许多药品在制备过程中会使用一些有机溶剂,当药品中所含的残留溶剂水平高于安全值时,将可能对人体或环境产生严重的危害。因此,对药品中残留溶剂水平的监测与控制,一直都是制药领域重点关注的问题。1990年,欧盟、美国和日本在布鲁塞尔启动了"人用药品注册技术规定国际协调会"(ICH),提出应颁布条令来考察药品中残留溶剂的含量,要求对所有药品都要进行溶剂残留的监测与控制[1, 2]。
托比司他是一个不含嘌呤结构的黄嘌呤氧化酶选择性抑制剂,是由日本富士药品株式会社研发的新一代抗高尿酸血症和痛风的药物[3],并于2013年在日本获得批准上市。不同于传统的黄嘌呤氧化酶抑制剂(如非布司他),托比司他主要与溶剂通道的关键氨基酸残基发生相互作用[4]。托比司他(包括有关中间体)在其合成工艺中可使用到许多有机溶剂[3~6],主要为甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二氧六环和吡啶6种不同的溶剂。这些溶剂的毒性差异较大,残留在药品中会对人体健康造成危害。因此,建立简单、快速、且能同时检测多种残留溶剂含量的方法对托比司他药品的安全使用具有非常重要的实际意义。到目前为止,相关检测方法尚未见报道。
检测药品中残留溶剂的方法有多种,常用的方法(如热失重测定法)具有简便、快速的特点,但通常得到的是所有残留溶剂的总量; 分光光度法是根据不同溶剂的特征吸收峰的强度而实现药品中残留溶剂的测定,但检测灵敏度较低。目前,许多国家的药典推荐使用静态顶空气相色谱法检测药品中的残留溶剂[1, 7, 8]。该技术可将液体或固体样品中的挥发性组分直接导入气相色谱仪进行分离和检测,适用于挥发性强的组分分析。而且顶空进样法使待测物挥发后进样,可免去样品萃取、浓缩集集等前处理步骤,样品处理简单,工作效率高; 同时,还可避免样品中非挥发组分对色谱柱的污染,延长色谱柱的使用寿命。此外,顶空进样一般取1 mL挥发气体,进样体积显著大于液体直接进样方式,灵敏度也得到大幅度的提高[7]。目前,该技术主要应用在药物残留溶剂和水中挥发性组分的检测方面,还可与质谱检测技术联用,用于分析中草药、生物、食品包装纸等样品中的挥发性物质[9~12]。本研究利用顶空气相色谱法,通过考察不同固定相对分离效果的影响、优化平衡加热时间以及选择合适的制样溶剂,建立了同时测定托比司他中6种残留溶剂的新方法,旨在为药品中残留溶剂的检测及监控提供技术基础。
Agilent Technology 7890A GC system气相色谱仪,配有氢火焰离子化检测器(FID)以及Agilent Technologies G1888型顶空自动进样器(美国Agilent公司); SGHK-500型氢气、空气发生器(北京东方精华苑科技有限公司); 可调式移液器(法国Gilson公司); Metller Toledo XS204分析天平(瑞士Metller公司); 20 mL顶空进样瓶。甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二氧六环、吡啶均为色谱纯(纯度>99.5%,Sigma-Aldrich公司); N,N-二甲基甲酰胺(色谱纯纯度99.9%,美国Fisher公司)。实验样品为某药品公司生产的托比司他片剂(Topiroxostat,规格: 20 mg)。
采用Rtx-200型聚三氟丙基甲基硅氧烷为固定相的毛细管色谱柱(30 m ×0.25 mm ×1 μm; 美国Restek公司)。程序升温: 初始温度40℃维持6 min,以10℃/min的速率升温至240℃并维持2 min; 载气为氮气; FID检测器,温度: 250℃; 进样口温度: 230℃; 分流进样方式; 分流比: 10:1; 柱流速: 1.0 mL/min; 顶空平衡温度: 90℃,平衡时间: 30 min; 进样量: 1 mL。
分别精确称取600 mg甲醇、1000 mg乙醇、120 mg二氯甲烷、1000 mg乙酸乙酯、76 mg 1,4-二氧六环和40 mg吡啶,用N,N-二甲基甲酰胺定容至100 mL,作为标准储备液,4℃保存。储备液用N,N-二甲基甲酰胺稀释成系列工作溶液。在进行顶空气相色谱分析时,通过测定单一标准溶剂的保留时间确定混合溶剂样品的各个峰的归属。
准确称取供试托比司他片剂样品0.20 g(精确至0.0001 g),置20 mL 顶空瓶中,加入N,N-二甲基甲酰胺2 mL溶解,立即密封。
甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二氧六环和吡啶6种溶剂的极性存在着很大的差别。因此,为实现这6种溶剂的同时分离,需选择合适的色谱固定相。本研究考察了3种负载不同固定相的毛细管色谱柱DB-FFAP(固定相: 硝基对苯二酸改性的聚乙二醇)、ZB-624(固定相: 6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷)和Rtx-200(固定相: 聚三氟丙基甲基硅氧烷)对6种溶剂分离的影响,结果如图 1所示。使用DB-FFAP型色谱柱时,甲醇、乙醇和二氯甲烷分离效果差,同时乙酸乙酯、1,4二氧六环和吡啶拖尾较严重; 使用ZB-624型色谱柱时,二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二氧六环和吡啶分离效果很好,但是由于色谱柱对甲醇、乙醇的吸附作用较大,从而导致这两种溶剂的色谱峰值较小甚至不出峰; 使用Rtx-200型色谱柱时,6种溶剂均可得到良好的分离,且无拖尾现象。因此,选用Rtx-200型色谱柱对甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二氧六环和吡啶进行分离。
由于顶空气相色谱法是利用被测样品(气-液或气-固)加热平衡后,取其挥发气体部分进入气相色谱仪而进行分析,因此,平衡加热温度和时间是影响分析灵敏度与准确度的两个重要参数。本研究所涉及的6种溶剂,沸点约在40~115℃之间,较低的温度(如50℃)不仅平衡时间延长,而且会降低溶剂回收率; 较高的温度(如115℃)虽然有利于这些溶剂的挥发和缩短平衡时间,但会影响顶空自动进样设备的寿命,并可能导致乙酸乙酯发生部分分解。并综合考虑各方面因素,选择加热温度为90℃,在该温度下,乙酸乙酯不会分解,且各溶剂的挥发较快,平衡时间较短。在此基础上,进一步考察了平衡时间15,20,25,30,35和40 min对6种溶剂的色谱峰面积的影响。从图 2可见,甲醇、乙醇和乙酸乙酯在15-30 min内色谱其峰面积随着平衡时间的延长而增加,在30 min以后峰面积增加趋于平缓; 二氯甲烷、吡啶和1,4-二氧六环在15-40 min内随着平衡时间的延长,峰面积改变不大。为获得良好的样品分析的准确性和灵敏度,本方法选用平衡时间30 min。
考察了四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂的效果,发现四氢呋喃干扰乙醇的出峰,而以N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂时,不仅可与甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二氧六环和吡啶这6种溶剂互溶,而且由于其在色谱柱中最后出峰,不会在色谱分析时对分析物产生干扰,因此选择N,N-二甲基甲酰胺为溶剂。
用N,N-二甲基甲酰胺将6种标准储备液分别稀释成浓度为甲醇6.0~600.0 μg/mL、乙醇5.0~1000 μg/mL、二氯甲烷12~120.0 μg/mL、乙酸乙酯2.5~1000 μg/mL、1,4-二氧六环7.6~76.0 μg/mL和吡啶4.0~40.0 μg/mL的系列标准工作溶液,在上述优化的分析条件下进行测定。以峰面积(Y)对相应溶剂的质量浓度(X,μg/mL)绘制标准曲线,发现6种残留溶剂在各自的浓度范围内线性关系良好,线性相关系数均大于0.998。以S/N=3 计算6种 残留溶剂的检出限(LOD),以S/N=10 计算6种残留溶剂的定量限(LOQ),结果列于表 1。
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| 分析物Analyte | 标准曲线方程Equation of standard curve | 线性范围Linear range(μg/mL) | 相关系数Correlation coefficient(R2) | 检出限LOD(%) | 定量限LOQ(%) |
| 甲醇 Methanol | Y=0.243X+1.239 | 6.0～600 | 0.9998 | 0.003 | 0.006 |
| 乙醇 Ethanol | Y=0.372X+3.873 | 5.0～1000 | 0.9989 | 0.0025 | 0.005 |
| 二氯甲烷 Dichloromethane | Y=0.103X+0.197 | 12～120 | 0.9996 | 0.006 | 0.012 |
| 乙酸乙酯 Ethyl acetate | Y=0.319X+3.880 | 2.5～1000 | 0.9998 | 0.0012 | 0.0025 |
| 1,4-二氧六环 1,4-Dioxane | Y=0.309X－0.118 | 7.6～76 | 0.9987 | 0.0038 | 0.0076 |
根据《中华人民共和国药典》2015年版第四部0861残留溶剂测定法中的规定,相关6种残留溶剂的限度值分别为甲醇0.3%、乙醇0.5%、二氯甲烷0.06%、乙酸乙酯0.5%、1,4-二氧六环0.038%和吡啶0.02%[2]。分别向药品基质中加入限度值80%,100%,120% 3个水平的目标分析物,进行实验测定。结果如表 2所示,待测物的平均回收率在92.3%~100.3%之间,相对标准偏差为0.3%~3.6%,可满足实际分析要求。
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| 分析物Analyte | 加标水平Spikedlevel | 加入值Added(μg/mL) | 回收率Recovery(％) | 相对标准偏差RSD(%， n=6) |
| 1 | 240.0 | 95.5 | 1.2 | |
| 甲醇Methanol | 2 | 300.0 | 97.0 | 1.2 |
| 3 | 360.0 | 96.2 | 1.0 | |
| 乙醇Ethanol | 1 | 400.0 | 95.5 | 1.2 |
| 2 | 500.0 | 97.2 | 1.2 | |
| 3 | 600.0 | 97.4 | 0.9 | |
| 二氯甲烷Dichlorome- thane | 1 | 48.0 | 92.3 | 3.3 |
| 2 | 60.0 | 93.6 | 3.6 | |
| 3 | 72.0 | 94.0 | 0.8 | |
| 1 | 400.0 | 93.5 | 2.6 | |
| 乙酸乙酯Ethyl acetate | 2 | 500.0 | 94.3 | 3.1 |
| 3 | 600.0 | 93.8 | 0.9 | |
| 1 | 30.4 | 96.2 | 2.4 | |
| 1,4-二氧六环1,4-Dioxane | 2 | 38.0 | 97.2 | 1.4 |
| 3 | 45.6 | 98.1 | 0.8 | |
| 1 | 16.0 | 100.3 | 1.7 | |
| 吡啶Pyridine | 2 | 20.0 | 96.7 | 0.7 |
| 3 | 24.0 | 99.2 | 0.3 |
采用本方法对来自同一厂家的3批托比司他实际样品进行了分析与检测。图 3为其典型的色谱分离图。在定量分析时,依据实际峰面积,采用外标法来进行。检测结果列于表 3。由表 3可见,样品中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯可以检出,但它们都低于《中华人民共和国药典》的残留溶剂的限度值,而乙醇、1,4-二氧六环和吡啶均未检出。上述结果表明,这3批托比司他中的6种溶剂残留符合我国药典中的相关限度标准。本方法能够满足药典中相应残留溶剂的限量标准要求。
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| 分析物Analyte | 1号样品Sample 1 | 2号样品Sample 2 | 3号样品Sample 3 |
| 甲醇 Methanol | 0.031 | 0.029 | 0.033 |
| 乙醇 Ethanol | ND | ND | ND |
| 二氯甲烷 Dichloromethane | 0.028 | 0.027 | 0.029 |
| 乙酸乙酯 Ethyl acetate | 0.09 | 0.085 | 0.09 |
| 1，4-二氧六环 1,4-Dioxane | ND | ND | ND |
| 吡啶 Pyridine | ND | ND | ND |
| ND: 未检出 (Not detectable)。 | |||
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Figure 1 Effects of different columns on the separation of 6 residual solvents: 1,methanol (300 μg/mL); 2,ethanol (500 μg/mL); 3,dichloromethane (60 μg/mL); 4,ethyl acetate (500 μg/mL); 5,1,4-dioxane (38 μg/mL); 6,pyridine (20 μg/mL)
Figure 2 Effects of different equilibration time on the area of 6 residual solvents at the equilibrium temperature of 90℃:
1.乙醇; 2. 乙酸乙酯; 3. 甲醇; 4. 吡啶; 5. 1,4-二氧六环; 6. 二氯甲烷。
1,Ethanol; 2,Ethyl acetate; 3,Methanol; 4,Pyridine; 5,1,4-Dioxane; 6,Dichloromethane. (methanol 300 μg/mL; ethanol 500 μg/mL; dichloromethane 60 μg/mL; ethyl acetate 500 μg/mL; 1,4-dioxane 38 μg/mL; pyridine 20 μg/mL).
Figure 3 Chromatogram of real sample
1.甲醇; 2. 二氯甲烷; 3. 乙酸乙酯; 4. N,N-二甲基甲酰胺(基质溶剂)。
Peaks: 1. Methanol; 2. Dichloromethane; 3. Ethyl acetate; 4. N,N-dimethylformamide (matrix solvent).
Table 1. Equations of standard curves, linear range, correlation coefficients, LOD and LOQ of 6 residual solvents
| 分析物Analyte | 标准曲线方程Equation of standard curve | 线性范围Linear range(μg/mL) | 相关系数Correlation coefficient(R2) | 检出限LOD(%) | 定量限LOQ(%) |
| 甲醇 Methanol | Y=0.243X+1.239 | 6.0～600 | 0.9998 | 0.003 | 0.006 |
| 乙醇 Ethanol | Y=0.372X+3.873 | 5.0～1000 | 0.9989 | 0.0025 | 0.005 |
| 二氯甲烷 Dichloromethane | Y=0.103X+0.197 | 12～120 | 0.9996 | 0.006 | 0.012 |
| 乙酸乙酯 Ethyl acetate | Y=0.319X+3.880 | 2.5～1000 | 0.9998 | 0.0012 | 0.0025 |
| 1,4-二氧六环 1,4-Dioxane | Y=0.309X－0.118 | 7.6～76 | 0.9987 | 0.0038 | 0.0076 |
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Table 2. Recovery and precision of the method at three spiking levels
| 分析物Analyte | 加标水平Spikedlevel | 加入值Added(μg/mL) | 回收率Recovery(％) | 相对标准偏差RSD(%， n=6) |
| 1 | 240.0 | 95.5 | 1.2 | |
| 甲醇Methanol | 2 | 300.0 | 97.0 | 1.2 |
| 3 | 360.0 | 96.2 | 1.0 | |
| 乙醇Ethanol | 1 | 400.0 | 95.5 | 1.2 |
| 2 | 500.0 | 97.2 | 1.2 | |
| 3 | 600.0 | 97.4 | 0.9 | |
| 二氯甲烷Dichlorome- thane | 1 | 48.0 | 92.3 | 3.3 |
| 2 | 60.0 | 93.6 | 3.6 | |
| 3 | 72.0 | 94.0 | 0.8 | |
| 1 | 400.0 | 93.5 | 2.6 | |
| 乙酸乙酯Ethyl acetate | 2 | 500.0 | 94.3 | 3.1 |
| 3 | 600.0 | 93.8 | 0.9 | |
| 1 | 30.4 | 96.2 | 2.4 | |
| 1,4-二氧六环1,4-Dioxane | 2 | 38.0 | 97.2 | 1.4 |
| 3 | 45.6 | 98.1 | 0.8 | |
| 1 | 16.0 | 100.3 | 1.7 | |
| 吡啶Pyridine | 2 | 20.0 | 96.7 | 0.7 |
| 3 | 24.0 | 99.2 | 0.3 |
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Table 3. Determination results of residual solvents in real samples (%)
| 分析物Analyte | 1号样品Sample 1 | 2号样品Sample 2 | 3号样品Sample 3 |
| 甲醇 Methanol | 0.031 | 0.029 | 0.033 |
| 乙醇 Ethanol | ND | ND | ND |
| 二氯甲烷 Dichloromethane | 0.028 | 0.027 | 0.029 |
| 乙酸乙酯 Ethyl acetate | 0.09 | 0.085 | 0.09 |
| 1，4-二氧六环 1,4-Dioxane | ND | ND | ND |
| 吡啶 Pyridine | ND | ND | ND |
| ND: 未检出 (Not detectable)。 | |||
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