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• 表面固定化特定蛋白的微纳米材料广泛应用在生物分子高通量筛选、蛋白相互作用分析和微流体催化等领域^[1-4]。相对于DNA固定化，蛋白固定化面临的技术挑战在于如何控制其偶联反应的位点选择性和蛋白取向一致性，从而尽可能保留被固定化蛋白的活性^[5-6]。显然，蛋白位点选择性固定化技术，尤其位点选择性共价固定化形成稳定加合物的技术最有价值^[7]。现有蛋白位点选择性固定化主要策略是：1)基于生物素与链亲和素高亲和力结合实现非共价固定化^[8]；此策略简单易行，但需大量链亲和素磁珠和蛋白生物素修饰试剂，应用成本很高。2)靶酶工程化，在其表面获得高选择反应性氨基酸，经酶催化或高选择性化学反应共价链接实现固定化，如通过点击化学反应固定化^[9]，此策略技术难度很大，实施过程漫长。3)基于融合标签的亲和标记实现共价固定化，如针对谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、脱卤酶(Halo)标签、组氨酸(His)标签的亲和标记^[10-13]。靶蛋白的融合表达很容易，且易于利用标签进行蛋白纯化，有望大量获得纯化靶蛋白，利于基于靶蛋白的高通量筛选潜在药物分子。将针对所选融合标签的高选择性亲和标记试剂偶联到亲水材料表面，容易实现针对靶蛋白的位点选择性固定化。因此，发展针对融合标签的亲和标记固定化技术有重要意义。

  本课题组发展了磁珠固定化靶蛋白筛选配体混合物库的方法^[14-16]，对快速发现混合物中高亲和力配体有显著价值，但其应用需消耗大量固定化在亲水磁珠上的靶蛋白，特别地要求靶蛋白与磁珠的加合物对疏水小分子的非特异结合要尽量低。日本血吸虫GST(Schistosoma japonicum GST, sjGST)作为融合表达标签适于亲和纯化靶蛋白并具有一定的增溶能力，被广泛应用于相对分子质量较小的真核靶蛋白在原核系统大量低成本可溶表达及纯化。已有基于sjGST自催化或化学反应实现sjGST及其融合蛋白的位点选择性固定化策略，可用于融合蛋白标记后荧光定量、蛋白微阵列芯片生物大分子筛选等^{[8-9, 17-18]}。sjGST为二聚体，有两个大体积的疏水底物结合位点。现已报道sjGST标记试剂均为单个位点结合和标记，磁珠偶联标记固定化二聚体sjGST时由于空间位阻，容易出现二聚体中有一个活性未标记而造成固定化sjGST存在疏水结合位点，所得蛋白-磁珠加合物对疏水小分子的非特异性结合增加，妨碍用这类靶蛋白与磁珠的加合物筛选混合物组合库。因此，理想的GST亲和试剂，需要亲和力高实现快速特异性结合、含活泼官能团能与GST活性位点附近氨基酸残基共价修饰增加标记稳定性、能同时封闭二聚体sjGST的双疏水位点以减少药物筛选中的假阳性，且制备成本低。由此，设计sjGST的二价亲和标记试剂^[19]，即将大体积疏水定位基团通过对称柔性臂连接形成对称二价亲和标记试剂并添加活泼官能团，实现对sjGST二聚体双疏水结合位点同时标记，有望同步封闭两个活性位点的疏水中心。目前，嘌呤链接的苯磺酰氟对sjGST单活性位点酪氨酸的标记效果较好，标记反应可在6 h完成，且条件温和，选择性较高^[18]。但嘌呤链接的苯磺酰氟试剂昂贵，合成困难，更重要的是在此基础上设计二价亲和标记试剂相对分子质量太大，柔性有限，难以实现双位点同时标记。

  本文利用易得双苯环结构为疏水定位基和溴乙酰基为巯基修饰基团，并以对称线性双胺连接臂上氨基为与磁珠偶联基团，设计对应的sjGST二价标记试剂(Scheme 1)，初步证明此二价亲和标记试剂功能化磁珠可应用于sjGST的固定化，且固定化sjGST磁珠对疏水小分子结合很弱。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis of the divalent affinity labeling reagent

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  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  Avance DRX-400MHz型核磁谱仪(NMR，德国Bruke公司); Esquire 6000型液相色谱/质谱联用仪(LC/MS, 德国Bruker公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(UV-Vis, 日本岛津公司)；NIKON TE2000-U型倒置相差荧光显微镜(日本尼康公司)；Agilent Cary Eclipse型荧光分光光度计(美国安捷伦公司)。

  还原性谷胱甘肽(GSH)、GSH-sepharose 4B、2, 4-二硝基氯苯(CDNB)、8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐(ANS)购自美国Sigma-Aldrich公司；1, 2-二溴乙烷、对甲氧基苯酚和N, N-二甲基氨基甲酰胺(DMF)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-羟基琥珀酸亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC)、甘氨酸乙酯盐酸盐和4-N, N-二甲氨基吡啶(DMAP)购自购于东京仁成工业株式会社；对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, PNPP)购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；以上试剂均为分析纯。大肠杆菌碱性磷酸酶(ECAP)本实验室制备。羧基磁珠(MSP-COOH-F1)由重庆博蓝鹰生物有限公司提供。

  1.2   亲和标记试剂的制备

  1.2.1   对甲氧基苯氧乙基溴(1)

  对甲氧基苯酚(5 g, 40 mmol)与1, 2-二溴乙烷(15.04 g, 80 mmol)悬浮于24 mL水中，加入12 mL 40%(质量分数)的NaOH水溶液，80 ℃，反应24 h。冷却后，加水100 mL，乙酸乙酯萃取(50 mL×3)，合并有机层，依次用10%(质量分数)的NaOH洗涤(50 mL×2)和水洗(50 mL×2)，硅胶柱层析纯化，石油醚洗脱，得白色固体6.5 g，产率70.3%，mp 51~52 ℃。

  1.2.2   N-对甲氧基苯氧乙基甘氨酸乙酯(2)的合成

  化合物1 (5.78 g, 25 mmol)、甘氨酸乙酯盐酸盐(6.98 g, 50 mmol)和碳酸钾(6.9 g, 50 mmol)，在100 mL乙腈中回流反应24 h。室温过滤收集滤液，减压浓缩，100 mL乙酸乙酯溶解，水洗(50 mL×2)，去溶剂得粗品，黄色液体6.2 g，直接用于下一步。

  1.2.3   二碳酸二叔丁酯[(Boc)₂O]保护对氨基苯甲酸

  对氨基苯甲酸(6.85 g, 50 mmol)和三乙胺(7.57 g, 75 mmol)溶于100 mL 1, 4-二氧六环和50 mL水中，加入(Boc)₂O(16.35 g, 75 mmol)，室温反应过夜。减压蒸除溶剂，得无色液体，加入3 mol/L HCl酸化，过滤收集白色固体，用水洗至中性，烘干即得Boc保护对氨基苯甲酸10.7 g，产率90%，mp 202~203 ℃。

  1.2.4   N-对甲氧基苯氧乙基-N′-叔丁氧甲酰胺基苯甲酸甘氨酸乙酯(3)及其酸(4)

  Boc保护对氨基苯甲酸(4.74 g, 20 mmol)，EDC(5.75 g, 30 mmol)，DMAP(0.24 g, 2 mmol)于20 mL DMF中冰浴反应10 min，加入化合物2 (4.9 g, 20 mmol)室温反应过夜。加水150 mL，乙酸乙酯萃取(30 mL×3)，有机层依次用1 mol/L HCl、饱和NaHCO₃、水洗涤，减压浓缩得化合物3粗品；用20 mL乙醇溶解后，加50 mmol NaOH溶于20 mL水溶液，室温反应2 h。减压除去溶剂，加水50 mL，乙酸乙酯洗涤，水层用1 mol/L HCl酸化到pH值1.0~2.0，乙酸乙酯萃取，有机层水洗，硅胶柱纯化，用V(石油醚): V(乙酸乙酯)=1: 1~1: 2的混合溶剂洗脱，得化合物4的无色粘稠状液体5.1 g，产率57.4%。

  1.2.5   单价标记试剂(Br-Ⅰ)

  化合物4 (4.44 g, 10 mmol)溶于20 mL二氯甲烷，加入7 mL三氟乙酸，室温反应4 h，减压除去溶剂，加水20 mL，用饱和NaHCO₃调节至中性，收集白色固体，烘干得化合物5，2.7 g，产率80%，mp 175~176 ℃。全部溶于20 mL四氢呋喃，加入三乙胺(3.03 g, 30 mmol)，置于冰浴下反应10 min，在冰浴下缓慢滴加溴乙酰溴(4.04 g, 20 mmol)的5 mL四氢呋喃溶液，滴加完后在室温下反应2 h。减压除去反应溶剂，硅胶柱纯化，用V(石油醚): V(乙酸乙酯)=1: 1~1: 2的混合溶剂洗脱，得单价标记试剂(Br-Ⅰ)白色固体2.4 g，产率71%，mp 151~152 ℃。

  1.2.6   二价标记试剂(Br-Ⅱ)

  单价标记试剂Br-Ⅰ(0.93 g, 2 mmol)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.25 g, 2.2 mmol)溶于10 mL四氢呋喃，冰浴下反应10 min，冰浴下缓慢滴加二环己基碳二亚胺(DCC)(0.45 g, 2.2 mmol)与5 mL四氢呋喃的溶液，滴加完后室温反应过夜。过滤除去不溶物，减压除去溶剂，加入二氯甲烷10 mL，冰浴下缓慢滴加二氨乙基胺(0.103 g, 1 mmol)与5 mL二氯甲烷的溶液，室温反应3 h。硅胶柱层析纯化，用V(二氯甲烷): V(甲醇)=100: 1~100: 10的混合溶剂洗脱，得白色固体0.22 g，产率22%，mp 186~187 ℃。Br-Ⅱ(C₄₄H₅₁Br₂N₇O₁₀), ¹³C NMR(600 MHz, DMSO), δ:172.6, 169.6, 165.7, 154.0, 151.3, 139.4, 130.1, 128.1, 119.4, 115.7, 115.0, 75.4, 58.2, 52.8, 50.4, 47.5, 45.6, 35.6;¹H NMR(600 MHz, DMSO), δ:8.43(s, 2H), 8.17(s, 2H), 7.3~7.6(m, 8H), 6.7~6.8(m, 8H), 4.7(s, 8H), 4.1(s, 4H), 3.6~3.7(s, 10H), 3.3(s, 4H), 2.5(s, 4H), 2.3(s, 1H); [M+H]⁺高分辨质谱实测998.0549，计算值为998.0724。

  1.3   目标化合物对sjGST的标记

  1.3.1   sjGST的重组表达

  重组表达sjGST参照文献[20]的方法，经GSH-Sepharose 4B亲和纯化。

  1.3.2   连续跟踪sjGST催化显色底物CDNB和GSH反应测定活性

  用Bradford法测定蛋白含量^[21]。用Habig法测定sjGST活性^[22]：反应缓冲液为20 mmol/L pH=6.5磷酸盐。在1.0 mL反应体系中，依次加入终浓度1.0 mmol/L的GSH和CDNB，10 nmol/L sjGST，控制有机溶剂含量在5%以下，混匀后延时10 s, 340 nm波长下测定反应启动后20~80 s的紫外吸收，以吸光度随时间的变化速率计算酶的活性，以1 min催化生成1 μmol产物的酶量为1个活性单位。

  1.3.3   Br-Ⅱ及其与GSH酶催化原位生成加合物对sjGST半抑制浓度(IC₅₀)

  用1.0 mL上述测定体系，分别测定标记试剂自身及其与GSH酶催化加合物的IC₅₀：1)依次先加入CDNB、Br-Ⅱ和sjGST，最后再加入GSH测定标记试剂自身IC₅₀；2)将sjGST、GSH和Br-Ⅱ预先反应10 min，再加入CDNB，测定原位生成GSH加合物IC₅₀。测定不同浓度Br-Ⅱ存在时初速度对无Br-Ⅱ存在时初速度的比值为剩余活性比例，其与1.0之差为抑制率；回归分析抑制率约35%~65%的数据测定抑制剂的IC₅₀。

  1.3.4   标记失活速率常数(k_inact)

  在250 μL 20 mmol/L pH=6.5磷酸盐缓冲液中，sjGST的终浓度为1.0 μmol/L，分别与终浓度为100和1.5 μmol/L的Br-Ⅱ孵育0~20 min和0~7 h，经每1和10 min取样10 μL，立即加入终浓度1.0 mmol/L的CDNB和GSH，测定活性，作剩余活性随时间的响应曲线，用指数模型拟合分析Br-Ⅱ不可逆标记速率，低浓度时用二级动力学模型拟合分析。在相同体系中，先加入终浓度1.0 μmol/L sjGST与100 μmol/L Br-Ⅱ并同时加入1.0 mmol/L GSH孵育0~10 min，经每0.5 min取10 μL，再加入CDNB测定活性与标记时间的响应曲线，同法分析Br-Ⅱ与GSH原位生成加合物的可逆标记速率。

  1.3.5   据剩余酶活性对标记试剂Br-Ⅱ量响应测定结合比

  在250 μL反应体系中，1.0 μmol/L sjGST分别与不同浓度的Br-Ⅱ孵育12 h后，取样10 μL，加入CDNB和GSH双底物测定剩余活性。作反应速率与浓度响应曲线；对初始线性阶段的作回归分析并延长；对Br-Ⅱ过量2倍以上数据回归分析并延长，两条延长线的交点为Br-Ⅱ与sjGST的结合比。

  1.3.6   荧光滴定表征Br-Ⅱ与GSH加合物对sjGST的结合比

  设置激发和发射狭缝宽度为10 nm，光电倍增管的电压为“中”。参照文献[19]的方法，在3.0 mL总反应体系中，固定sjGST浓度为0.5 μmol/L，固定GSH浓度为2.0 μmol/L，加入浓度梯度的Br-Ⅱ溶液，温和混匀30 s后，孵育10 min，经荧光光谱扫描，以在280 nm激发测定340 nm荧光信号，作荧光对浓度响应曲线，按1.3.5节相同作图法测定标记试剂GSH加合物与sjGST的结合比。

  1.4   磁珠偶联Br-Ⅱ对sjGST的固定化及表征

  1.4.1   Br-Ⅱ偶联磁珠(D-MSP)的制备

  25 mg羧基磁珠用4 mL DMF重悬，加入0.3 g DCC，取1 mL 2.0 mmol/L Br-Ⅱ的DMF溶液，250 r/min搅拌室温反应12 h，DMF洗涤3次得偶联Br-Ⅱ的磁珠(D-MSP)。

  1.4.2   磁珠偶联Br-Ⅱ对sjGST的不可逆固定化动力学及其固定化容量

  在6组200 μL 20 mmol/L pH=6.5磷酸盐缓冲液反应体系中，加入D-MSP 100 μg和sjGST 10 μg，设10 μg sjGST空白对照。分别孵育0.5~8 h后，小心地磁分离取上清，磁珠用缓冲液(100 μL×2)洗涤合并上清液。以MSP-COOH-F1代替D-MSP，按上述相同操作测定磁珠本身对sjGST的非特异性结合。各组取200 μL上清到石英测量杯中，激发和发射狭缝宽度为10 nm，光电倍增管的电压为“中”，测定荧光信号与空白荧光信号所对应蛋白量之差，扣除MSP-COOH-F1代替D-MSP操作所得非特异结合并校正洗涤稀释效应即为共价固定化蛋白量，其与时间的响应曲线用动力学模型拟合计算其速率常数。并估算达饱和时表观固定化容量。

  1.4.3   D-MSP自催化可逆固定化sjGST动力学及其固定化容量

  Br-Ⅱ偶联磁珠在过量GSH存在下sjGST催化原位生成加合物对sjGST可逆固定化。在6组200 μL 20 mmol/L pH=6.5磷酸盐缓冲液中，平行加入D-MSP 100 μg、sjGST 10 μg、100 μmol/L的GSH，设单独sjGST空白对照。孵育5~60 min后，磁分离取上清，缓冲液(100 μL×2)小心洗涤磁珠，合并上清液。各组上清液取200 μL测定荧光信号，同上计算其速率常数及估算表观固定化容量。

  1.4.4   SDS-PAGE检测D-MSP对sjGST的固定化

  在3组200 μL含D-MSP 200 μg的缓冲液中，分别单独加sjGST 20 μg，合并加入sjGST 20 μg及终浓度为1 mmol/L GSH 10 μL；设MSP-COOH-F1 200 μg和sjGST 20 μg为非特异结合对照组；各组平行反应6 h，磁分离取磁珠，用缓冲液(100 μL×2)小心洗涤后，再经SDS-PAGE上样缓冲液煮沸磁珠10 min，取上清液进行SDS-PAGE，与2 μg sjGST对照比较变性洗脱蛋白量。

  1.4.5   D-MSP对碱性磷酸酶的非特异性结合

  在4组200 μL的10 mmol/L pH=7.4的HEPES缓冲液中，1组取100 μg MSP-COOH-F1加10 μg ECAP；另3组取100 μg D-MSP，分别加ECAP 10 μg，sjGST 10 μg与ECAP 10 μg混合物，sjGST 10 μg、ECAP 10 μg及终浓度1 mmol/L GSH。各组平行反应6 h，小心地磁分离得磁珠，磁珠用缓冲液(100 μL×2)小心洗涤，测定磁珠上碱性磷酸酶活性，以此计算各组碱性磷酸酶的吸附量：每组磁珠分别取出10 ng，加入PNPP(10 mmol/L) 200 μL，同时取ECAP 2 ng加入PNPP(10 mmol/L) 200 μL作为阳性对照，单独PNPP(10 mmol/L) 200 μL作为阴性对照，反应30 min后加入NaOH(1 mmol/L) 50 μL淬灭反应，磁分离磁珠后，取200 μL经酶标仪读取其在405 nm处的吸光度测定磁珠上碱性磷酸酶活性，检测其对ECAP非特异性吸附量^[23]。

  1.4.6   D-MSP及sjGST固定化磁珠对疏水小分子的非特异性吸附

  按1.4.4节方法用D-MSP对sjGST共价和不可逆固定化得相应sjGST固定化磁珠，用ANS考察磁珠固定化前后对小分子的非特异结合：在6组200 μL反应体系中，2组均取D-MSP 100 μg，其一加入10 μL终浓度为1 mmol/L的GSH处理30 min；2组取sjGST共价固定化磁珠100 μg，其一用10 μL终浓度为50 μmol/L的Br-Ⅰ和10 μL终浓度为1 mmol/L的GSH处理30 min；再两组取sjGST可逆固定化磁珠100 μg，其一用10 μL终浓度为50 μmol/L的Br-Ⅰ和10 μL终浓度为1 mmol/L的GSH处理30 min。各组磁珠用等量缓冲液小心洗涤3次，均加入终浓度为10 μL 25 μmol/L的ANS孵育30 min，小心地磁分离并用缓冲液200 μL小心洗涤后重悬，取少量涂于载玻片置于荧光显微镜400倍镜下分别用白光和荧光观察拍照，曝光时间均为1 s。

  1.4.7   固定化sjGST D-MSP的稳定性考察

  新制sjGST固定化磁珠分组重悬于200 μL缓冲液中，在0~120 min分别常温搅拌不同时间后，小心地磁分离并洗涤合并上清。各组取上清200 μL于荧光分光光度计在280 nm激发测定340 nm荧光信号计算上清sjGST蛋白量，做时间曲线。

  2.   结果与讨论

  2.1   游离试剂的标记失活速率常数(k_inact)

  所合成化合Br-Ⅱ核磁鉴定为目标结构(见实验部分)。Br-Ⅱ含两个疏水芳环，预期结合sjGST活性中心内的疏水底物结合位点，其作用是疏水定位基。Br-Ⅱ同时含溴乙酰基，若其疏水定位基与sjGST活性中心内疏水位点亲和力足够强，则在疏水基团引导下Br-Ⅱ进入sjGST活性位点后可与活性位点附近羟基或巯基(C85, C138, C169, C178)发生亲核取代实现共价标记。若与Br-Ⅱ同时加入过量GSH，sjGST催化结合在活性位点的Br-Ⅱ与GSH原位生成加合物作为产物以更强亲和力同时结合在两个活性中心且解离很慢，发生Br-Ⅱ与GSH加合物对sjGST的缓慢紧密结合的可逆标记但表现类似共价标记，此时可测定未标记sjGST的活性以跟踪高亲和力双位点结合的过程^[19]。

  分析剩余酶活性对反应时间的响应能获得共价标记和可逆亲和结合的近似速率常数k_inact(图 1)。无GSH时，1.0 μmol/L sjGST与活性位点浓度相当的Br-Ⅱ共价标记速率常数为0.0078 min^-1，标记完成需约6 h且标记后剩余约25%活性；增加Br-Ⅱ浓度到活性位点浓度100倍时，共价标记速率常数提高到0.24 min^-1，仅需15 min标记接近完成且标记后仍剩余10%活性。二价标记试剂Br-Ⅱ浓度为活性位点浓度100倍时，同时加入1.0 mmol/L GSH生成产物对应的可逆亲和结合速率为0.73 min^-1，需约5 min标记接近完成且标记后剩余10%活性。标记产物的剩余活性可能是空间位阻造成活性中心未被完全占据。总体而言，所设计的Br-Ⅱ游离状态下对sjGST亲和标记的速度较快。

  图 1

  

  图 1.  Br-Ⅱ与sjGST的反应速度常数

  Figure 1.  k_inact labeling to sjGST by Br-Ⅱ in sodium phosphate buffer at pH=6.5, with Br-Ⅱ at 1.5 μmol/L plus GSH 1.0 mmol/L(A), Br-Ⅱ at 100 μmol/L(B) plus GSH 1.0 mmol/L and Br-Ⅱ at 100 μmol/L plus GSH 1.0 mmol/L(C)

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  2.2   游离Br-Ⅱ及其与GSH加合物对sjGST的半抑制浓度(IC₅₀)

  根据文献[19]，双依他尼酸(烯酮)与GSH在酶催化下10 min反应完全。在10 nmol/L sjGST催化下，不同浓度Br-Ⅱ与过量GSH 10 min内能反应完全。因此，按2种加样方式分别近似测定Br-Ⅱ本身及其与GSH加合物对sjGST的半抑制浓度(图 2)。1)先混合Br-Ⅱ、sjGST、CDNB 5 s后，再加GSH，延迟20 s跟踪吸收变化，获得Br-Ⅱ本身对GST共价标记的信息。2)先混合Br-Ⅱ、sjGST、GSH反应10 min，再加CDNB并补充GSH，延迟20 s跟踪吸收，获得产物可逆结合的信息。分析抑制率30%~60%区间数据发现，Br-Ⅱ本身半抑制浓度为(22±0.2) μmol/L(n≥3)，Br-Ⅱ与GSH加合物半抑制浓度(0.41±0.06) μmol/L(n≥3)。可见Br-Ⅱ与GSH加合物比Br-Ⅱ本身对sjGST抑制作用强50倍，这可能是用Br-Ⅱ产物能更快形成复合物的原因之一。

  图 2

  

  图 2.  Br-Ⅱ及其原位生成GSH加合物对sjGST的IC₅₀

  Figure 2.  IC₅₀ of Br-Ⅱ and its GSH conjugate for sjGST with method A(GSH was added last) and method B(CDNB was added at last), respectively

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  2.3   通过剩余酶活性对抑制剂响应测定Br-Ⅱ对GST的结合比

  不同浓度Br-Ⅱ与活性位点终浓度为1.0 μmol/L的sjGST反应12 h以保证标记反应达到平衡后，测定sjGST的剩余活性(图 3)。可见，随着标记试剂Br-Ⅱ量的增加，sjGST剩余活性逐渐降低直至不再改变(即饱和)。对剩余活性随Br-Ⅱ浓度线性降低部分作线性回归直线并延长，同时对剩余活性随Br-Ⅱ浓度基本不变部分作线性回归并延长；两条回归直线延长线的交点即近似为结合化学计量点。结果显示，Br-Ⅱ与sjGST二聚体的结合的化学计量接近1: 1，支持Br-Ⅱ与sjGST为二价结合。

  图 3

  

  图 3.  标记试剂与sjGST的结合比

  Figure 3.  Labeling ratio of Br-Ⅱ to sjGST dimer fixed at 1 μmol/L in phosphate buffer at pH=6.5

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  图 4

  

  图 4.  Br-Ⅱ原位生成加合物对sjGST的荧光淬灭及结合比

  Figure 4.  Fluorescence spectra for recording GSH conjugation of Br-Ⅱ at final 1.0 μmol/L(A), Br-Ⅱ at varying concentrations(B), and binding ratio of GSH conjugate of Br-Ⅱ to sjGST dimmer fixed at 0.5 μmol/L in the presence(square) and the absence(triangle) of GSH(C)

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  2.4   荧光猝灭检测Br-Ⅱ与GSH在酶催化原位生成加合物对GST的结合比

  蛋白质含色氨酸残基，通常在280 nm激发下产生340 nm的荧光，称为蛋白自身荧光；sjGST也有色氨酸残基故有自身荧光^[19]；Br-Ⅱ及其与GSH在酶催化原位生成加合物结合在sjGST活性中心结合，可与sjGST分子内色氨酸残基发生静态猝灭使sjGST本身的荧光减弱。Br-Ⅱ直接与sjGST结合后荧光响应较缓；Br-Ⅱ与过量GSH在酶催化原位生成加合物对sjGST结合亲和力高，显著降低sjGST自身荧光(图 4A和4B)。用过量GSH、sjGST在340 nm荧光随Br-Ⅱ量的增加逐渐降低至定值，据此发现Br-Ⅱ与GSH加合物与sjGST二聚体结合比也为1: 1(图 4C)，也支持Br-Ⅱ与GSH加合物对GST为二价结合。

  2.5   磁珠偶联Br-Ⅱ对sjGST的可逆及不可逆固定化

  磁珠表面带延长臂的羧基与5倍的Br-Ⅱ亚氨基在DCC作用下缩合反应12 h，洗涤多余标记试剂，得偶联二价标记试剂的磁珠(D-MSP)。此功能化磁珠与理论结合量10倍的sjGST反应0.5~8 h，洗涤后合并上清液，分析sjGST的荧光，计算其剩余蛋白量，与不加偶联磁珠的sjGST对照组的差值为固定化蛋白量，并扣除羧基磁珠对sjGST的非特异结合，为特异性固定化蛋白量(图 5A)。结果表明，共价固定化需约6 h才能完成，磁珠D-MSP对sjGST固定化容量为(24±2) mg/g(n=2)。磁珠D-MSP加10倍结合容量sjGST和100 μmol/L的GSH，酶催化Br-Ⅱ与GSH迅速生成加合物用于对sjGST的可逆固定化(图 5B)；可逆固定化sjGST达稳态所需时间约为45 min，固定化容量约为(26±2) mg/g(n=2)。可见，自催化产物用于sjGST可逆固定化的速度更快，且两种方式下D-MSP对sjGST的固定化容量无显著差异。

  图 5

  

  图 5.  Br-Ⅱ偶联磁珠不可逆固定化(A)及可逆固定化(B)的固定化动力学及容量

  Figure 5.  Kinetics and capacity of 100 μg D-MSP for in irreversal or reversal immobilization of 10 μg sjGST in the absence(A) and the presence(B) of GSH at 100 μmol/L, respectively

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  2.6   SDS-PAGE检测D-MSP对sjGST的可逆与不可逆固定化

  D-MSP直接固定化sjGST时，两个活性中心同步固定化。高温变性蛋白时被固定化蛋白难以被SDS溶解而释放。D-MSP自催化产物固定化sjGST是可逆固定化，高温变性蛋白后会被SDS溶解而释放。将两种方法固定sjGST的磁珠用SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10 min后，取上清用SDS-PAGE检测其蛋白释放情况(图 6)。D-MSP直接固定化sjGST后，热变性时释放的酶蛋白量(条带3)与羧基磁珠MSP-COOH-F1对sjGST非特异性吸附量(条带4)相当；相反，在GSH存在下自催化固定化酶在热变性时释放20 mg/g磁珠的固定化蛋白，接近于磁珠对GST固定化容量。这些结果支持D-MSP加GSH在酶催化下固定化sjGST属于可逆固定化，而不加GSH直接固定化为共价固定化。

  图 6

  

  图 6.  SDS-PAGE检测D-MSP对sjGST可逆及不可逆固定化

  Figure 6.  SDS-PAGE detection of reversible or irreversible immobilization of 10 μg sjGST to 100 μg D-MSP in the absence and the presence of GSH at 1.0 mmol/L(lanes 3 and 5, respectively), with the references of sjGST lonely(lanes 1 and 2), and the non-covalent adsorption of 10 μg sjGST on 100 μg MSP-COOH-F1(lane 4)

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  2.7   比较D-MSP及羧基磁珠对蛋白的非特异性吸附

  吸附在磁珠表面的ECAP活性可测(图 7)。结果显示，对10 μg ECAP，用100 μg羧基磁珠MSP-COOH-F1和D-MSP所得对ECAP的非特异性吸附量均接近0.04 μg，接近等量D-MSP对sjGST固定化量的2%。用100 μg D-MSP对10 μg ECAP和10 μg sjGST的混合物进行直接固定化，或同时加过量GSH进行混合物可逆固定化，所得固定化ECAP酶量略有增加，均约1.2 mg/g磁珠，占其对sjGST饱和固定化容量的5%。初步说明Br-Ⅱ偶联磁珠对sjGST的固定化有特异性，为sjGST亲和标记试剂。

  图 7

  

  图 7.  D-MSP固定化sjGST同时对ECAP的非特异吸附

  Figure 7.  Non-specific binding of ECAP, on 100 μg D-MSP after immobilization of 10 μg sjGST in the absence or the prescence of final 1.0 mmol/L GSH, comparing with 10 μg ECAP lonely on 100 μg D-MSP

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  2.8   D-MSP固定化sjGST后对小分子的非特异性吸附

  用Br-Ⅱ功能化后磁珠表面疏水性相对于羧基磁珠显著增强；D-MSP固定化sjGST时，除非所有活性中心的疏水底物结合位点被完全封闭，否则也会剩余疏水位点。来自这两种情况的疏水位点，对用此类固定化融合靶蛋白磁珠筛选小分子配体库时，均会出现对小分子的非特异性吸附干扰。对D-MSP固定化sjGST，剩余的sjGST疏水位点可能用游离的单价抑制剂Br-Ⅰ和GSH形成产物对其进行封闭，从而减少其非特异性吸附。ANS是一种疏水位点荧光探针，也是GST的疏水配体^[24]。D-MSP对ANS有弱结合故显微弱荧光，但用GSH处理D-MSP后结合ANS显著减少而基本不显荧光(图 8A和8B)；D-MSP共价固定sjGST后对ANS结合明显增强，但用Br-Ⅰ和GSH联合处理后结合明显减弱(图 8C和8D)，可见D-MSP固定化sjGST剩余有疏水配体结合位点。D-MSP可逆固定sjGST后对ANS结合很弱；再进一步用GSH和Br-Ⅰ处理后剩余结合能力不变(图 8E和8F)。可见，用此Br-Ⅱ与GSH加合物可逆固定sjGST及其融合靶蛋白能更有效地封闭两个疏水结合位点，有利于减少小分子的非特异性吸附，但需保证可逆固定化蛋白的稳定性。

  图 8

  

  图 8.  D-MSP及其固定化sjGST后对小分子ANS的非特异性吸附

  Figure 8.  Non-specific binding of small molecule of ANS to D-MSP immobilized sjGST detected by the fluorescence spectrophotometer, after 0.5 h-incubation of 25 μmol/L ANS with 100 μg D-MSP lone(A), after 1.0 mmol/L GSH treatment(B), 100 μg sjGST immobilization(C), 100 μg sjGST immobilization in the presence of 1.0 mmol/L GSH plus excessive Br-Ⅰ(D), 100 μg sjGST immobilization in the presence of 1.0 mmol/L GSH(E), 100 μg sjGST immobilized in the presence of 1.0 mmol/L GSH plus excessive Br-Ⅰ and GSH(F). The corresponding white light views were shown in Fig. 8A′~8F′

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  2.9   D-MSP可逆固定化sjGST的稳定性

  D-MSP自催化可逆固定化sjGST完成后，再加入反应缓冲液在室温下继续孵育检测其上清液中sjGST荧光强度(图 9)。用磁珠固定化靶蛋白筛选配体的操作过程约1 h。在1.5 h内，从100 μg磁珠固定化sjGST(约2.4 μg sjGST蛋白)中解离的蛋白量在0.5 μg以下(图 9)。可见，D-MSP自催化可逆固定化sjGST在常温下1.5 h内具有较高稳定性。

  图 9

  

  图 9.  D-MSP可逆固定化sjGST的稳定性

  Figure 9.  Stability of reversible immobilization of D-MSP to sjGST in sodium phosphate buffer at pH=6.5

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  3.   结论

  所设计Br-Ⅱ本身对sjGST为底物型二价潜抑制剂，用于共价标记sjGST较慢。将Br-Ⅱ与磁珠偶联后，对sjGST共价固定化及用自身催化产物可逆固定化sjGST的容量相当，可逆固定化复合物有较好稳定性，但可逆固定化的速度优势很显著。Br-Ⅱ功能化磁珠共价固定化sjGST后仍结合疏水小分子，需经GSH加合物处理或用Br-Ⅱ的GSH加合物可逆固定化消除这类非特异吸附。可见，Br-Ⅱ更适合作为sjGST的二价潜抑制剂，用于位点选择性可逆亲和固定化sjGST融合表达蛋白。对sjGST进行分子改造以设计其突变体的快速亲和标记试剂，是实现sjGST融合表达靶蛋白快速亲和标记固定化需开展的工作。获得对sjGST突变体的快速亲和标记试剂，将显著促进sjGST融合表达系统在生物分子相互作用分析、固定化靶蛋白混合物配体库磁分离快速筛选等领域的应用。

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  Scheme 1  Synthesis of the divalent affinity labeling reagent

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  图 1  Br-Ⅱ与sjGST的反应速度常数

  Figure 1  k_inact labeling to sjGST by Br-Ⅱ in sodium phosphate buffer at pH=6.5, with Br-Ⅱ at 1.5 μmol/L plus GSH 1.0 mmol/L(A), Br-Ⅱ at 100 μmol/L(B) plus GSH 1.0 mmol/L and Br-Ⅱ at 100 μmol/L plus GSH 1.0 mmol/L(C)

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  图 2  Br-Ⅱ及其原位生成GSH加合物对sjGST的IC₅₀

  Figure 2  IC₅₀ of Br-Ⅱ and its GSH conjugate for sjGST with method A(GSH was added last) and method B(CDNB was added at last), respectively

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  图 3  标记试剂与sjGST的结合比

  Figure 3  Labeling ratio of Br-Ⅱ to sjGST dimer fixed at 1 μmol/L in phosphate buffer at pH=6.5

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  图 4  Br-Ⅱ原位生成加合物对sjGST的荧光淬灭及结合比

  Figure 4  Fluorescence spectra for recording GSH conjugation of Br-Ⅱ at final 1.0 μmol/L(A), Br-Ⅱ at varying concentrations(B), and binding ratio of GSH conjugate of Br-Ⅱ to sjGST dimmer fixed at 0.5 μmol/L in the presence(square) and the absence(triangle) of GSH(C)

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  图 5  Br-Ⅱ偶联磁珠不可逆固定化(A)及可逆固定化(B)的固定化动力学及容量

  Figure 5  Kinetics and capacity of 100 μg D-MSP for in irreversal or reversal immobilization of 10 μg sjGST in the absence(A) and the presence(B) of GSH at 100 μmol/L, respectively

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  图 6  SDS-PAGE检测D-MSP对sjGST可逆及不可逆固定化

  Figure 6  SDS-PAGE detection of reversible or irreversible immobilization of 10 μg sjGST to 100 μg D-MSP in the absence and the presence of GSH at 1.0 mmol/L(lanes 3 and 5, respectively), with the references of sjGST lonely(lanes 1 and 2), and the non-covalent adsorption of 10 μg sjGST on 100 μg MSP-COOH-F1(lane 4)

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  图 7  D-MSP固定化sjGST同时对ECAP的非特异吸附

  Figure 7  Non-specific binding of ECAP, on 100 μg D-MSP after immobilization of 10 μg sjGST in the absence or the prescence of final 1.0 mmol/L GSH, comparing with 10 μg ECAP lonely on 100 μg D-MSP

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  图 8  D-MSP及其固定化sjGST后对小分子ANS的非特异性吸附

  Figure 8  Non-specific binding of small molecule of ANS to D-MSP immobilized sjGST detected by the fluorescence spectrophotometer, after 0.5 h-incubation of 25 μmol/L ANS with 100 μg D-MSP lone(A), after 1.0 mmol/L GSH treatment(B), 100 μg sjGST immobilization(C), 100 μg sjGST immobilization in the presence of 1.0 mmol/L GSH plus excessive Br-Ⅰ(D), 100 μg sjGST immobilization in the presence of 1.0 mmol/L GSH(E), 100 μg sjGST immobilized in the presence of 1.0 mmol/L GSH plus excessive Br-Ⅰ and GSH(F). The corresponding white light views were shown in Fig. 8A′~8F′

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  图 9  D-MSP可逆固定化sjGST的稳定性

  Figure 9  Stability of reversible immobilization of D-MSP to sjGST in sodium phosphate buffer at pH=6.5

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