English

• 1.   引言

  氯霉素(CAP)是一种有效的广泛应用的酰胺醇类抗生素, 已发现对人类具有致命的、潜在的副作用, 如白血病、再生障碍性贫血和灰色婴儿综合征^[1~3].这些潜在的危害导致禁止CAP在中国、日本、加拿大、美国、澳大利亚、欧盟(EU)和其他一些国家将其用于动物食物中^[4].但由于廉价和高效, CAP仍被广泛用作治疗各种传染病的兽药.为了保护人类健康免受抗生素残留的危害, 欧盟(EU)还确立了CAP的最低残留限度(MRPL)为0.3×10^－6 g/kg^[5].因此, 需要一种快速、准确、简单且廉价的检测方法用于检测CAP.近年来已经建立了许多用于测定动物源性食品中CAP的分析方法, 如气相色谱(GC)^[6]、液相色谱(LC)^{[7, 8]}、液相色谱质谱(LC-MS)^{[9, 10]}和酶联免疫吸附试验(ELISA)^{[11, 12]}.但是这些方法耗时且操作复杂.因此, 开发一种对CAP残留物能够灵敏且快速的检测方法成为一项重要且实际的挑战.

  另外, 由于核酸适配体的特异性、简单性以及高灵敏度, 基于核酸适配体的方法早已被用于检测CAP^[13~16]. Miao的小组研究并报道了一种基于核酸适配体的比色法来检测氯霉素(CAP).通过与微量滴定板中的预先固定的捕获探针来固定CAP的核酸适配体.辣根过氧化物酶(HRP)通过生物素与抗生物素蛋白系统通过共价连接到核酸适配体上来产生荧光信号.成功实现CAP的定量测定, 检测范围为0.001~1000 ng/mL, 检出限为0.0031 ng/mL^[17]. Sharma的研究小组^[18]报道了一种纳米-核酸适配体荧光法, 通过单链寡核苷酸分子特异性结合CAP(核酸适配体), 用于保护合成的金纳米胶体免受盐诱导的聚集, 导致颜色变化.制备的纳米胶体粒径为7 nm, 浓度为1.83×10^－8 mol/L.该系统可在缓冲液中检测到高达0.55 pg/mL的CAP, 线性范围为0.55 pg/mL至55 μg/mL.

  最近, 氧化石墨烯(GO), 一种单原子、水溶性和二维纳米材料^[19], 由于其独特的电子、机械和热性能, 在众多研究领域引起更多的关注^{[20, 21]}.有发现表明GO的六角石墨单元可以与核苷酸通过π-π堆积相互作用结合, 但单链DNA与互补链杂交后产生的双链就不能被吸附在GO表面^{[22, 23]}.由于吸附在GO上的荧光团通过电子转移或能量转移机制能够有效猝灭, 并实现GO单链/双链DNA的吸附/解吸特性, 荧光团标记的核酸和GO被用于开发不同的光学生物传感器^{[24, 25]}.

  G-四聚体是富含G碱基对的序列通过Hoogsteen碱基互补配对原则而形成的空间立体核酸结构.可以通过配位阳离子(例如K⁺和Na⁺)来稳定四聚体结构.已经有很多课题组报道了由四聚体的结构而设计的诸多优良探针^[26~30].其中一些显示出对G-四聚体有很高的特异性识别能力, 而不同于单链DNA(ssDNA), 双链DNA(dsDNA)和三链DNA^[31].此外, G-四聚体结构可以与作为信号分子的ThT组合发出很强的荧光.硫磺素T/G-四聚体DNA系统已被广泛使用^{[32, 33]}.

  在此, 我们提出了一种简单, 快速, 无标记且灵敏的荧光方法, 基于氧化石墨烯(GO)荧光开关的功能性G-四聚体探针(FGP)来检测CAP. FGP由氯霉素核酸适配体和富含G碱基的核酸序列组成.核酸适配体用于结合CAP, 并且由富含G碱基的核酸序列在K⁺, Na⁺离子的作用下形成的G-四聚体, 然后与硫磺素T(ThT)结合后用作信号分子.在没有CAP的情况下, FGP通过π-π键堆积且相互作用被吸附到GO的表面上, 阻碍了G-四聚体的形成导致溶液中的荧光强度低.在加入CAP时, FGP的核酸适配体部分可识别并结合CAP并形成具有一定空间结构的复合物.因此, 游离的富含G的碱基序列可以形成G-四聚体结构并与ThT结合, 导致溶液的荧光强度增加.该方法简便易行, 具有较高的选择性和灵敏度, 并对实际样品进行了测试.

  2.   结果与讨论

  2.1   实验原理

  图式 1展示了检测CAP的方法.我们所设计的FGP探针包含了CAP适体和一部分富含G碱基的序列. CAP的核酸适配体是用于结合CAP, 然后由富含G碱基的序列形成的G-四聚体再与硫磺素T(ThT)结合后用作信号分子.在不存在CAP的情况下, FGP可以通过π-π键堆积作用被吸收到GO的表面上相互作用, 阻碍了富含G碱基的序列形成G-四聚体结构.因此, 背景的荧光强度很低.在加入CAP之后, FGP的核酸适配体部分可识别并结合CAP以形成靶标-FGP复合结构, 导致FGP能够从GO中解吸.使得富含G碱基的序列能够形成G-四聚体从而结合ThT染料, 达到荧光强度增强的目的.

  图式 1

  

  图式 1.  检测CAP的示意图

  Scheme 1.  Schematic drawing for the detection of CAP

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  2.2   可行性分析

  如图 1所示.在没有GO的情况下, 无论是否添加CAP, 荧光光谱都显示出比较高的荧光强度, 但是两者的差异不是很大.然而, 在添加GO后, 两者荧光强度都有大幅度降低且两者荧光强度差异较之前变化更大.结果说明该方法可用于有效地检测CAP.

  图 1

  

  图 1.  图中黑色柱(不含CAP)和红色柱(含有CAP)在有无GO的情况下的荧光强度对比.添加GO之后荧光强度对比.浓度: FGP, 100 nmol/L; CAP, 200 nmol/L; GO, 0.03 mg/mL; ThT, 10 μmol/L; K⁺, 40 mmol/L

  Figure 1.  Fluorescence intensity in the absence (black columns) and presence (red columns) of CAP with/without the subsequent addition of GO. Concentrations: FGP, 100 nmol/L; CAP, 200 nmol/L; GO, 0.03 mg/mL; ThT, 10 μmol/L; K⁺, 40 mmol/L. All data were collected from three measurements, and the error bars indicate the standard deviation

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  在最佳实验条件下, 将不同浓度的CAP(浓度范围在0~200 nmol/L)与FGP分别进行反应, 来测试这个方法的灵敏度.如图 2a所示, 荧光强度随着CAP浓度的增加而增加. 图 2b显示在0~20 nmol/L这个范围内, 荧光强度的上升与CAP浓度的增大成正比.

  图 2

  

  图 2.  (a) 不同浓度CAP存在时检测体系的荧光发射光谱.从底部到顶部四环素浓度依次为0, 2, 4, 8, 10, 20.0, 40.0, 60.0, 80.0, 100.0, 120.0, 150.0, 200.0 nmol/L. (b)检测体系的相对荧光强度比与CAP浓度的关系曲线, 插图表示CAP浓度在2 nmol/L至20 nmol/L范围内, 荧光强度比与CAP浓度呈线性关系.回归方程为y＝-0.0065x+0.9947, 相关系数为0.9959

  Figure 2.  (a) Fluorescence responses in the presence of different concentrations of CAP. From top to bottom: 0, 2, 4, 5, 8, 10, 20.0, 40.0, 60.0, 80.0, 100.0, 120.0, 150.0, 200.0 nmol/L CAP. (b) Relative fluorescence reduction ratio (F₀/F) of the method in the presence of different concentrations of CAP. The inset presents a linear relationship in the concentrations of CAP ranging from 2 nmol/L to 20 nmol/L. The regression equation was y＝-0.0065x+0.9947 with a correlation coefficient of 0.9959. Thioflavin T (10 µmol/L final concentration), FGP (100 nmol/L) and different concentrations of CAP were sequentially added to buffer (25 mmol/L Tris-HCl, containing 400 mmol/L NaCl, 40 mmol/L KCl, pH 7.5), and the fluorescence measurements (emitted at 492 nm) were performed

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  图 2导出的线性回归方程是y=-0.065x+0.9947 (R²＝0.9959), 其检测限(LOD)为1.45 nmol/L.与最近报道的相比, 它的检测限相对较低(表 1).

  表 1

  

  表 1  CAP检测方法对比

  Table 1.  Comparison of analytical methods for the detection of CAP

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  Method	Limit of detection	Linear range	Reference
  HPLC	0.25 mg/kg	—	[34]
  Fluorescence sensor	1 pmol/L	0.003~10 nmol/L	[35]
  Electrochemical detection	590 nmol/L	0.01~6 μmol/L	[36]
  Colorimetric	0.02 ng/mL	0.05~200 ng/mL	[37]
  Fluorescence sensor	1.45 nmol/L	2~20 nmol/L	This work

  3.   结论

  总之, 在这项研究中, 我们开发了一种基于氧化石墨烯(GO)简单的、快速的荧光方法来检测CAP.而且设计了一种荧光开关的功能性G-四聚体探针(FGP), FGP由CAP特异性核酸适配体和富含G碱基的序列组成.在没有CAP的情况下, FGP通过π-π键堆积作用被吸附在GO的表面.在存在CAP的情况下, FGP识别并绑定CAP以形成CAP-FGP, 由于FGP上富含一段G碱基的序列, 可以形成G-四聚体结构并且从GO表面解吸.且形成的G-四聚体结构之后结合ThT作为信号报道分子可以使得荧光强度明显增加.设计的FGP检测CAP的灵敏度范围在2至20 nmol/L, 检测限为1.45 nmol/L.该方法可用于检测食品中的CAP.

  4.   实验部分

  4.1   荧光分析

  首先, 在Tris-HCl缓冲溶液中(25 mmol/L, 400 mmol/L NaCl, 40 mmol/L KCl, pH 7.5)中加入FGP, 加热至88 ℃维持10 min, 然后逐渐冷却至室温待用.其次, 将1 μL探针(最终浓度100 nmol/L)和1 μL GO(最终浓度0.03 mg/mL)加入Tris-HCl缓冲液, 让混合物在37 ℃下反应1 h.然后将1 μL ThT(最终浓度为10 μmol•L^－1)加入体系并反应15 min.荧光光谱从450到600 nm, 激发波长为425 nm.

  4.2   样品预处理

  实验中使用的牛奶是从当地超市购买的, 在检测之前我们先将牛奶样品进行了处理.首先, 将7 mL氢氧化钠溶液与5 mL牛奶混合, 然后超声处理20 min.其次, 将pH调至等电点以除去蛋白质.再将溶液用转速为20000 r/min的离心机离心处理15 min, 以除去不溶性化合物.待离心完毕之后, 再收集上层清液将其pH值调节至7.5.最后将样品稀释10倍并测量CAP的浓度.

• 1. [1]

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  图式 1  检测CAP的示意图

  Scheme 1  Schematic drawing for the detection of CAP

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  图 1  图中黑色柱(不含CAP)和红色柱(含有CAP)在有无GO的情况下的荧光强度对比.添加GO之后荧光强度对比.浓度: FGP, 100 nmol/L; CAP, 200 nmol/L; GO, 0.03 mg/mL; ThT, 10 μmol/L; K⁺, 40 mmol/L

  Figure 1  Fluorescence intensity in the absence (black columns) and presence (red columns) of CAP with/without the subsequent addition of GO. Concentrations: FGP, 100 nmol/L; CAP, 200 nmol/L; GO, 0.03 mg/mL; ThT, 10 μmol/L; K⁺, 40 mmol/L. All data were collected from three measurements, and the error bars indicate the standard deviation

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  图 2  (a) 不同浓度CAP存在时检测体系的荧光发射光谱.从底部到顶部四环素浓度依次为0, 2, 4, 8, 10, 20.0, 40.0, 60.0, 80.0, 100.0, 120.0, 150.0, 200.0 nmol/L. (b)检测体系的相对荧光强度比与CAP浓度的关系曲线, 插图表示CAP浓度在2 nmol/L至20 nmol/L范围内, 荧光强度比与CAP浓度呈线性关系.回归方程为y＝-0.0065x+0.9947, 相关系数为0.9959

  Figure 2  (a) Fluorescence responses in the presence of different concentrations of CAP. From top to bottom: 0, 2, 4, 5, 8, 10, 20.0, 40.0, 60.0, 80.0, 100.0, 120.0, 150.0, 200.0 nmol/L CAP. (b) Relative fluorescence reduction ratio (F₀/F) of the method in the presence of different concentrations of CAP. The inset presents a linear relationship in the concentrations of CAP ranging from 2 nmol/L to 20 nmol/L. The regression equation was y＝-0.0065x+0.9947 with a correlation coefficient of 0.9959. Thioflavin T (10 µmol/L final concentration), FGP (100 nmol/L) and different concentrations of CAP were sequentially added to buffer (25 mmol/L Tris-HCl, containing 400 mmol/L NaCl, 40 mmol/L KCl, pH 7.5), and the fluorescence measurements (emitted at 492 nm) were performed

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  表 1  CAP检测方法对比

  Table 1.  Comparison of analytical methods for the detection of CAP

  Method	Limit of detection	Linear range	Reference
  HPLC	0.25 mg/kg	—	[34]
  Fluorescence sensor	1 pmol/L	0.003~10 nmol/L	[35]
  Electrochemical detection	590 nmol/L	0.01~6 μmol/L	[36]
  Colorimetric	0.02 ng/mL	0.05~200 ng/mL	[37]
  Fluorescence sensor	1.45 nmol/L	2~20 nmol/L	This work

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