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  三价金属离子尤其是Cr³⁺、Fe³⁺和Al³⁺具有非常重要的生物学功能.细胞内Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺的浓度直接影响细胞功能, 进而影响整个代谢, 与人类健康息息相关.如人体内Cr³⁺的失衡会引发糖尿病和动脉硬化等多种疾病^[1], 参与人体细胞新陈代谢的Fe³⁺的失衡会导致贫血、肝损伤、肾衰竭等^[2].虽然Al³⁺不属于人体所必需的微量元素, 但平时过多摄入Al³⁺会引发老年痴呆^[3].因此, 快速检测三价金属离子势在必行.

  目前化学和生物领域通常采用X射线光电子能谱 (XPS)、原子光谱法、质谱法、电感耦合等离子发射光谱 (ICP) 等方法检测金属离子^[4].以上方法具有高效、迅速和精确等优点, 但是由于需要大型设备和复杂操作, 特别是在生物体内对相关离子和三价离子的识别, 具有很大的局限性.荧光分子探针因具有灵敏度高、选择性好、响应时间短、可直接观察等优点而被广泛应用于各种金属离子的检测.由于Fe³⁺和Cr³⁺的顺磁性, 使得很多荧光探针与Fe³⁺和Cr³⁺作用后, 表现为荧光淬灭, 严重影响检测的灵敏度^[5].罗丹明类染料由于其易与金属离子作用发生开环反应, 进而表现为荧光增强, 已经被广泛应用于分子探针设计.目前, 罗丹明类荧光探针多用于检测一种金属离子Ag⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺等, 作用和功能单一^[6]; 检测Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺需要采用不同的荧光探针, 增加了检测成本和检测时间.目前能够同时检测Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺高灵敏度、强抗干扰能力的荧光探针较少^[7].前期我们通过“点击化学”合成了苯并噻唑-罗丹明衍生物, 在甲醇溶液中对三价金属离子Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺具有很好的选择性^[8].然而, 在有机溶剂中检测金属离子限制了其广泛应用.因此, 本文拟增加罗丹明荧光探针的亲水性, 在罗丹明B上引入亲水基团醚链, 期望增强其亲水性的同时对金属离子还有一定的识别效果 (Eq. 1).

  1   结果与讨论

  1.1   荧光探针L对金属离子的选择性识别

  为了研究化合物L对金属离子的识别性能, 选择Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Ag⁺、Na⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺为研对象, 发现探针在甲醇/水[V:V＝8:2, c(Tris)＝10 mmol/L, pH＝7.2]体系中, 对M³⁺ (Fe³⁺、Cr³⁺、Al³⁺) 具有良好的选择性, 溶液颜色在加入M³⁺ (Fe³⁺、Cr³⁺、Al³⁺) 后由无色变为粉红色.测定紫外光谱, 我们发现化合物L溶液中加入M³⁺ (Fe³⁺、Cr³⁺、Al³⁺) 后, 吸收峰在565 nm处明显增强, 而化合物L本身及加入其它金属离子在565 nm处无吸收峰出现 (图 1A).随后我们也进行了荧光光谱的测试 (图 1B), 化合物L本身和其他金属阳离子并没有引发任何的荧光变化, 但在M³⁺ (Fe³⁺、Cr³⁺、Al³⁺) 存在时, 在590 nm处产生发射峰, 并伴随着强烈的橙色荧光.因此, 化合物L是对M³⁺ (Fe³⁺、Cr³⁺、Al³⁺) 具有高选择性的荧光增强型探针.

  图 1  加入不同金属离子化合物L(10 μmol/L) 的紫外光谱 (A) 和荧光光谱 (B) (λ_ex＝530 nm) Figure 1.  Absorbance (A) and fluorescence spectra (B) (λ_ex＝530 nm) of L (10 μmol/L) upon addition of different metal ions

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  1.2   共存离子的影响

  在化合物L与共存金属离子溶液中加入相同浓度倍量的Cr³⁺, 混合均匀后, 测试荧光变化.如图 2所示, 所有被加入的金属阳离子对其荧光发射强度几乎没有影响, 即化合物L与Cr³⁺作用的荧光强度几乎不受这些共存离子的干扰.同样, 对于Fe³⁺、Al³⁺, 化合物L与Fe³⁺、Al³⁺作用的荧光强度几乎不受这些共存离子的干扰.说明化合物L对三价金属离子Fe³⁺、Al³⁺、Cr³⁺识别具有较强的抗干扰能力.

  图 2  其它金属离子和Cr³⁺共存时探针L(10 μmol/L) 在CH₃OH/H₂O中荧光发射光谱的变化 (λ_ex＝530 nm) Figure 2.  Fluorescence emission spectrum of probe L(10 μmol/L) to Cr³⁺upon addition of various metal ions in CH₃OH/ H₂O (λ_ex＝530 nm)

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  1.3   不同浓度的Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺对化合物L光谱的影响

  在甲醇/水[V:V＝8:2, c(Tris)＝10 mmol/L, pH＝ 7.2]溶液中, 测定了不同Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺浓度条件下化合物L溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱.当Cr³⁺的浓度不断增加, 其最大紫外吸收 (550 nm) 和最大荧光发射 (590 nm) 强度不断增强. Fe³⁺和Al³⁺也有类似的变化规律, 当Cr³⁺浓度为探针L浓度的80 equiv.时, 紫外吸收和荧光强度达到最大值, 证明其达到饱和 (图 3).实验发现, 化合物L的紫外吸收和荧光强度与Cr³⁺浓度有较好的线性关系, 表明化合物L可以用于定量检测Cr³⁺浓度.同样的, 随着Al³⁺、Cr³⁺浓度的增加, 化合物L最大紫外吸收 (550 nm) 和最大荧光发射 (590 nm) 强度逐渐增强, 当Fe³⁺浓度为化合物L浓度的100倍、Al³⁺浓度为化合物L浓度的110倍时达到最高值.其中化合物L对Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺的紫外检测限分别为1.4×10^－4、9.5×10^－5和3.6×10^－4 mol/L; 荧光检测限分别为2.1×10^－4、2.3×10^－4和4.4×10^－4 mol/L.

  图 3  L (10 μmol/L) 中不同浓度Cr³⁺的紫外光谱 (A) 和荧光发射光谱 (B) 的变化曲线图 (λ_ex＝530 nm) Figure 3.  Absorbance spectrum (A) and fluorescence emission spectrum (B) of probe L in the presence of Cr³⁺ with different concentration (λ_ex＝530 nm)

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  1.4   pH对化合物L和L+M³⁺(Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺) 荧光光谱的影响

  为了考察溶液的pH对化合物L的荧光响应的影响, 实验测定了不同pH值的V(CH₃OH):V(Tris-HCl)＝1:1溶液的荧光强度. 图 4为化合物L及L+M³⁺分别在其最大发射波长 (590 nm) 处的荧光强度与pH关系曲线.可以看出, pH为2~8之间, L几乎没有荧光, 当加入了三价金属离子之后, 在pH为3~7之间, L的荧光强度大幅度增强.由此可见, 探针L在弱酸性和中性条件下可以实现对三价金属离子的检测.

  图 4  在三价金属离子存在或不存在的条件下, 探针L(10 μmol/L) 在不同pH值时荧光强度的变化 (λ_ex＝530 nm) Figure 4.  Change in fluorescence intensity of probe L (10 μmol/L) measured in the absence and presence of trivalent metals (λ_ex＝530 nm)

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  1.5   探针L试纸对Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺的识别

  将滤纸浸泡至L(1 mmol/L) 甲醇溶液中, 完全浸透后取出晾干.滴加Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺溶液至制备的试纸上, 在紫外灯 (365 nm) 照射下, 未滴加金属离子及与未浸泡L的空白滤纸均发出蓝色光, 为滤纸增白剂发出的光; 滴加三价金属离子的发出桔色荧光 (图 5), 表明探针L可以制备成试纸用以检测三价金属离子.

  图 5  检测三价金属离子试纸 Figure 5.  Paper test strips for trivalent ions detection

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  1.6   探针L和Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺的络合方式

  为了探索三价金属离子Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺与探针L之间的作用机理, 采用等物质的量的连续变化法 (Job’s Plot) 计算两者的络合比.随着Cr³⁺摩尔分数的不断改变, 体系的荧光强度在590 nm处随之变化 (图 6).当Cr³⁺摩尔分数为0.5时, 探针L与Fe³⁺形成的络合物在590 nm处出现最大的荧光强度, 说明探针L与Cr³⁺的结合比为1:1.同样的, Fe³⁺和Cr³⁺也有类似的结果, 结合比为1:1.为了探讨三价金属离子与探针的结合方式, 我们测试了探针L及加入Al³⁺ (4 equiv.) 的氢谱图 (图 7), 发现加入探针L后a和b氢的化学位移均向低场移动δ 0.08, 说明内酰胺的N和醚链中的O均参与L与三价金属离子的螯合; c氢的化学位移向高场移动δ0.06, 可能是由于螯合金属离子后内酰胺开环甲氧基中甲基移动至罗丹明结构中共轭体系的上方产生屏蔽作用.推测其络合机理可能如Eq. 2所示.探针L以内酰胺的结构稳定存在无荧光, 加入三价金属离子Fe³⁺、Al³⁺、Cr³⁺后内酰胺开环发出橙色荧光.

  图 6  探针L和Cr³⁺的Job曲线 (λ_ex＝530 nm) Figure 6.  Job's plot of probe L and Cr³⁺ (λ_ex＝530 nm)

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  图 7  探针L及L+Al³⁺在氘代甲醇中部分¹H NMR图 Figure 7.  Partial ¹H NMR spectra of L andL+Al³⁺ measured in CD₃OD

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  2   结论

  本文通过一步法成功将亲水基团醚链引入至罗丹明B结构上得到了一种荧光增强型探针L, 并对其结构进行了表征.测定了L在甲醇/水[V:V＝8:2, c(Tris)＝10 mmol/L, pH＝7.2]体系中的紫外和荧光光谱.研究发现荧光探针L对三价金属离子 (Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺) 具有很好的选择性和较高的灵敏度, 不受其它二价金属离子和一价金属离子的影响. L对Cr³⁺、Fe³⁺、Al³⁺的紫外检测限分别为1.4×10^－4、9.5×10^－5和3.6×10^－4 mol/L; 荧光检测限分别为2.1×10^－4、2.3×10^－4和4.4×10^－4 mol/L.

  3   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  500 NMR核磁共振仪 (德国Bruker公司); MALDI-TOF MS基质辅助飞行时间质谱仪 (Bruker attoflex Ⅲ smartbeam, Germany); 荧光分光光度计 (970CRT, 上海三科).

  苯并三氮唑-N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU) 购自阿拉丁, 其它试剂均为国产市售分析纯, 所有溶剂均经干燥处理.金属离子溶液用相应的盐溶于纯净水制得.

  3.2   化合物L的合成

  罗丹明B (479 mg, 1.0 mmol) 和2-甲氧基乙胺 (94 mg, 1.3 mmol) 溶解于干燥的二氯甲烷中, 加入苯并三氮唑-N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU) (568 mg, 1.5 mmol) 和三乙胺 (152 mg, 1.5 mmol).在室温下过夜反应, 薄层色谱 (TLC) 跟踪, 反应完全后, 浓缩柱层析得到白色固体349 mg, 收率为70.5%. m.p. 268.7~269.5 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.92 (dd, J＝6.8, 2.9 Hz, 1H), 7.44 (dd, J＝6.8, 2.9 Hz, 2H), 7.10 (dd, J＝6.8, 3.2 Hz, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.46 (s, 1H), 6.40 (br, 2H), 6.29 (br, 2H), 3.38~3.33 (m, 10H), 3.12 (s, 3H), 3.07 (t, J＝6.9 Hz, 2H), 1.18 (t, J＝7.0 Hz, 12H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 168.3, 153.7, 153.2, 148.7, 132.3, 131.0, 128.9, 127.9, 123.7, 122.8, 108.0, 105.6, 97.7, 69.3, 64.7, 58.4, 44.3, 39.1, 12.5. HRMS (ESI⁺) calcd for C₃₁H₃₈N₃O₃[M+H]⁺: 500.2908, found 500.2920.

  3.3   光谱测定方法

  化合物L以二甲基亚砜 (DMSO) 为溶剂配制成1.0×10^－3 mol/L的溶液, 然后用甲醇稀释成1.0×10^－5 mol/L溶液; 以二次蒸馏水为溶剂, 配制5×10^－3 mol/L的离子溶液 (ZnCl₂、Pb (NO₃)₂、Cu (NO₃)₂•3H₂O、FeCl₂• 4H₂O、NaCl、Fe (NO₃)₃•9H₂O、Cd (NO₃)₂•4H₂O、MnCl₂、Co (NO₃)₂•6H₂O、Ni (NO₃)₂•6H₂O、Cr (NO₃)₃•9H₂O、Al (NO₃)₃•9H₂O、AgClO₄、Ba (NO₃)₂、Sr (NO₃)₂、HgCl₂、KNO₃、MgCl₂), 以留备用.测试条件:室温, 样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英比色皿, 灵敏度3, 激发狭缝宽5 nm，发射狭缝宽10 nm, 激发波长λ_ex为530 nm, 于550~750 nm范围内检测荧光.

  辅助材料 (Supporting Information)探针L的¹H NMR、¹³C NMR和高分辨质谱图, 以及探针L对Fe³⁺、Al³⁺识别性能.这些材料可以免费从本刊网站 (http://sioc-journal.cn) 上下载.

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  图 1  加入不同金属离子化合物L(10 μmol/L) 的紫外光谱 (A) 和荧光光谱 (B) (λ_ex＝530 nm)

  Figure 1  Absorbance (A) and fluorescence spectra (B) (λ_ex＝530 nm) of L (10 μmol/L) upon addition of different metal ions

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  图 2  其它金属离子和Cr³⁺共存时探针L(10 μmol/L) 在CH₃OH/H₂O中荧光发射光谱的变化 (λ_ex＝530 nm)

  Figure 2  Fluorescence emission spectrum of probe L(10 μmol/L) to Cr³⁺upon addition of various metal ions in CH₃OH/ H₂O (λ_ex＝530 nm)

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  图 3  L (10 μmol/L) 中不同浓度Cr³⁺的紫外光谱 (A) 和荧光发射光谱 (B) 的变化曲线图 (λ_ex＝530 nm)

  Figure 3  Absorbance spectrum (A) and fluorescence emission spectrum (B) of probe L in the presence of Cr³⁺ with different concentration (λ_ex＝530 nm)

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  图 4  在三价金属离子存在或不存在的条件下, 探针L(10 μmol/L) 在不同pH值时荧光强度的变化 (λ_ex＝530 nm)

  Figure 4  Change in fluorescence intensity of probe L (10 μmol/L) measured in the absence and presence of trivalent metals (λ_ex＝530 nm)

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  图 5  检测三价金属离子试纸

  Figure 5  Paper test strips for trivalent ions detection

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  图 6  探针L和Cr³⁺的Job曲线 (λ_ex＝530 nm)

  Figure 6  Job's plot of probe L and Cr³⁺ (λ_ex＝530 nm)

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  图 7  探针L及L+Al³⁺在氘代甲醇中部分¹H NMR图

  Figure 7  Partial ¹H NMR spectra of L andL+Al³⁺ measured in CD₃OD

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