酶(来自猪胃粘膜，国药集团上海试剂公司)；牛血红蛋白(上海鼎国生物技术有限公司)；丙烯酸、烯丙基胺、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS，98%)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)、丙烯酰胺(山东济南浩鹏化工厂)；十二烷基硫酸钠(SDS)和过硫酸铵(APS)、亚硫酸氢钠(国药集团上海试剂公司)；其它试剂均为分析纯。

  2.2.   实验方法

  2.2.4.   毛细管电色谱

  在电色谱实验中，毛细管柱长度均为10 cm，通过特氟隆管与毛细管空柱相连，总长45 cm(进样端至检测器25 cm)。蛋白质(浓度均为5 mg/mL)溶于10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，加入0.2 mg/mL硫脲作为标记物。缓冲溶液为10 mmol/L磷酸盐溶液(pH 8.0，含4 mmol/L SDS)。进样条件：12 kV/20 s。运行电压：12 kV。检测波长：280 nm。

  2.2.3.   聚合物的滴定

  取2 g干燥印迹聚合物(MIP-2，模板为胃蛋白酶),在10 mL NaOH(1 mol/L)中浸5 min，用蒸馏水充分洗净。置于10 mL 去离子水中，搅拌下以10 mmol/L HCl进行滴定。为确保质子与聚合物之间的充分反应，滴定过程必须缓慢进行，每加2~3滴HCl，聚合物应充分搅拌约1 min，待稳定后再记录pH值。

  2.2.1.   毛细管预处理

  一段长约3 m的空毛细管用1.0 mol/L H₂SO₄、去离子水、1.0 mol/L NaOH和甲醇依次冲洗20 min，然后在气相色谱仪中通氮气120℃恒温干燥3 h。向洗净的毛细管中加入γ-MAPS溶液(30%(V/V)甲醇溶液),并且两端用硅胶塞密封，80℃水解。大约24 h后,用甲醇冲洗掉未反应的γ-MAPS，毛细管在4 ℃保存备用。

  2.2.2.   两性聚丙烯酰胺冰胶的合成及毛细管柱的制备

  在40 mL 10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入1.0 g丙烯酰胺和0.5 g甲叉双丙烯酰胺，250 μL丙烯酸，125 μL烯丙基胺和0.05 g NaHSO₃，均分为5份，用于制备5个印迹聚合物(所有模板浓度均为5 mg/mL)。加入相应模板后，在加入0.03 g过硫酸铵前、后，各溶液均超声脱气5 min。向经γ-MAPS修饰过的毛细管(长约12 cm)中注入相关溶液。将毛细管和剩余的溶液在-20℃反应24 h后，置于60℃水浴中2 h。毛细管柱经1 mol/L NaCl溶液(含10 g/L SDS)冲洗1 h后备用。非印迹聚合物(Non imprinted polymer,NIP)的合成步骤同上，只是单体溶液中不含任何蛋白质。

  3.   结果与讨论

  理想的蛋白质印迹聚合物应该具有良好的生物相容性，可以特异性识别模板分子，并有一定的柔性，便于模板、溶剂分子能够在聚合物中顺畅扩散。由于聚合物及蛋白质表面的酸、碱基团均会产生电离，其中部分带电基团将会配对、吸引，从而产生额外的识别作用。在两性聚丙烯酰胺冰胶中，不但能够产生与蛋白质分子外形互补的空穴，而且由于酸、碱基团的静电作用，这种空穴还具有一定的“方向性”或“极性”，其中识别的蛋白质分子不但要满足特定的外形，还需要具有互补的电荷数目与分布。少量酸、碱性单体的加入，显著提高了冰胶聚合物对蛋白质分子的印迹选择性^[29]。

  3.1.   两性聚丙烯酰胺冰胶的表征

  3.2.   不同蛋白质印迹效果的比较

  本研究选择了5个蛋白质进行印迹实验(表 1)。根据分子量、等电点的不同，可以将蛋白质归结为不同的类型。溶菌酶分子量最小(14 kDa)，等电点最大，属于小分子量的碱性蛋白质。酸性的胃蛋白酶分子量稍大，约为35 kDa。卵清蛋白、血红蛋白分子量分别为43和64 kDa，等电点分别为4.7与6.3，属于中等分子量的弱酸性蛋白质。γ-球蛋白分子量高达210 kDa，其等电点为7.3，是典型的中性大分子蛋白质。总之，本实验所选蛋白质分子量在10~200 kDa之间，等电点介于1.0~11.0，具有比较广泛的代表性，可用于考察聚合物的印迹适应性。

  表 1

  

  表 1  蛋白质的分子量和等电点

  Table 1.  Molecular weights (M_W) and isoelectric points (PI) of the proteins

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  印迹聚合物MIP	模板Template	分子量Mw(kDa)	等电点pI
  Ⅰ	溶菌酶 Lysozyme	14	11.0
  Ⅱ	胃蛋白酶 Pepsin	~35	1.0-2.5
  Ⅲ	卵清蛋白 Ovalbumin	43	4.7
  Ⅳ	血红蛋白 Hemoglobin	64	6.4
  Ⅴ	γ-球蛋白 γ-Globulin	210	7.3

  从毛细管电色谱结果(图 4)可见，虽然蛋白质性质差异极大，但是它们在NIP柱中的保留时间都比较小，数值也很接近，介于2~5 min之间，说明聚合物的非特异性吸附相当小。由于MIP柱中存在特异性识别位点，蛋白质的保留时间变长，且不同蛋白质间的差异极大。模板分子与MIP间的相互作用效果可以用印迹因子(Imprinting factor,IF)来表示，其计算公式为：

  \begin{document} $ IF={{k}_{MIP}}/{{k}_{NIP}} $ \end{document}

  图 4

  

  图 4  蛋白质的电色谱图

  Figure 4.  Electrochromatograms of proteins

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  其中,k_MIP和k_NIP分别是模板分子在MIP、NIP柱上的保留因子，其计算公式为k=t_R/t₀，t_R,t₀分别是蛋白质、硫脲的保留时间。

  由表 2中的计算结果可知，利用同一配方的单体溶液，可以合成出对所选5种蛋白质均有效果的印迹聚合物，说明两性聚丙烯酰胺冰胶能够适应不同性质的模板分子，是很好的蛋白质印迹材料。溶菌酶具有最高印迹因子7.0，推测与其碱性最强有关，因为聚合物是弱酸性的。从其它蛋白质的结果可知，印迹因子大小顺序为：卵清蛋白>血红蛋白>胃蛋白酶>γ-球蛋白，与其等电点顺序并不一致。另外从分子量大小来看，印迹因子与模板分子大小也未显示出关联性。上述结果说明，蛋白质分子在两性聚丙烯酰胺冰胶中的印迹效果，并不单纯决定于功能单体的数量与比例，而是与具体模板分子的总体性质，尤其是分子形状、表面电荷等有关。蛋白质分子在聚合物中形成的印迹位点是个性化的，具有非对称性特征^[29]。

  表 2

  

  表 2  蛋白质的保留及印迹因子

  Table 2.  Retention and imprinting factor (IF) of the proteins

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  模板Template	分子印迹 MIP-column				非印迹 NIP-column			印迹因子IF
  	t0	tR	k		t0	tR	k
  Lysozyme	4.6	81.2	16.7		3.5	12.0	2.4	7.0
  Pepsin	2.5	27.3	9.9		3.2	14.5	3.5	2.8
  Ovalbumin	2.1	24.4	10.6		3.0	9.0	2.0	5.3
  Hemoglobin	2.7	38.7	13.3		3.5	14.2	3.1	4.3
  γ-Globulin	3.4	19.0	5.6		3.5	9.5	2.7	2.0

  3.1.1.   红外光谱

  图 1是聚合物MIP-1(模板为溶菌酶)的红外光谱图。因为源于相同配比的单体溶液，其它聚合物的实验结果与此类似。图 1中吸收峰的归属为：γ_O-H=3620 cm^-1,γ_N-H=3294 cm^-1和3203 cm^-1,γ_C-O= 1683 cm^-1,γ_N-H=1537 cm^-1,γ_C-H=1454 cm^-1,γ_C-N=1396 cm^-1和1317 cm^-1,γ_C-O=1213 cm^-1。羧基、氨基吸收峰的同时存在，证明了聚合物的两性特征。

  图 1

  

  图 1  分子印迹聚合物-1(MIP-1)的傅立叶变换红外光谱(FTIR)谱图

  Figure 1.  FTIR spectrum of moleculary imprinting polymer Ⅰ(MIP-1)

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  3.1.2.   毛细管柱形貌

  聚丙烯酰胺具有优良的生物相容性，在生物学领域已得到广泛应用。本研究合成的两性聚丙烯酰胺冰胶均为白色大孔材料，能被水和油脂分别浸润，既可用于水相体系，也能使用有机溶剂处理，因此具有广泛的适应性。

  图 2是聚合物MIP-2(模板为胃蛋白酶)整体柱的扫描电镜图，其大孔特征十分明显。整体柱通透性良好，传质阻力很低，十分有利于生物大分子(蛋白质)的印迹与洗脱。

  图 2

  

  图 2  MIP-2印迹柱截面的扫描电镜图

  Figure 2.  SEM image of MIP-2 column

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  3.1.3.   两性聚丙烯酰胺冰胶的等电点

  酸碱滴定可以进一步揭示冰胶材料的两性特点。如图 3所示，聚合物MIP-1的滴定曲线与常规溶液中的强酸-强碱滴定不同，在pH 7.0处未显示出任何突跃。在pH 8.0~2.0范围内，整个曲线呈现缓慢变化的特征，充分说明中和反应是逐步进行的。

  图 3

  

  图 3  MIP-1的酸碱滴定曲线

  Figure 3.  Acid-base titration of MIP-1

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  在pH 4.0~5.0范围内，存在一个不太明显的平台。根据两性电解质的性质，认为此处存在一个缓冲区，源于聚合物上羧基-氨基酸碱对的缓冲作用，由此也可判断聚合物的等电点约为4.5，同时表明聚合物酸(碱)性比较弱。其它聚合物的滴定结果与图 3类似，因为所有单体溶液的配比是相同的。

  4.   结 论

  采用“两性聚合物处理两性生物大分子”策略，合成的两性聚丙烯酰胺聚合物可以成功印迹分子量为10~200 kDa、等电点为1.0~11.0之间的亲水性蛋白质。这种普适性使得所制备的分子印迹材料可以用于处理不同标准蛋白质或者复杂样品，可能成为分离、分析蛋白质的“通用”材料，并有望在分子识别、分离科学、生物催化等领域发挥更大的作用。

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  Figure 1  FTIR spectrum of moleculary imprinting polymer Ⅰ(MIP-1)

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  Figure 2  SEM image of MIP-2 column

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  Figure 3  Acid-base titration of MIP-1

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  Figure 4  Electrochromatograms of proteins

  MIP及NIP柱长度均为10 cm，通过特氟隆管和一段毛细管空柱(总长45 cm，进样端至检测器25 cm)相连。缓冲溶液为10 mmol/L的磷酸盐(pH 8.0，含4 mmol/LSDS)。进样条件：12 kV/20 s。运行电压：12 kV。检测波长：280 nm。A) 溶菌酶,B) 胃蛋白酶,C) 卵清蛋白,D) 血红蛋白,E) γ-球蛋白。(a) 非印迹柱，(b) 印迹柱。

  Each MIP and NIP column length is 10 cm，coupled with a void capillary (total 45 cm,25 cm from detection window)with a Teflon tube. Running buffer is 10 mmol/L PBS(pH 8.0,containing 4 mmol/L SDS). Injection 12 kV/20 s. voltage 12 kV. Detection wavelength 280 nm. (A) lysozyme,(B) pepsin,(C) ovalbumin,(D) hemoglobin,(E) γ-globulin on NIP (a) and MIP (b) tubes

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  Table 1.  Molecular weights (M_W) and isoelectric points (PI) of the proteins

  印迹聚合物MIP	模板Template	分子量Mw(kDa)	等电点pI
  Ⅰ	溶菌酶 Lysozyme	14	11.0
  Ⅱ	胃蛋白酶 Pepsin	~35	1.0-2.5
  Ⅲ	卵清蛋白 Ovalbumin	43	4.7
  Ⅳ	血红蛋白 Hemoglobin	64	6.4
  Ⅴ	γ-球蛋白 γ-Globulin	210	7.3

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  Table 2.  Retention and imprinting factor (IF) of the proteins

  模板Template	分子印迹 MIP-column				非印迹 NIP-column			印迹因子IF
  	t0	tR	k		t0	tR	k
  Lysozyme	4.6	81.2	16.7		3.5	12.0	2.4	7.0
  Pepsin	2.5	27.3	9.9		3.2	14.5	3.5	2.8
  Ovalbumin	2.1	24.4	10.6		3.0	9.0	2.0	5.3
  Hemoglobin	2.7	38.7	13.3		3.5	14.2	3.1	4.3
  γ-Globulin	3.4	19.0	5.6		3.5	9.5	2.7	2.0

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