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• 肝癌是恶性肿瘤中最常见的一种，我国每年有20万人身患肝癌，占世界肝癌病患总数的50%。其由于难以早期诊断、容易转移和复发，致使癌症患者生存率很低^[1-3]。化疗是目前治疗癌症最有效的手段之一，对一些有全身播撒倾向的肿瘤及已经转移的中晚期肿瘤有很好的抑制效果。但是许多癌症患者在接受化疗期间会出现各种不同程度的副作用，诸如恶心呕吐、口干舌燥、食欲缺乏、手脚麻木、毛发脱落和血细胞减少等等，导致患者生存质量普遍下降，甚至因不能耐受而被迫中止治疗。因此，药物的靶向治疗得到广泛地关注^[4-6]。

  由于纳米钻石(ND)具有较好的生物相容性、表面可修饰性、很强的吸附力等优点^[7-8]，逐渐成为科研人员研究的重点。ND作为药物载体在药物输送方面得到广泛地应用。近年，Xi等^[9]采用物理吸附法制备了ND-阿霉素(DOX)药物，并应用于治疗恶性脑神经胶质瘤。Chow等^[10]通过实验表明，采用物理吸附法制备的ND药物具有很好的疗效和安全性。在我们前期研究中，制备了聚乙二醇化ND药物体系^[11-12]，该体系通过物理作用力负载纳米药物，尽管有着良好的抗肿瘤功效，但发现药物在血液循环中易过早泄露，导致到达肿瘤部位的药物浓度降低，生物利用度差。

  基于此，本文通过缩水甘油(GLY)与DOX发生开环反应，赋予DOX活性羟基基团(GLY-DOX, GDOX)，再以氨基己酸(ACA)修饰ND得到功能化ND载体(ND-ACA)，最后通过酯键将二者连接得到纳米药物输送体系ND-ACA-GLY-DOX(NAGD)。通过紫外-可见分光光度计、荧光光谱仪和傅里叶变换红外光谱仪等表征手段证实该纳米药物成功制备，研究了其体外药物释放行为，并以肝癌细胞HepG2为模型，考察了NAGD对细胞活性的影响。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  ND(ND，粒径约140 nm)购自中国苏州Element Six公司；溶菌酶(LZM)购自上海西宝生物科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC, ≥99.0%)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS, ≥99.0%)、缩水甘油(GLY，≥96%)购自美国Sigma公司；醋酸、丙酮购自津市登峰化学试剂厂，分析纯；三乙胺(TEA)购自天津市富宇有限公司，分析纯；氨基己酸(ACA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯。

  1901型紫外-可见分光光度计(UV-Vis，北京谱析通用公司)；MB3600-CH20型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，加拿大Bomen仪器公司)；970CRT型荧光光谱仪(上海分析仪器总厂)；Nano-ZS90型马尔文纳米粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)；TNZ-22型台式恒温震荡仪(太仓市实验设备厂)；XSP-8CA型光学倒置显微镜(上海光学仪器一厂)。

  1.2   NAGD纳米药物的制备

  1.2.1   GDOX的制备

  称取5.0 mg DOX溶解于5.0 mL无水乙醇，将5.0 μL体积分数为1%的GLY无水乙醇溶液逐滴添加至上述DOX溶液并快速搅拌，再滴加几滴TEA调节体系的pH值至8~9，室温避光搅拌24 h，抽滤、洗涤5次，得到缩水甘油改性的阿霉素GDOX，在真空条件下保存。

  1.2.2   ND-ACA的制备

  称取1.0 mg羧基化的ND于0.1 mol/L 1.0 mL的MES缓冲溶液(pH=5.8)中超声分散30 min，然后依次加入0.2 mg EDC和0.25 mg NHS，并不断搅拌6 h。反应结束后除去未反应掉的EDC和NHS，随后加入0.1 mol/L 1.0 mL的硼酸缓冲溶液(pH=8.4)，再加入0.3 mg ACA，过夜搅拌反应，即得到ND-ACA。

  1.2.3   NAGD药物的制备

  称取10.0 mg ND-ACA于10.0 mL灭菌去离子水中并超声0.5 h，随后逐滴将其加入至溶有3.0 mg GLY-DOX的灭菌去离子水中，再加入2.0 mg EDC和2.5 mg NHS，采用TEA将体系pH值调至8~9，37 ℃，搅拌24 h，反应结束后依次用蒸馏水和丙酮经多次洗涤得到NAGD纳米药物，真空干燥。

  1.3   NAGD纳米颗粒表征

  1.3.1   NAGD紫外-可见吸收光谱表征

  取少量纳米药物加入到PBS中，将其超声分散30 min，随后采用UV-Vis测定紫外吸收光谱。同时设置对照组，确定DOX是否负载于纳米颗粒上。

  1.3.2   NAGD荧光光谱表征

  取少量纳米药物加入到PBS中，将其超声分散30 min，用荧光光谱仪测定其荧光光谱图，确定DOX是否负载成功。

  1.3.3   NAGD红外光谱表征

  取适量纳米药物，与KBr混匀、研磨、压片，利用FTIR测定其红外光谱图，判断是否成功制得NAGD。

  1.3.4   NAGD粒径及电势测定

  取适量纳米药物，溶解于蒸馏水中，超声分散0.5 h，随后分别在25和90 ℃下用马尔文粒度仪测定其粒径，利用可折叠毛细管样品池，由电泳淌度测定其Zeta电势。

  1.4   NAGD纳米颗粒体外释药

  采用透析法研究NAGD的体外释药。首先等量称取3份NAGD，然后将其加入1.0 mL pH值分别为4.5、7.4和4.5(Lysozyme)的缓冲溶液中，超声分散0.5 h后，分别放入透析袋中。将3支50 mL的离心管分别加入上述缓冲溶液，放入相应透析袋，并将其避光放置在台式恒温振荡器中(温度37 ℃，转速150 r/min)。以时间为变量，每隔一定时间以2.0 mL相应的新鲜缓冲溶液代替2.0 mL的原始透析液，测定在480 nm处DOX的吸光度，并计算DOX的含量，绘制DOX累积释放曲线。

  1.5   细胞形态检测NAGD对细胞的活性

  为了观察纳米载体NA和纳米药物NAGD对HepG2细胞的影响，采用倒置光学显微镜对不同处理组的细胞形态进行观察，并拍照记录。在4个35 mm培养皿中接种生长状态良好的细胞，密度为1.8×10⁵个/皿，待细胞完全贴壁后，依次向培养皿中加入DOX、NA和NAGD，使药物DOX的终浓度为5 μg/mL，以未做任何处理的细胞作为对照。培养48 h后，弃除旧培养液后用PBS清洗2次，之后观察各组细胞形态和数量变化，拍照记录。

  1.6   噻唑盐(MTT)法检测NAGD的细胞活性

  为了定量检测纳米载体NA和纳米药物NAGD对HepG2细胞的影响，本实验采用MTT毒性测试法对不同质量浓度的NAGD与细胞作用不同时间后的细胞活性进行了测定。首先将HepG2细胞接种于96孔板中，每孔接5.0×10³个细胞。等到所接种的细胞完全贴壁之后，用FBS-DMEM培养基配制纳米药物质量浓度分别为0.5、2.0、5.0、6.0和8.0 μg/mL，然后将长好的细胞分别换上200 μL各质量浓度实验组，每组以未处理的细胞作为空白对照，培养24、48和72 h之后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，再放入培养箱培养4 h之后，吸去旧培养液，然后每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，孵育5 min后酶标仪检测吸光度值。

  1.7   激光共聚焦法检测NAGD的细胞摄取

  为了直观观察纳米药物NAGD在细胞内分布，以HepG2细胞为模型，采用激光共聚焦显微镜观察细胞摄取NAGD情况。将处于对数生长期HepG2按每盘1.0×10³个细胞接种于35 mm的激光共聚焦专用皿中，孵育过夜。待细胞贴壁后，加入含NAGD(5.0 μg/mL DOX)的培养液分别孵育2、5和12 h。待孵育完毕，冷PBS(pH=7.4)洗涤，4%多聚甲醛固定细胞，DAPI染色细胞核，置于激光共聚焦显微镜下观察纳米药物NAGD的分布并拍照记录。DAPI的激发波长为405 nm，DOX的激发波长为488 nm。

  2.   结果与讨论

  2.1   NAGD的制备及DOX连接量测定

  应用于肿瘤治疗药物输送的纳米药物体系应该具备体内稳定性高、血液循环半衰期长和肿瘤位点高度富集等特性。为了实现上述功能，以ND作为基体，参考文献[12]方法，首先借助ACA进行功能化修饰，得到ND-ACA，如图 1所示，通过荧光光谱法^[13]测定得到ND表面ACA的偶联量为(185±10.0) μg/mg。随后利用GLY与DOX之间的开环反应得到GDOX。最后通过ND-ACA表面的羧基(—COOH)与GDOX分子中羟基(—OH)发生酯化反应得到纳米药物体系NAGD，如图 2所示。

  图 1

  

  图 1.  ACA的荧光光谱图(A)及其标准曲线(B)

  Figure 1.  Fluorescence spectra(A) and the standard curve(B) of ACA

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  图 2

  

  图 2.  NAGD纳米药物的合成路线

  Figure 2.  The synthesis scheme of NAGD nanomedicine

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  图 3A为DOX的紫外可见吸收光谱图，并以此绘制出DOX标准曲线(如图 3B所示)，可知DOX在0~30 μg/mL的质量浓度范围内其质量浓度(ρ)与相应的吸光度值(A)呈良好的线性关系，且线性方程为A=0.0205ρ+0.0010，相关系数为R²=0.9974，由此可得ND-ACA表面DOX连接量为(145±5.2) μg/mg。

  图 3

  

  图 3.  DOX的UV-Vis曲线(A)及其标准曲线(B)

  Figure 3.  UV-Vis spectra(A) and the standard curve(B) of DOX

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  2.2   NAGD纳米药UV-Vis表征

  UV-Vis作为一种简单有效的表征手段，可用来对目标产物进行表征。由图 4可知，NAGD在480 nm处出现了一个宽吸收峰，与DOX的最大吸收峰相一致，证明GDOX偶联到了NA表面。

  图 4

  

  图 4.  不同纳米材料UV-Vis图

  Figure 4.  UV-Vis absorption spectra of various nanomaterials

  a.PBS; b.ND; c.NA; d.NAGD; e.GDOX

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  2.3   NAGD纳米药物荧光光谱表征

  荧光光谱也可以确定ND-ACA与GDOX之间是否确实以酯键连接。图 5分别为GDOX、NAGD、NA与DOX的物理混合液(NA+GDOX)的荧光光谱图。GDOX有很强的荧光吸收，当其以物理方式与纳米载体NA混合后，仍有荧光吸收，但强度下降。而在和NA以酯键相连接形成NAGD后，荧光猝灭，由此说明GDOX以共价键形式偶联到了纳米载体的表面，这可能与荧光能量转移机制有关。

  图 5

  

  图 5.  不同纳米材料荧光光谱图

  Figure 5.  Fluorescence spectra of various nanomaterials

  a.ND; b.NA; c.NAGD; d.GDOX; e.NA+GDOX

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  2.4   NAGD纳米药物FTIR表征

  通过FTIR确定NAGD是否制备成功(见图 6)。与ND的红外光谱图进行对比，在NA的红外光谱图中，2931 cm^-1为ACA中—CH₂的伸缩振动吸收峰，1635、1531和1311 cm^-1分别为酰胺键中N—H弯曲振动峰、C＝O的伸缩振动吸收峰和C—N伸缩振动峰，证实ACA通过酰胺键偶联到了ND表面。在NAGD的红外光谱图中，1414 cm^-1处出现DOX苯环振动的吸收峰，此外，在1710 cm^-1出现了C＝O振动峰，在1160和1050 cm^-1处出现C—O—C的特征吸收峰，进一步证明GDOX与NA间形成了酯键。

  图 6

  

  图 6.  不同纳米材料红外光谱图

  Figure 6.  FTIR spectra of various nanomaterials

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  2.5   NAGD纳米药物粒径与电势表征

  细胞摄取机制在一定程度上会受纳米颗粒的粒径和其表面电荷(Zeta电势)的影响。不同纳米颗粒的粒径大小和表面电荷，如图 7所示，粒径随着在ND表面进行各种分子的偶联而逐渐增大，而且其表面电荷也随之发生了变化。在纳米载体NA与GDOX以酯键相连得到目标产物NAGD后，粒径增大到264.1 nm，符合实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR)效应尺寸。

  图 7

  

  图 7.  不同纳米材料粒径大小(A)和表面电荷(B)

  Figure 7.  Particle sizes(A) and zeta potential(B) of various nanomaterials

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  2.6   NAGD体外释药

  为了验证所设计的NAGD纳米药物是否能在肿瘤组织中释放药物，而在正常组织中保持稳定性，本文采用透析法探究了其在不同pH值和溶菌酶作用下药物释放行为，如图 8所示，随pH值不同，DOX累积释放量有明显差距。在pH=7.4时，DOX累积释放率经过110 h后仅为8.03%，而当pH值减小到4.5时，DOX释放量增多，达到44.61%，表明NAGD在肿瘤组织溶酶体环境当中释药量可达到正常组织中的5倍。此外，pH=4.5(含溶菌酶)条件下，NAGD释药率显著增加，为不含溶菌酶条件下的2倍，这是由于溶菌酶的存在可使NAGD中的酯键水解断裂，从而大量释放出DOX。此结果表明以化学键偶联DOX后，能够提高纳米药物稳定性, 且在肿瘤细胞内酸性环境中可以释放阿霉素从而杀死细胞，暗示NAGD在药物可控释放中具有潜在应用。

  图 8

  

  图 8.  纳米药物NAGD体外药物释放曲线

  Figure 8.  The in vitro drug release curves of NAGD

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  2.7   细胞形态法检测NAGD对细胞的活性

  为了检测NAGD对细胞的活性影响，借助倒置光学显微镜对由NAGD孵育处理48 h后的HepG2细胞的形态进行了定性观察，如图 9所示，以未作任何处理的细胞为对照组，经过纳米载体NA孵育处理的细胞数量和形态相对Control组几乎未发生改变，表明细胞生长状态良好，证明载体具有低毒性。游离药物组DOX使细胞数量明显减少且形态皱缩，表明对细胞具有杀伤力，类似地，NAGD纳米药物组使细胞形状变大、轮廓模糊、数量大幅减少对细胞的活性影响，表明NAGD对HepG2细胞具有较好的杀伤力。

  图 9

  

  图 9.  不同处理组的细胞形态图

  Figure 9.  Microscopy images of HepG2 cells incubated with nanoparticles for 48 h

  A.Control; B.NA; C.NAGD; D.DOX

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  2.8   MTT法检测NAGD的细胞活性

  为了验证纳米药物对肿瘤细胞的毒性，通过使用MTT比色法探究NAGD在不同的质量浓度以及不同时间下对HepG2细胞存活的影响，结果如图 10所示。图 10A为不同质量浓度的NAGD与HepG2细胞作用72 h后的细胞活性，由图 10A可知，随着质量浓度的增大，对HepG2细胞的杀伤力也随之增强。图 10B为NAGD与HepG2细胞作用不同时间的细胞活性，由图 10B可见，随着孵育时间延长，细胞杀伤力也逐渐增强。

  图 10

  

  图 10.  MTT法检测NAGD对体外培养HepG2细胞活性影响

  Figure 10.  Effect of NAGD on HepG2 cells viability measured by MTT assay

  A.Different concentrations of NAGD on HepG2 cells viability for 72 h; B.NAGD(5.0 μg/mL DOX) on HepG2 cells viability for 24 h, 48 h and 72 h

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  2.9   激光共聚焦法检测NAGD的细胞摄取

  为了检测NAGD是否可被细胞摄取，借助激光共聚焦法对NAGD在细胞内的分布进行了研究，如图 11所示，孵育2 h后，细胞中有荧光出现但只是位于细胞质中，当孵育时间延长到5 h和12 h后，细胞内荧光强度逐渐增强且细胞质和细胞核中均有荧光，表明NAGD可以进入细胞进行药物输送，随后在溶菌酶作用下，酯键断裂，DOX释放进入细胞核，从而杀死肿瘤细胞。

  图 11

  

  图 11.  NAGD孵育处理HepG2细胞不同时间激光共聚焦图像

  Figure 11.  CLSM images of HepG2 cells treated with NAGD for 2, 5 and 12 h, respectively

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  3.   结论

  本文以功能化ND(ND-ACA)为载体，借助酯键偶联阿霉素(DOX)，成功制备出一种ND-氨基己酸-缩水甘油-阿霉素(NAGD)纳米药物输送体系。NAGD在正常生理条件下可稳定存在，可有效杀死HepG2细胞，且具有溶菌酶响应特性，暗示NAGD可降低DOX对正常组织的毒性，表明表明其在药物可控释放方面具有潜在应用。

  
  
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  图 1  ACA的荧光光谱图(A)及其标准曲线(B)

  Figure 1  Fluorescence spectra(A) and the standard curve(B) of ACA

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  图 2  NAGD纳米药物的合成路线

  Figure 2  The synthesis scheme of NAGD nanomedicine

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  图 3  DOX的UV-Vis曲线(A)及其标准曲线(B)

  Figure 3  UV-Vis spectra(A) and the standard curve(B) of DOX

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  图 4  不同纳米材料UV-Vis图

  Figure 4  UV-Vis absorption spectra of various nanomaterials

  a.PBS; b.ND; c.NA; d.NAGD; e.GDOX

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  图 5  不同纳米材料荧光光谱图

  Figure 5  Fluorescence spectra of various nanomaterials

  a.ND; b.NA; c.NAGD; d.GDOX; e.NA+GDOX

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  图 6  不同纳米材料红外光谱图

  Figure 6  FTIR spectra of various nanomaterials

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  图 7  不同纳米材料粒径大小(A)和表面电荷(B)

  Figure 7  Particle sizes(A) and zeta potential(B) of various nanomaterials

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  图 8  纳米药物NAGD体外药物释放曲线

  Figure 8  The in vitro drug release curves of NAGD

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  图 9  不同处理组的细胞形态图

  Figure 9  Microscopy images of HepG2 cells incubated with nanoparticles for 48 h

  A.Control; B.NA; C.NAGD; D.DOX

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  图 10  MTT法检测NAGD对体外培养HepG2细胞活性影响

  Figure 10  Effect of NAGD on HepG2 cells viability measured by MTT assay

  A.Different concentrations of NAGD on HepG2 cells viability for 72 h; B.NAGD(5.0 μg/mL DOX) on HepG2 cells viability for 24 h, 48 h and 72 h

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  图 11  NAGD孵育处理HepG2细胞不同时间激光共聚焦图像

  Figure 11  CLSM images of HepG2 cells treated with NAGD for 2, 5 and 12 h, respectively

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