English

• 1.   引 言

  神经系统是生物体内的一种结构和功能都极其复杂的调节系统，由大量神经细胞连接组成。神经细胞通过神经化学信号和神经电生理信号完成各种复杂的信息传递与整合功能^[1]。如果神经化学物质失调或者神经电活动发生异常，就会产生诸如帕金森病、阿兹海默症等各种神经性疾病。因而，同时对神经系统的电生理和化学双模信号开展研究，有助于进一步了解神经细胞的特性^[2]，更好地理解神经系统的工作机理和神经性疾病的发病机制等。近年来，研究人员分别在神经细胞^[3]、脑切片^{[4, 5]}和活体大脑^{[6, 7]}等不同层面开展了双模检测研究，并根据不同层面双模信号检测的需求，研制了能同时检测双模信号的离体^[8~10]和在体^{[11, 12]}神经信号检测电极。然而，在开展双模检测研究时，目前都是使用神经电生理记录仪、膜片钳、电化学工作站等分立的设备联合开展实验，这给实验操作、数据观测和分析都造成了一定的困难，亟需研制能同时对神经电生理和化学信号进行同步检测分析的设备。

  针对以上需求，本课题组在神经信号双模检测技术和仪器方面开展了大量的研究，研制了16通道的神经信号检测仪器^[13]。本研究在前期工作基础上，优化了神经电生理和化学信号的检测性能，强化了双模同步检测分析功能(该仪器的微弱电压和微弱电流检测分辨率分别达到0.3 μV和1 pA)；研制了可同时对64通道神经电生理信号和4通道化学信号进行实时同步检测的神经双模检测仪。 结合大鼠脑缺血模型，利用此双模仪器开展了同步检测神经元动作电位发放和抗坏血酸浓度变化的研究。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器组成

  研制的神经双模检测仪结构框图如图 1所示，主要由电生理检测模块、电化学检测模块、电源与主控制器以及数据采集卡构成。电生理检测模块通过前置放大器与微电极阵列(Multi-electrode arrays,MEA)相连，电化学检测模块直接通过连接线与MEA相连。上位机软件通过USB 接口对整个仪器进行控制。整套仪器体积为33 cm×20 cm×11 cm(长×宽×高)。

  图 1

  

  图 1  神经电生理和化学信号双模检测仪硬件结构框图

  Figure 1.  Hardware block schematic of the dual-mode recording device

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  2.2.   材料和试剂

  电生理记录用实验室自制植入式16通道MEA，电化学记录用碳纤电极(检测铁氰化钾)和碳纳米管修饰的碳纤电极^[16](检测抗坏血酸)作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag.AgC1(饱和KC1)电极为参比电极。

  Sprague-Dawley (SD)大鼠(北大医学部实验动物中心)； PBS(10 mmol/L，pH=7.2，Sigma公司)； 铁氰化钾(上海生工公司)； 生理盐水(石家庄四药公司)； 抗坏血酸(Sigma公司)； 128通道模拟神经信号发生器(Blackrock公司)。实验用水为去离子水。

  2.3.   实验方法

  2.1.1.   电生理检测模块

  电生理检测模块包含64个电生理通道，共分为4组。电生理通道通过前置放大器与微电极阵列相连。前置放大器对输入的微弱电生理信号和参考信号进行阻抗变换，并将信号放大10倍。电生理通道首先对输入的信号差分放大2倍，然后通过由运放、电容、电阻构成的0.1 Hz~5 kHz带通滤波放大器将信号放大50倍。信号最终被放大1000倍后输入到数据采集卡。为满足微弱信号检测需求，选用低噪声(2.8 nV/Hz@1kHz)运放AD8674(美国Analog Devices公司)作为放大器，并且，在电路设计时，充分利用米勒效应以极大地减少电容电阻的用量，从而降低电生理通道的热噪声^[14]。电生理模块电位检测分辨率达0.3 μV，输入噪声小于±5 μV。

  2.1.4.   上位机软件

  为保证软件的可靠和灵活性，上位机软件以Windows 7和Visual Studio作为编程开发平台，采用C#语言编写。采用了多级缓存队列、多线程等设计技术，以保证上位机能实时接收数据，完成双模信息同步分析处理、数据显示、数据存储等功能。上位机软件具备数字滤波、动作电位分离分类、CV法、I-t法等常用的功能。仪器外观及软件界面如图 2所示。

  图 2

  

  图 2  神经电生理和化学信号双模检测仪外观图(a)和计算机软件界面图(b)

  Figure 2.  Neural signal dual-mode recording system (a) and graphical user interface (b)

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  2.1.2.   电化学检测模块

  电化学检测模块包含4个独立的电化学通道，可用于同时监测4种不同化学物质的浓度变化。检测电路采用三电极体系，包含恒电位仪、电流电压转换器和差分放大器三部分：恒电位仪产生化学物质氧化还原反应所需的电位；电流电压转换器由反馈电阻和运放构成，将反应产生的电流信号转换成电压信号；差分放大器将转换得到的电压信号消除虚地误差并放大10倍。电流电压转换器的性能决定了电化学模块性能，因此，转换器的运放选用的是National semiconductor公司的超低输入电流(25 fA)和超低电流噪声(0.13 fA/Hz@1 kHz)运放LMC6001A(美国National Semiconductor公司)，并且，在电路设计时，对该运放的电流输入引脚和反馈电阻进行了精细的干扰防护处理^[15]。电化学模块的最高精度可达pA级，同时量程达±20 μA。结合上位机软件，仪器能够实现计时电流法(I-t)、循环伏安法(CV)等多种电化学检测模式。

  2.1.3.   其它模块

  电源与主控制器为整机提供稳定的直流电源、产生各模块工作所需要的电位和波形，同时同步控制各模块的工作，保障双模同步检测功能的实现。数据采集卡采用80通道的USB6255 OEM(美国NI公司)，具有16 bit 的ADC分辨率和1.25 MHz的采样率。电源与主控制器通过自定义的通讯总线与数据采集卡通讯，从而使整个仪器只需要通过数据采集卡的USB接口就能与上位机进行通讯。

  2.3.1.   神经电生理检测实验

  直接将神经双模检测仪和模拟神经信号发生器相连，以检测模拟神经信号。将16通道MEA植入SD大鼠颅内检测神经电生理信号。大鼠开颅和电极植入按照文献^[16]的方法。 电极被从皮层慢慢植入到海马区。在整个电极植入的过程中，实时监测电生理信号。

  2.3.2.   电化学检测实验

  本仪器包含了4个独立的电化学检测通道，可以单独使用其中的一个通道或同时使用多个通道开展实验。本次实验使用了其中的2个通道，分别检测铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])溶液和抗坏血酸(AA)溶液。

  检测K₃[Fe(CN)₆]溶液时，通过向PBS缓冲液中分阶段加入不同浓度的K₃[Fe(CN)₆]溶液改变整个溶液的浓度，并采用CV法检测电流变化。每个浓度进行6次CV扫描，仪器的扫描速度设为50 mV/s，电压范围设为-0.3~0.4 V。检测AA溶液时，通过向生理盐水中分阶段加入不同浓度的AA溶液来改变整个溶液的浓度，并采用I-t法检测电流变化，仪器工作电位设置为0.5 V。实验温度为25℃。

  2.3.3.   大鼠脑缺血模型检测实验

  大鼠电极植入手术和脑缺血模型构建,以及实现用碳纳米管修饰的碳纤电极对AA的选择性检测参考文献^{[16, 17]}的方法。大鼠进行双侧颈动脉结扎手术，电生理检测MEA和AA检测用碳纳米管修饰的碳纤电极同时植入到大鼠大脑初级感觉皮层(AP: 0 mm,ML: 3~4 mm,DV: 2 mm)。电化学参比电极和对电极分别放置在硬脑膜和脑皮下组织。采用I-t法检测AA浓度变化引起的电流变化。

  3.   结果与讨论

  3.1.   神经电生理检测实验

  动作电位检测软件滤波器设置为250~5000 Hz。首先通过模拟神经信号开展了仪器验证实验。模拟神经信号发生器能产生三类动作电位，本仪器对其记录的结果如图 3所示。图 3a显示每个通道都记录到了模拟神经信号，且各通道一致性良好。图 3b和图 3c分别为A7通道记录的模拟神经信号动作电位实时发放和分类图，可见记录到的模拟动作电位波形干净、信号完整、分类清晰。结果表明，本仪器能够有效分辨不同类型的动作电位，且仪器本身不会对被检测信号引入额外的高频噪声。

  图 3

  

  图 3  记录的64通道模拟神经信号(a)和A7通道动作电位实时发放(b)与分类(c)结果

  Figure 3.  64-channel simulate neural signals (a) ,and firing (b) and sorting (c) of spikes detected in A7 channel

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  开展了大鼠颅内神经信号检测实验。在电极植入的过程中，有8个通道检测到了动作电位(Spike)发放。其中，图 4a和图 4b分别为在大脑皮层和纹状体记录到的两类典型Spike信号。由图 4可见，单个Spike的持续时间为2～3 ms，峰值180 μV左右，且波形干净。所检测到的信号特征符合大鼠神经细胞胞外记录的信号特点，信噪比(S/N)为6:1。

  图 4

  

  图 4  大鼠颅内神经信号检测实验中记录到的大脑皮层(a)和纹状体(b)动作电位发放和波形图

  Figure 4.  Spike firing and spike waveforms detected in cortex (a) and striatum (b) of Sprague-Dawley rat in the electrophysiological experiment

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  3.2.   电化学检测实验

  图 5a显示K₃[Fe(CN)₆]溶液浓度为0.1~10 mmol/L时的循环伏安响应，每个浓度进行6次扫描，选择第5次记录结果。在0.1～0.2 V之间，K₃[Fe(CN)₆]明显氧化，故判断0.15 V为其氧化电位。选取0.15 V时K₃[Fe(CN)₆]的氧化电流作浓度-电流曲线，如图 5b所示。结果表明，K₃[Fe(CN)₆]浓度在0.1~10 mmol/L范围内，电流响应与K₃[Fe(CN)₆]浓度呈线性关系，线性回归方程为I(μA)=-0.021+0.597C(mmol/L)，相关系数R²为0.9889。

  图 5

  

  图 5  铁氰化钾CV扫描曲线(a)和铁氰化钾浓度电流曲线(b)

  Figure 5.  Cyclic voltammetric curves(CVs) of micro-electrode (a) and K₃[Fe(CN)₆] calibration curve (b)The working electrode is poised at +0.15V. 1 to 8: 0.1,0.5,1,2,4,6,8,10 mmol/L K₃[Fe(CN)₆] solution; Scan rate: 50 mV/s.

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  图 6a为本仪器检测到的不同浓度AA溶液I-t响应曲线，AA氧化电流-浓度曲线，如图 6b所示。结果表明，在AA浓度在10~800 μmol/L范围内，电流响应与AA浓度线性回归方程为I(nA)= 3.554+0.0337C(μmol/L)，相关系数R²为0.9841。

  图 6

  

  图 6  抗坏血酸I-t曲线(a)和抗坏血酸浓度电流曲线(b)

  Figure 6.  Current-time response of ascorbic acid (AA) (a) and AA calibration curve (b).Response time: 50 s. The working electrode is poised at +0.5V (vs. Ag/AgCl electrode)

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  电化学检测实验结果表明，本仪器电化学检测模块各通道能结合各自的工作电极，采用不同的检测方法检测各种化学物质浓度变化信号。

  3.3.   大鼠脑缺血模型检测实验

  慢性脑缺血会造成脑组织缺氧，可能是引起帕金森病人黑质多巴胺神经元大量凋亡的原因之一；同时它引起的细胞代谢紊乱，会导致脑内AA分泌增多^[18]。因此，本研究选择大鼠脑缺血模型开展神经电生理和化学信号同步检测实验。

  用16个电生理通道和1个电化学通道实时检测在进行缺血、再灌注过程中大鼠大脑初级感觉皮层的spike发放和AA浓度变化引起的电化学电流变化。实验结果如图 7所示，图 7(a)为AA浓度变化引起的实时电流变化图，图 7(b)为检测到的两个通道Spike实时发放光栅图。结果显示：在大鼠结扎前，通道1和16都有明显的Spike发放；结扎后，Spike发放逐渐减少，同时AA浓度快速升高，并在十分钟后稳定。结扎半小时后再灌注，AA浓度开始缓慢降低，并在第90 min降到结扎前相当浓度。此时由于大鼠脑部电极植入处干燥，故滴加了生理盐水，此时观测到16通道出现Spike阵发排放，并且由于生理盐水渗透稀释作用，电流快速降低。实验于115 min时结束。由实验结果可见，通道16检测的神经元细胞放电功能在AA浓度没有恢复之前受到遏制，AA浓度恢复之后，该神经元能恢复放电；通道1检测的神经元细胞很可能在缺血过程中受到严重损伤而慢慢失活，所以可见该神经元在实验过程中出现由于自身失活所表现出来的零星放电现象，而在实验后期由于细胞死亡不再能恢复放电。综合实验所见现象，我们认为：大鼠双侧颈动脉结扎会导致大鼠大脑初级感觉皮层AA浓度升高和神经元Spike放电频率显著减少；结扎解除后，AA浓度会逐渐恢复至结扎前水平，未失活神经元能恢复正常放电；AA浓度和神经元放电频率呈一定的负相关关系。

  图 7

  

  图 7  同步检测到的大鼠脑缺血模型下大脑初级感觉皮层的双模信号变化

  Figure 7.  Dual-mode signal synchronously detected in the primary sensory cortex of Sprague-Dawley rat in the global cerebral ischemia experiment

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  4.   结 论

  设计并研制了一种能同步检测神经电生理和化学信号的双模检测仪，仪器集成的电生理模块和电化学模块可实现神经电生理和化学信号同步检测。利用本仪器开展的实验，检测到信噪比(S/N)为6的Spike发放，在K₃[Fe(CN)₆]溶液CV测试中电流响应的线性相关系数R²为0.9889(浓度0.1~10 mmol/L)，同时，在AA溶液I-t测试中获得了线性系数为0.9841(浓度10~800 μmol/L)的电流响应，并且在大鼠脑缺血模型中成功地同步检测到了神经Spike发放和AA浓度变化引起的电流变化。实验结果表明，此仪器64通道的电生理检测功能一致性良好，双模同步检测功能实用，并且利用此仪器得到了在大鼠脑缺血模型中，大鼠大脑初级感觉皮层AA浓度与Spike发放呈一定负相关关系的结论。

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  Figure 1  Hardware block schematic of the dual-mode recording device

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  Figure 2  Neural signal dual-mode recording system (a) and graphical user interface (b)

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  Figure 3  64-channel simulate neural signals (a) ,and firing (b) and sorting (c) of spikes detected in A7 channel

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  Figure 4  Spike firing and spike waveforms detected in cortex (a) and striatum (b) of Sprague-Dawley rat in the electrophysiological experiment

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  Figure 5  Cyclic voltammetric curves(CVs) of micro-electrode (a) and K₃[Fe(CN)₆] calibration curve (b)The working electrode is poised at +0.15V. 1 to 8: 0.1,0.5,1,2,4,6,8,10 mmol/L K₃[Fe(CN)₆] solution; Scan rate: 50 mV/s.

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  Figure 6  Current-time response of ascorbic acid (AA) (a) and AA calibration curve (b).Response time: 50 s. The working electrode is poised at +0.5V (vs. Ag/AgCl electrode)

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  Figure 7  Dual-mode signal synchronously detected in the primary sensory cortex of Sprague-Dawley rat in the global cerebral ischemia experiment

  (a)实验中AA浓度变化引起的电流时间响应；(b)1和16通道检测到的动作电位发放光栅图

  (a) On-line current-time response caused by AA concentration change; (b) Spike firing detected in the channel 1 and 16

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