加替沙星磁性表面分子印迹材料的制备及其识别特性的研究

引用本文: 赵丽娟, 祁玉霞, 魏缠玲, 李文婧, 李亚, 王富强, 龚波林. 加替沙星磁性表面分子印迹材料的制备及其识别特性的研究[J]. 分析化学, 2016, 44(10): 1562-1567. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160146 shu

Citation: ZHAO Li-Juan, QI Yu-Xia, WEI Chan-Ling, LI Wen-Jing, LI Ya, WANG Fu-Qiang, GONG Bo-Lin. Preparation and Recognition Characters of Gatifloxacin Magnetic Surface Molecularly Imprinted Polymers[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(10): 1562-1567. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160146 shu

加替沙星磁性表面分子印迹材料的制备及其识别特性的研究

1.
宁夏大学化学化工学院, 银川 750021;
2.
北方民族大学化学与化学工程学院 , 银川 750021
基金项目:
本文系国家自然科学基金（No.21565001）资助项目

摘要: 以γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS）修饰的磁性二氧化硅（Fe₃O₄@SiO₂）为载体，加替沙星（GTFX）为模板分子，采用表面印迹法制备磁性表面分子印迹聚合物（M-MIPs）。用透射电镜（TEM）及磁化强度分析（VSM）对此聚合物进行了表征。吸附实验和Scatchard分析结果表明，M-MIPs中存在特异性和非特异性两类结合位点。M-MIPs和磁性非印迹聚合物（M-NIPs）对GTFX的最大吸附容量分别为35.1和23.13 mg/g。M-MIPs对于环丙沙星（CPFX）、诺氟沙星（NFLX）、三聚氰胺（MEL）以及四环素（TC）的选择性系数k分别为2.43，5.18，6.61和12.99；M-MIPs相对M-NIPs的相对选择性系数k'分别为2.09，1.95，3.15和2.43，表明M-MIPs对GTFX具有良好的特异性识别能力。将此表面印迹材料用于牛奶中GTFX的分离富集，采用高效液相色谱法检测，回收率大于91.5%。

关键词:

English

Preparation and Recognition Characters of Gatifloxacin Magnetic Surface Molecularly Imprinted Polymers

1.
School of Chemistry & Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;
2.
Beifang University of Nationalities, Chemical Science and Engineering College, Yinchuan 750021, China
Received Date: 01 March 2016
Revised Date: 29 June 2016
Fund Project:
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21565001)

Abstract: Using gatifloxacin (GTFX) as template molecule, magnetic surface molecularly imprinted polymers (M-MIPs) were prepared on the surface of modified magnetic silica (Fe₃O₄@SiO₂) with surface molecular imprinting technique. The polymers were characterized by transmission electron microscopy (TEM) and vibrating sample magnetometer (VSM). The static adsorption experiments and Scatchard analysis suggested that there were two types of binding sites in the M-MIPs. The maximum adsorption capacities of M-MIPs and magnetic non-imprinted polymers (M-NIPs) for GTFX were 35.1 mg/g and 23.1 mg/g, respectively. The selectivity coefficients of GTFX M-MIPs to ciprofloxacin (CPFX), norfloxacin (NFLX), melamine (MEL) and tetracycline (TC) were 2.43, 5.18, 6.61 and 12.99, and the relative selectivity coefficients of M-MIPs to M-NIPs for these four drugs were 2.09, 1.95, 3.15 and 2.43, respectively, indicating the good specific recognition capability for GTFX. Combined with high performance liquid chromatographic analysis, the M-MIPs were applied to extract and enrich GTFX in milk sample with the recoveries more than 91.5%.

Key words:

Magnetic silica
/ Gatifloxacin
/ Surface molecularly imprinted polymers
/ Adsorption

1.   引言

加替沙星(Gatifloxacin,GTFX)是第四代喹诺酮类广谱抗菌药物,多用于治疗和防控人以及动物的感染性疾病。近年来,畜牧养殖中的不规范用药导致动物性食品中兽药残留超标的事件时有发生,对人类的健康造成了威胁^[1],因此对动物性食品中包括喹诺酮类药物在内的药物残留的检测成为关注的热点。由于动物性食品种类多,基质成分复杂,检测前一般需采用适当的前处理方法对其进行净化、分离和富集。传统的样品前处理方法包括索氏提取、液-液萃取等^[2],但是这些方法通常操作繁琐,且选择性差,常常导致分析流程长、灵敏度不高。因此,建立高选择性、简便快速的的样品前处理方法非常重要。

分子印迹聚合物(MIPs)因其具有构效预定性、特异性识别和适用范围广等优点,被广泛应用于分离与分析领域^[3]。但常规方法制备的MIPs聚合物在与聚合溶液分离的过程中,往往需要经过抽滤或离心等步骤,繁琐耗时。磁性材料因具有独特的磁性能而易于分离^[4],因此将磁性分离技术与分子印迹技术相结合,制备磁性分子印迹聚合物(M-MIPs),可作为一种理想的分离手段。朱丽丽等^[5]以改性的磁纳米粒子(OA-Fe₃O₄)为基质,采用三步细乳化法合成双酚A M-MIPs,并用于湖水中双酚A的分离富集。陈朗星等^[6]以萘夫西林为模板分子制备了M-MIPs,分散性较好,可在外加磁场下实现快速分离,并且对萘夫西林具有良好的选择识别性能。上述研究结果表明,M-MIPs既具有磁性材料快速分离的特性,也具有分子印迹聚合物较高的特异选择性^[7]。

本研究采用表面印迹技术^[8],在Fe₃O₄@SiO₂-MPS微球表面合成了对GTFX具有特异识别作用的磁性表面印迹聚合物(M-MIPs),将其用于牛奶中GTFX的分离富集,效果良好。

2.   实验部分

2.1.   仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);JEM-2100透射电子显微镜(日本JEM公司);VSM 7404振动样品磁强计(美国Lakeshore公司);KQ-3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SHZ-C水浴恒温振荡器(上海浦东物理光学仪器厂)。

FeCl₃·6H₂O、油酸、盐酸羟胺(天津市大茂化学试剂厂);硅酸四乙酯(TEOS)、γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)、加替沙星(GTFX)、环丙沙星(CPFX)、诺氟沙星(NFLX)、三聚氰胺(MEL)、四环素(TC)、α-甲基丙烯酸(MAA)、二甲基乙二醇丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)均购自上海晶纯试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。

2.2.   加替沙星磁性表面分子印迹聚合物的制备

2.3.   磁性表面分子印迹聚合物的吸附性能研究

2.4.   牛奶样品中GTFX的测定

吸取10 mL市售的牛奶样品,加入一定量的GTFX和NFLX混合标准溶液,加标浓度分别为10,40和100 μg/mL,然后加入20 mL乙腈,4000 r/min离心10 min,取上清液过膜备用。分别移取10 mL上述牛奶提取液于含20 mg M-MIPs和M-NIPs的锥形瓶中,振荡吸附,磁铁分离,弃去上清液,用10 mL甲醇-乙酸(9:1,V/V)洗脱,洗脱液用N₂吹干,以1 mL流动相溶解定容,经0.22 μm有机膜过滤,上HPLC分析。

色谱条件:Diamonsil C₁₈柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,美国Agilent公司);流动相:0.025 mol/L H₃PO₄(三乙胺调节至pH 3.5)-乙腈(85:15,V/V);流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;紫外检测器,检测波长:295 nm。

2.2.1.   Fe₃O₄@SiO₂的制备及表面修饰

取6.76 g FeCl₃·6H₂O,溶于50%(V/V)乙醇中,磁力搅拌下加热至50℃,加入0.42 g盐酸羟胺;反应5 min后,用氨水调节溶液至pH 9,加入8.3 mL油酸,70℃搅拌反应30 min,停止搅拌,冷却至室温。在外加磁场下分离,并用热的无水乙醇洗涤数次,真空干燥得到磁性Fe₃O₄。

按照文献^[9]的方法合成Fe₃O₄@SiO₂:取1.0 g干燥的Fe₃O₄,超声分散于200 mL无水乙醇中,加入10 mL氨水和5 mL TEOS,60℃反应24 h。产物在磁场下分离,水洗至中性,真空干燥。

参照文献^[10]的方法对Fe₃O₄@SiO₂进行改性:将1.0 g Fe₃O₄@SiO₂分散于100 mL 50%(V/V)乙醇,加入1.25 mL MPS和0.20 mL吡啶,50℃反应24 h。反应结束后用无水乙醇洗涤,以除去未反应的MPS,制得表面修饰双键的复合磁性粒子(Fe₃O₄@SiO₂-MPS)。

2.2.2.   M-MIPs的制备

称取0.25 mmol模板分子GTFX于50 mL甲醇-乙腈(1:1,V/V)中,加入1 mmol功能单体MAA,室温预聚过夜。分别加入0.1 g Fe₃O₄@SiO₂-MPS、5 mmol交联剂EDMA、35 mg引发剂AIBN,充氮气30 min后,60℃聚合反应24 h。反应结束后,产物用磁铁分离。以甲醇-乙酸(9:1,V/V)为洗脱液处理24 h,再用甲醇洗去聚合物表面的乙酸后干燥,得到M-MIPs。

以同样方法制备非印迹聚合物(M-NIPs),只是不加入模板分子。

2.3.2.   选择性识别实验

考察M-MIPs对GTFX,NFLX,CPFX,MEL和TC的吸附选择性。称取M-MIPs和M-NIPs各20 mg,分别加入10 mL 200 mg/L 的GTFX,NFLX,CPFX,MEL和TC溶液,振荡条件下吸附2 h,磁铁分离,根据公式(1)分别计算各自的吸附量。用分配系数K_D、选择性系数k和相对选择性系数k'来考察聚合物的吸附特异性:

2

3

4

其中,Q_e(mg/g)为平衡吸附量,C_e(mg/mL)为吸附平衡时上清液中GTFX等的浓度,K_D(GTFX)和K_D(i)分别为GTFX和竞争分子的分配系数,k_M-MIPs和k_M-NIPs分别为M-MIPs和M-NIPs的选择性系数。

2.3.1.   吸附实验

将20 mg M-MIPs和M-NIPs分别分散在10 mL GTFX溶液(浓度80-320 mg/L)中,25℃恒温水浴振荡24 h。测定吸附平衡后上清液于λ=295 nm处的吸收值,根据公式(1)计算聚合物对不同浓度GTFX溶液的吸附量Q:

1

中,Q(mg/g)为吸附量,C₀(mg/L)和C_e(mg/L)分别为GTFX的初始浓度和吸附平衡时上清液中GTFX的浓度,V(mL)为溶液体积,m(g)为M-MIPs的质量。

3.   结果与讨论

3.1.   M-MIPs的合成

以共沉淀法制备Fe₃O₄磁性材料,采用溶胶凝胶法在Fe₃O₄表面包覆SiO₂(Fe₃O₄@SiO₂),MPS对其表面进行改性得到Fe₃O₄@SiO₂-MPS。以此作为基体,GTFX为模板分子,MAA为功能单体,在甲醇/乙腈介质中,GTFX上的羰基、羧羟基、仲胺基以及叔胺基与MAA通过氢键相互作用;同时,Fe₃O₄@SiO₂-MPS表面的双键会与MAA发生反应,引导聚合反应发生在Fe₃O₄@SiO₂-MPS表面。除去模板分子GTFX后,聚合物表面留下了大量与GTFX空间结构和大小相匹配的空穴,即得到M-MIPs。制备过程如图 1所示。

图 1

图 1 磁性表面分子印迹聚合物(M-MIPs)的合成路线

Figure 1. Synthesis route of magnetic surface molecularly imprinted polymers (M-MIPs)

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3.2.   磁性材料的表征

3.3.   M-MIPs的吸附性能研究

3.4.   实际样品分析

为了考察M-MIPs的实际应用性能,分别以M-MIPs和M-NIPs作为吸附剂,在牛奶样品中添加2种喹诺酮类抗生素药物的混合溶液,进行加标回收实验。图 6a为处理后的牛奶空白样品,未检测到GTFX和NFLX。在牛奶样品中添加浓度均为40 μg/mL 的 GTFX和NFLX的混合溶液,按照2.4节的步骤进行处理,HPLC分析,实验结果如图 6b和图 6c所示,M-MIPs对GTFX的分离富集效果明显优于M-NIPs,且用M-MIPs处理后测得的GTFX含量远高于类似物NFLX。从表 1可知,GTFX的回收率在91.5%~95.8%之间,RSD≤3.7%(n=3)。上述结果表明,制备的M-MIPs能够有效分离富集牛奶中的GTFX。

表 1

表 1 牛奶中GTFX添加回收实验结果

Table 1. Recoveries of GTFX spiked in milk sample

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样品Sample 加标量Added(μg /mL) 测得值Measured(μg /mL) 收率Recovery(%) RSD
(%,n=3)

10 9.37 93.7 3.7

牛奶
Milk 40 38.3 95.8 1.8

100 91.5 91.5 2.5

图 6

图 6 牛奶实际样品液相色谱图。a 空白牛奶样品;b 经M-MIPs萃取后的加标样品; c 经M-NIPs萃取后的加标样品。加标浓度:40 μg/mL

Figure 6. Chromatograms of milk samples. (a) blank milk sample,spiked milk sample extracted with M-MIPs (b) and with M-NIPs (c). Spiked level: 40 μg/mL

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3.2.2.   磁化强度分析

图 3是Fe₃O₄(a),Fe₃O₄@SiO₂(b),Fe₃O₄@SiO₂-MPS(c)和M-MIPs(d)的磁滞回线,其饱和磁化强度(Ms)分别为60.67,27.10,21.74和4.11 emu/g。随着Fe₃O₄表面包覆物的增加,磁性粒子之间的间距增大,相互作用力减小,从而使M-MIPs的Ms大幅度降低,但仍可采用磁性分离。如图 3插图所示,在外磁场作用下,M-MIPs颗粒被吸附在瓶壁上。

图 3

图 3 Fe₃O₄(a),Fe₃O₄@SiO₂(b),Fe₃O₄@SiO₂-MPS(c)和M-MIP(d)的磁滞回线

Figure 3. Magnetization curves of Fe₃O₄(a),Fe₃O₄@SiO₂(b),Fe₃O₄@SiO₂-MPS (c) and M-MIP (d)

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3.2.1.   透射电镜(TEM)表征

如图 2A所示,采用共沉淀法制备的Fe₃O₄纳米粒子呈现规则的球形结构,粒径均匀,约为20 nm。从图 2B可见,相比于Fe₃O₄纳米粒子,M-MIPs粒径明显增大,粒子间相互粘连,可观察到明显的核-壳型结构。

图 2

图 2 Fe₃O₄纳米粒子(A)和M-MIPs(B)的透射电镜图

Figure 2. TEM images of Fe₃O₄ nanoparticles (A) and M-MIPs (B)

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3.3.1.   吸附实验

M-MIPs和M-NIPs对不同浓度GTFX的吸附等温线如图 4A所示,两种材料的吸附量均随GTFX浓度的增大而增大,最大吸附容量分别为35.1和23.1 mg/g。对于相同浓度的GTFX,M-MIPs的吸附量始终明显高于M-NIPs的吸附量。这是由于M-MIPs经洗脱后表面留下了与GTFX功能基以及空间结构和大小相匹配的空穴,赋予了M-MIPs对GTFX的特异性识别能力。

采用Scatchard模型对M-MIPs的吸附性能作进一步分析,公式如下:

5

其中,Q_max(mg/g)为M-MIPs的最大表观吸附量,K_D(mg/L)为M-MIPs的平衡离解常数,Q(mg/g)为M-MIPs在每个浓度下的平衡吸附量。以Q/C_e对Q作图(图 4B),可见M-MIPs的Scatchard分析曲线由两条斜率不同的直线组成,表明M-MIPs对GTFX的吸附作用并非完全等价,聚合物表面有两种亲和力不同的结合位点。这是由于在制备非共价分子印迹聚合物时,功能单体和模板分子之间可以形成多种稳定性不同的复合物,不同类型的复合物在聚合时形成了具有不同吸附性质的结合位点^[11]。

图 4

图 4 M-MIPs和磁性非印迹聚合物(M-NIPs)对GTFX的吸附等温线(A)及M-MIPs的Scatchard曲线(B)

Figure 4. Adsorption isotherms of the binding of GTFX onto M-MIPs and magnetic non-imprinted polymers (M-NIPs) (A) and Scatchard plot of M-MIPs (B)

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图 5

图 5 GTFX,环丙沙星(CPFX),诺氟沙星(NFLX),三聚氰胺(MEL)和四环素(TC)在M-MIPs和M-NIPs的吸附量

Figure 5. Selective adsorption of M-MIPs and M-NIPs towards GTFX,ciprofloxacin (CPFX),norfloxacin (NFLX),melamine (MEL) and tetracycline (TC)

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3.3.2.   吸附选择性

如图 5所示,在相同初始浓度下,M-MIPs对GTFX的吸附量远于CPFX,NFLX,MEL以及TC。M-MIPs对于CPFX,NFLX,MEL及TC的选择性系数k分别为2.43,5.18,6.61和12.99; M-MIPs相对M-NIPs的相对选择性系数k'分别为2.09,1.95,3.15和2.43。上述结果说明,M-MIPs 对GTFX具有良好的特异性识别能力。
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Figure 1 Synthesis route of magnetic surface molecularly imprinted polymers (M-MIPs)

GTFX: Gatifloxacin; MAA: Methacrylic acid; EDMA: Ethylene glycol dimethacrylate; AIBN: 2,2’-Azobis(isobutyronitrile); TEOS: Tetraethyl orthosilicate.

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Figure 2 TEM images of Fe₃O₄ nanoparticles (A) and M-MIPs (B)

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Figure 3 Magnetization curves of Fe₃O₄(a),Fe₃O₄@SiO₂(b),Fe₃O₄@SiO₂-MPS (c) and M-MIP (d)

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Figure 4 Adsorption isotherms of the binding of GTFX onto M-MIPs and magnetic non-imprinted polymers (M-NIPs) (A) and Scatchard plot of M-MIPs (B)

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Figure 5 Selective adsorption of M-MIPs and M-NIPs towards GTFX,ciprofloxacin (CPFX),norfloxacin (NFLX),melamine (MEL) and tetracycline (TC)

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Figure 6 Chromatograms of milk samples. (a) blank milk sample,spiked milk sample extracted with M-MIPs (b) and with M-NIPs (c). Spiked level: 40 μg/mL

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Table 1. Recoveries of GTFX spiked in milk sample

样品Sample 加标量Added(μg /mL) 测得值Measured(μg /mL) 收率Recovery(%) RSD
(%,n=3)

10 9.37 93.7 3.7

牛奶
Milk 40 38.3 95.8 1.8

100 91.5 91.5 2.5

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