English

• 1.   引 言

  西马特罗(Cimaterol)是"瘦肉精"的一种,常被添加于饲料及动物饮用水中以提高猪的瘦肉率。当人体摄入过多时,会引起心悸、心慌、恶心、呕吐、肌肉颤抖等临床症状^[1],严重时可危及生命。农业部已将西马特罗列入禁用清单,禁止其在畜禽生产和食品动物中使用^[2]。为保证食品安全以及食用人群的身体健康,必须在生猪收购、加工及市场销售过程中加强西马特罗等瘦肉精的监测。常见的西马特罗检测方法主要包括酶联免疫检测法(ELISA)^[3]、高效液相色谱法(HPLC)^[4]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[5]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)^[6]、电化学方法^[7]等,但这些方法均需依靠特定仪器进行检测,检测成本高、耗时长,不适合现场检测的要求。因此,研制简单、快速、特异性高、成本低的西马特罗检测方法有重要的实际意义。

  检测试纸具有制备简单、携带方便、易于操作、测定快捷等特点,在食品安全、水质分析、医学等领域得到了广泛应用^[8~10]。Sun^[11]和Wei^[12]等分别利用荧光二氧化硅纳米粒子及掺杂Ru(phen)₃²⁺的二氧化硅纳米粒子代替胶体金,制备了西马特罗免疫层析试纸条,利用西马特罗与二抗竞争性结合二氧化硅上的抗体,通过监测检测带上的荧光显色变化对西马特罗进行定性分析。该类免疫层析试纸条成本较高、不易存放,且在使用过程中质控线和检测线会发生荧光变化不明显的情况,漏检率偏高。

  分子印迹技术(Molecularly imprinted techonlogy,MIT)是一种基于分子印迹聚合物与模板分子的空间结构、分子大小及化学基团相互匹配互补,从而对模板分子进行特异性识别的技术^{[13, 14]}。本研究将分子印迹技术的特异性识别能力与试纸条检测速度快、携带方便的特点相结合,以西马特罗为模板分子,通过化学聚合制备得到西马特罗分子印迹聚合物,将硝酸纤维素膜浸泡于印迹聚合物中进行吸附,烘干后用乙醇洗脱模板分子,得到对西马特罗具有特异性识别能力的印迹试纸条。试纸条识别样品中西马特罗后,滴加曙红Y与西马特罗发生猝灭反应,通过判定试纸条反应区荧光猝灭程度对西马特罗进行定性及半定量分析。通过计算机Photoshop软件中的拾色器对反应区显色强度进行简单定义分辨,从而对西马特罗进行定量分析。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  PL303型精密电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,上海);UVA365紫外线灯(广州朗普光电科技有限公司);得力0111单孔打孔机(广州得力集团有限公司);Canon 660d数码相机(日本东京佳能株式会社)。

  西马特罗标准品(德国Witega Laboratorien公司);乙醇、曙红Y(国药集团化学试剂有限公司);α-甲基丙烯酸、N,N-二亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵(西陇化工股份有限公司);硝酸纤维素膜、塑料基底(美国PALL公司);所用试剂均为分析纯,实验用水为二次去离子水; 猪肉购于本地超市。

  2.2.   分子印迹聚合物及非分子印迹聚合物的制备

  将西马特罗标准品用二次水配制成100 μg/mL西马特罗母液,通过稀释分别得到0.01,0.1,1.0和10.0 μg/mL西马特罗储备液,备用。

  移取25 μL功能单体α-甲基丙烯酸,加入到5 mL 100 μg/mL西马特罗溶液中,超声混合10 min后,加入0.065 mmol/L交联剂N,N-二亚甲基双丙烯酰胺,超声30 min,4℃静置过夜。恢复常温后加入引发剂过硫酸铵溶液超声10 min,得到西马特罗分子印迹聚合物。用相同的方法制备非分子印迹聚合物(nMIPs),但在聚合过程中不加入模板分子西马特罗。

  2.3.   西马特罗分子印迹试纸条的制备

  将硝酸纤维素膜浸入西马特罗分子印迹聚合物中30 min后,置于50℃干燥箱内烘干30 min。裁剪出大小为3.0 × 1.0 cm的疏水性塑料片作为试纸条基底,在其背面粘贴双面胶,利用打孔器将基底连同双面胶打穿形成圆形孔洞(面积为38.465 mm²),将覆盖有西马特罗分子印迹聚合物的硝酸纤维素膜通过双面胶粘贴在基底上,裁剪整齐即得到分子印迹聚合物试纸条。移取100 μL乙醇对反应区(试纸条图中圆孔形状)进行淋洗(20 μL/次)以除去目标分子西马特罗,将淋洗后的试纸条置于50℃的烘箱中鼓风干燥1 h,以除去洗脱液乙醇,得到干燥后的的分子印迹试纸条。试纸条制作过程如图 1所示。

  图 1

  

  图 1  试纸条制备过程

  Figure 1.  Preparation process of test strip

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  2.4.   定性、半定量及定量方法

  在洗脱后的试纸条反应区内滴加20 μL不同浓度的西马特罗溶液,静置5 min后,用100 μL水洗涤试纸条反应区(20 μL/次)以清洗游离物质。均匀滴加20 μL 0.346 g/L曙红Y溶液于试纸条反应区,静置5 min后,放置在50℃干燥箱内干燥8 min,将试纸条放置在紫外灯下观察其荧光猝灭程度,如产生荧光猝灭现象则说明样品中含有西马特罗。在紫外灯照射下利用相机对干燥后的试纸条拍照,将样品试纸条与标准比色卡目视对比观察,标准比色卡中显色最相近的反应区所对应的浓度即为样品试纸条中所含有的目标分子浓度,即半定量分析。利用Photoshop软件中的拾色器采集样品试纸条及标准比色卡照片反应区中的三原色色度数据,以此数据为基础建立工作曲线,进行定量分析。

  2.5.   实际样品处理

  参考文献^{[15, 16]}方法对猪肉样品和中猪饲料样品进行预处理。将5 g切碎的猪肉样品置于25 mL 50 mmol/L HCl中,超声振荡1.5 h后,取6 g匀浆在10℃下离心15 min;在上清液中加入300 mL 1 mol/L NaOH,超声15 min,再加入4 mL 500 mmol/L KH₂PO₄溶液,调节pH=3左右,在4℃下冷藏过夜。取出后10℃下离心15 min,取上清液待测。取10 g待检饲料样品,加入20 mL 1 mol/L HCl溶解,再加入180 mL水,避光振荡20~30 min,3000 r/min离心20~30 min,取上清液待测。

  3.   结果与讨论

  3.1.   分子印迹试纸条检测西马特罗的可行性研究

  制备分子印迹试纸条(1、2、3号)和非分子印迹试纸条(4、5、6号)。在1与4、2与5、3与6号试纸条的反应区分别滴加0,1.0及10.0 μg/mL西马特罗溶液,按照实验方法进行检测,各平行制备两组进行实验,结果如图 2所示。

  图 2

  

  图 2  分子印迹试纸条(1,2,3)及非分子印迹试纸条(4,5,6)对西马特罗的荧光响应

  Figure 2.  Fluorescent response of cimaterol on molecular imprinting strip (1,2,3) and non-molecular imprinting strip (4,5,6)

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  对于西马特罗分子印迹试纸条,反应区有荧光猝灭现象产生,且荧光猝灭程度随着西马特罗浓度的增加而增大(3号＞2号＞1号);而不含西马特罗的非分子印迹试条,荧光强度未发生任何变化,说明非分子印迹试纸条不能识别西马特罗。由于分子印迹试纸条上的印迹孔穴可以特异性识别西马特罗,结合的西马特罗再与曙红Y反应产生荧光猝灭,基于此可以对西马特罗进行定性分析。根据试纸条反应区荧光猝灭程度不同,可以对西马特罗进行定量分析。

  3.2.   实验条件优化

  分别对分子印迹聚合物聚合时的溶液配比、硝酸纤维素膜在聚合物溶液中的浸泡时间、洗脱液种类及用量、曙红Y用量、试纸条显色持续时间进行了优化。实验结果表明: 以模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为1:12:20时,聚合得到的分子印迹聚合物的洗脱和重吸附效果最佳;空白硝酸纤维素膜浸泡在印迹聚合物中30 min得到的印迹聚合物膜荧光强度最大;以100 μL乙醇作为洗脱液(每次20 μL,淋洗5次)对目标分子的洗脱效果最好;当试纸条反应区面积为38.46 mm²时,使用20 μL 346 mg/L曙红Y可与被分析物反应完全。试纸条经干燥处理后,其显色可保持24 h无明显变化。

  3.3.   标准荧光比色卡及校正曲线

  分别滴加20 μL浓度为0.01,0.1,1.0,10.0,50.0和100.0 μg/mL西马特罗溶液于分子印迹试纸条反应区,静置后滴加曙红Y,利用紫外灯观察并拍照记录其荧光显色。结果如图 3所示,试纸条反应区的曙红Y荧光猝灭程度随着西马特罗浓度的增加而增大(上下反应区为平行实验)。结果表明,西马特罗浓度在0.01~100 μg/mL范围内时,试纸条反应区荧光强度随着西马特罗浓度的增加而降低。当西马特罗浓度为0.01 μg/mL时,试纸条反应区有明显的荧光猝灭现象,可以明显与空白溶液区分,即试纸条可对低至0.01 μg/mL西马特罗进行识别。

  图 3

  

  图 3  标准荧光比色卡: 西马特罗浓度(a~f)为: 0.01,0.1,1.0,10.0,50.0,100.0 μg/mL

  Figure 3.  Standard fluorescence colored card for cimaterol concentration: (a-f) 0.01,0.1,1.0,10.0,50.0,100.0 μg/mL

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  利用Photoshop软件中的拾色器对标准荧光比色卡上的反应区进行取色,得到三基色(红色R、绿色G、蓝色B)的色度值(°),取变化明显有规律的绿色色度(Green chrominance,°)为Y轴,以西马特罗浓度的对数为X轴建立工作曲线,西马特罗浓度的对数值与反应区绿色色度呈线性相关(图 4),线性方程G(°)=44.128 lgC(μg/mL)+120.84,相关系数R=0.9786。

  图 4

  

  图 4  分子印迹试纸条检测西马特罗的校正曲线

  Figure 4.  Calibration curve for detection of cimaterol with molecular imprinting test strip

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  3.4.   试纸条的分析性能

  考察了试纸条对西马特罗结构相似分子如克伦特罗、西布特罗、马布特罗及妥布特罗的识别特性。结果表明,20 μL 300 mg/mL的上述干扰物质产生的荧光变化与20 μL 1 μg/mL西马特罗产生的荧光变化相比,绿色色度值变化小于3.51%,表明西马特罗分子印迹试纸条有较强的特异性识别能力。同一批次制备11个分子印迹试纸条,对1 μg/mL西马特罗进行识别,其绿色色度值的相对标准偏差为4.59%,说明利用本方法制备的试纸条具有较好的批内重复性。不同批次制备9个分子印迹试纸条对1 μg/mL西马特罗进行识别,其绿色色度值的批间相对标准偏差为5.2%,表明本法制备的分子印迹试纸条具有较好的批间重现性。

  3.5.   实际样品测定

  为了进一步证明该试纸条的应用潜力,对猪肉及猪饲料样品进行了检测。测定结果如图 5所示,3号(猪肉样品)和6号(饲料样品)试纸条反应区有明显的猝灭,且猝灭程度小于标准比色卡第一个反应区,初步判定样品中的西马特罗含量＜0.01 μg/mL(即0.01μg/g),与HPLC检测结果(3号样0.0062 μg/mL,6号样0.0036 μg/mL ) 相符。利用加标法进行进一步考察试纸条的实用性,分别在3号猪肉样品测试溶液和6号饲料样品测试溶液加入0.1和0.01 μg/mL西马特罗,检测结果如图 6所示。加标后的3号样品荧光显色介于标准比色卡0.1~1.0 μg/mL之间(HPLC法结果为0.1074 μg/mL);加标后的6号样品荧光显色介于标准比色卡0.01~0.1 μg/mL之间(HPLC法结果为0.0141 μg/mL)。可见,此分子印迹试纸条能够应用于实际样品的筛查,且测定准确度较高。

  图 5

  

  图 5  分子印迹试纸条实际样品测试

  Figure 5.  Real sample analysis with test strip

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  图 6

  

  图 6  实际样品中西马特罗标准添加实验结果A,猪肉样品,加标量0.1 μg/mL ; B,饲料样品,加标量0.01 μg/mL

  Figure 6.  Results of standard addition analysis of cimaterol. A,pork sample,spiked level: 0.1 μg/mL; B,fodder sample,spiked level: 0.01 μg/mL

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  4.   结 论

  研究结果表明,本研究制备的对西马特罗具有特异性识别能力的分子印迹检测试纸条,具有制备简单、操作简便、特异性识别率高的特点,可用于猪肉、饲料等实际样品的检测,有较好的实际应用前景。

• 1. [1]

     Mersmann H J. J. Anim. Sci., 1998, 76(1): 160-172

  2. [2]

     Liu C. Chinese J. Pharm. Anal., 2008, 28(12): 2085-2089

  3. [3]

     Yoon Y K, Woan T N, Karen O, Michael Z. Asian Pac. J. Trop. Dis., 2014, 4(3): 223-252

  4. [4]

     Bazylak G, Nagels L J. J. Pharm. Biomed. Anal., 2003, 32(4): 887-903

  5. [5]

     Wang P, Wang R G, Zhang W, Su X O, Luo H F. Biosens. Bioelectron., 2016, 77: 866-870

  6. [6]

     Wang L, Zeng Z, Wang X, Yang J, Chen Z, He L. J. Sep. Sci., 2013, 36(11): 1843-1852

  7. [7]

     LIU Xue-Ping, ZHANG Yi-Fang, WU Hui-Wang, SHEN Guo-Li, YU Ru-Qin. Chinese J. Anal. Chem., 2012, 40(8): 1147-1152 刘雪平, 张一芳, 吴会旺, 沈国励, 俞汝勤. 分析化学, 2012, 40(8):1147-1152

  8. [8]

     Claver J B, Miron M C V, Capitán-Vallvey L F. Anal. Chem. Acta, 2004, 522(2): 267-273

  9. [9]

     DUAN Hong, CHEN Xue-Lan, JIANG Hu, SHEN Jun, DONG Sheng-Ming, XIONG Yong-Hua, Andrew Wang. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(3): 338-343 段 宏, 陈雪岚, 江 湖, 沈 骏, 董胜明, 熊勇华, Andrew Wang. 分析化学, 2015, 43(3): 338-343

  10. [10]

      ZHANG Hong-Cai, LIU Chun-Yan, LIU Guo-Yan, CHEN Xiao-Lian, YE Yu-Dan, WANG Yi-Ru, CHAI Chun-Yan. Chinese J. Anal. Chem., 2012, 40(6): 852-856 张洪才, 刘春燕, 刘国艳, 陈小连, 叶雨丹, 王艺如, 柴春彦. 分析化学, 2012, 40(6): 852-856

  11. [11]

      Song C M, Zhi A M, Liu Q T, Yang J F, Jia G C, Shervin J, Tang L, Hu X F, Deng R G, Xu C L, Zhang G P. Biosens. Bioelectron., 2013, 50: 62-65

  12. [12]

      Xu W, Chen X, Huang X L, Yang W C, Liu C M, Lai W H, Xu H Y, Xiong Y H. Talanta, 2013, 114: 160-166

  13. [13]

      LI Su-Ping, GUAN Huai-Min, XU Guo-Bao, DONG Yue-Jin. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(2): 294-299 李素萍, 关怀民, 徐国宝, 董跃进. 分析化学, 2015, 43(2):294-299

  14. [14]

      Li J, Zhang L, Wei G, Zhang Y, Zeng Y. Biosens. Bioelectron., 2015, 69(7): 316-320

  15. [15]

      Pleadin J, Vulić A, Perši N, Vahčić N. Meat. Sci., 2010, 86(3): 733-737

  16. [16]

      Wang W Y, Zhang Y L, Wang J Y, Shi X, Ye J N. Meat. Sci., 2010, 85(2): 302-305

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  Figure 1  Preparation process of test strip

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  Figure 2  Fluorescent response of cimaterol on molecular imprinting strip (1,2,3) and non-molecular imprinting strip (4,5,6)

  1和4: 20 μL曙红Y(0.346 g/L);2和5: 20 μL西马特罗(1.0 μg/mL)+ 20 μL曙红Y(0.346 g/L);3和6: 20 μL西马特罗(10.0 μg/mL)+ 20 μL曙红Y(0.346 g/L)

  1 and 4:20 μL of 0.346 g/L Eosin Y; 2 and 5: 20 μL of 1.0 μg/mL cimaterol + 20 μL of 0.346 g/L Eosin Y; 3 and 6: 20 μL of 10.0 μg/mL cimaterol + 20 μL of 0.346 g/L Eosin Y.

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  Figure 3  Standard fluorescence colored card for cimaterol concentration: (a-f) 0.01,0.1,1.0,10.0,50.0,100.0 μg/mL

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  Figure 4  Calibration curve for detection of cimaterol with molecular imprinting test strip

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  Figure 5  Real sample analysis with test strip

  1,2,3号为猪肉样品;4,5,6号为饲料样品

  1,2,3: pork sample;4,5,6: fodder sample[]

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  Figure 6  Results of standard addition analysis of cimaterol. A,pork sample,spiked level: 0.1 μg/mL; B,fodder sample,spiked level: 0.01 μg/mL

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