English

• 1.   引言

  电化学发光(Electrochemiluminescence, ECL)，或电致化学发光(Electrogenerated chemiluminescence)分析，是以电化学过程中伴生的化学发光为基础的一大类方法^[1]，具有设备简单、信号背景低、灵敏度高、检测的线性范围宽等优势，有着广泛的实际应用。经典的ECL体系有上世纪发展的Ru(bpy)₃²⁺/三正丙胺和鲁米诺/双氧水体系^[2]。近二十年来，围绕新型纳米结构发展其ECL分析方法已经成为相关领域的研究热点，代表性结构包括半导体量子点^[3]、金属纳米簇^[4]以及最近新兴的钙钛矿量子点^[5]。这些新体系各有独特的物理效应，相关研究推动了ECL应用水平的提高。

  纳米簇是一类尺寸超小(一般小于2 nm)的发光材料^[6]，性质介于原子和胶体颗粒之间，其发光性能受尺寸和配体等多重因素调节。一方面，金属原子的数目、价态和其空间分布决定其发光性能；另一方面，配体通过金属-配体电荷转移等相互作用可以调节发光状态^[7]。近年来，基于纳米簇ECL分析应用的研究取得了诸多进展。本文将从ECL相关金属纳米簇合成、发光机制及其在分析化学中的应用等方面对近年来的相关工作进行总结，针对提高金属纳米簇ECL性能问题重点讨论ECL增强方法和生物信号放大策略。在此基础上对其今后的发展作初步探讨，以期为金属纳米簇ECL分析的相关研究提供参考。

  2.   纳米簇的制备

  纳米簇的制备方法已有很多综述评论。以研究最为广泛的Au簇为例，其发展历程如图 1所示^[8]。本部分仅涉及与ECL相关的常见纳米簇的制备。以下将按配体的分类对纳米簇制备作简要介绍。

  图 1

  

  图 1.  金簇合成的发展历程^[8]

  Figure 1.  Timeline of synthesis of Au nanoclusters ^[8]

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  2.1   小分子配体

  纳米簇的合成包括自下而上(Bottom up)和自上而下(Top down)两类方式，前者以分子间反应和组装为基础，后者需要选择适当的配体来刻蚀大的纳米颗粒。硫醇类小分子在这两类方式中均扮演重要角色。其作为模板和还原剂，在还原金属盐的同时通过金属-硫醇键将配体锚定在纳米簇表面，达到控制生长的目的。所得纳米簇易于功能化，可发展为各类生物探针。常见的水溶性硫醇配体包括谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)^[9]、硫辛酸^[10]等。以2-苯基乙硫醇(SCH₂CH₂Ph)等有机硫醇为配体可以合成Au₂₅、Au₃₈、Au₁₄₄等一系列金簇，便于有机相ECL过程中的电子转移机制研究^[11]。此外，还有其它小分子如组氨酸^[12]和甲硫氨酸^[13]等氨基酸也可作为合成纳米簇的配体。

  2.2   聚合物/核酸类配体

  聚合物大分子也是常用的一类配体，其携带大量电荷和亲疏水基团。使用高度分支化的聚乙烯亚胺聚合物刻蚀胶体金，可以得到强荧光发射的Au₈簇^[14]。类似地，核酸类配体凭借其序列多样性可有效调控纳米簇的理化性质。由于核酸类携带大量负电荷，以其为模板的纳米簇中银簇占很大比例。该方法利用核苷(尤其是胞苷)和Ag⁺配位，还原后形成DNA包覆的银簇^[15]。尽管常见的金前驱物AuCl₄^-和DNA因为电荷排斥等因素而被认为难以结合，但Kennedy等^[16]证实以聚胞苷为模板可制备蓝光发射的金簇；Liu等^[17]通过改变模版DNA序列亦获得发射波长可调的金簇。这类纳米簇表面包裹着携带大量正/负电荷的高分子，是一类有前景的ECL候选材料。

  2.3   蛋白质配体

  2009年，Xie等^[18]利用牛血清白蛋白(BSA)制备了在近红外区有荧光发射的BSA-Au₂₅簇。随后大量的蛋白被证实可以作为纳米簇的合成模板^[19]。蛋白质作为纳米簇配体的优势在于其内部亲疏水结构具有不对称性，为纳米簇的生长提供独特的微环境。BSA-Au₂₅簇是常见的ECL发光体，与其制备方便、稳定性好等特点有着重要联系。

  3.   纳米簇的ECL分析应用

  3.1   基于纳米簇ECL行为的分析检测

  2009年，Diez等^[20]首先报道了关于纳米簇ECL的工作。该工作以聚甲基丙烯酸为模板制备Ag₂、Ag₃等纳米簇，观察到其阴极热电子诱导ECL。但其电位太高(-30 V)，机制与常规的ECL可能有较大差异。2011年，Li等^[21]观察到BSA-Au₂₅簇与经典共反应剂S₂O₈^2-作用，ECL峰电位高于-1.0 V (vs. SCE)。鉴于所用的氧化铟锡(ITO)电极的导带能级比Au纳米簇的最低空轨道(LUMO)高得多，他们将ECL机理归因于从激发的ITO电极的导带到Au簇的有效电子转移产生Au₂₅^-，进而引发ECL过程。多巴胺可加速电子转移，由此发展了一种简单、无标记的多巴胺检测方法。Chen等^[22]随即以双层石墨烯模板原位制备了近红外的石墨烯/金纳米团簇杂合物，其在ITO界面上也能产生阴极ECL，H₂O₂在4~24 μmol/L浓度范围对ECL有猝灭作用，证明Au簇的ECL具有潜在的分析应用前景。与此同时，Fang等^[23]观察到了在阳极电位下Pt电极上BSA-Au₂₅簇与三乙胺共反应产生的ECL，并证实Pb²⁺的ECL猝灭作用。Guo等^[24]使用异相配体交换诱导蚀刻方法，将金纳米颗粒蚀刻为十二烷胺外壳的Au₈簇，其发射波长436 nm。该簇属于有机相制备，可以在Pt电极上形成薄膜结构，同时具备与H₂O₂共反应产生阳极ECL，而与S₂O₈^2-共反应发生阴极ECL的能力。Liu等^[25]利用超声法一锅合成制备水溶性佳的BSA稳定Ag簇。该簇与S₂O₈^2-的ECL峰的波长与荧光峰均位于485 nm附近。与BSA-Au簇类似，该ECL过程可以被多巴胺增强，ECL的强度变化与多巴胺在8.3~830 nmol/L范围内呈线性关系，检出限为0.92 nmol/L。该检测方法可排除常见生物基质和其它神经递质的干扰，适用于血清检测。

  大多数纳米簇的水分散性好，不利于电极上的修饰固定。因此一些工作尝试制备能够固定在电极上的纳米簇复合材料，以检测过氧化氢、酚类等常见小分子。Wu等^[26]以二氧化硅纳米颗粒为基底，利用碳二亚胺键合上BSA-Au₂₅簇，用于过氧化氢的固态ECL检测，其线性范围6.5~32.6 μmol/L。Yuan等^[27]以阳离子聚合物聚乙烯亚胺为连接剂，原位制备石墨烯/多壁碳纳米管/Au簇杂合物。酚类化合物可增强该杂合物与S₂O₈^2-玻碳电极上ECL信号，基于此设计了一种灵敏度高、稳定性和重复性好的酚类传感器。Luo等^[28]也基于Au簇/石墨烯杂合物构建ECL传感器，检测持久性环境污染物五氯苯酚。石墨烯被认为可以促进Au^-和SO₄^-的生成而提高激发态Au^*的产率。与前述多巴胺增强机制不同的是，五氯苯酚造成ECL的猝灭，其灵敏度很高，检测限达10^-14 mol/L。该传感器在水质监测方面有着潜在的应用价值。

  近两年来，围绕生物大分子的ECL检测获得了更多关注。Nie等^[29]在胃蛋白酶碱性溶液中制备了尺寸3~5 nm鲁米诺-Au簇。其发光机制可能与超氧自由基共反应相关。尽管复合物的荧光峰位置(490 nm)与鲁米诺(407 nm)和对照组Au簇(630 nm)迥异，其ECL发射峰位置却与鲁米诺接近。由于碱性磷酸酶(ALP)催化苯基磷酸钠的水解产生苯酚，后者可有效抑制鲁米诺-Au簇复合物的ECL。ECL强度降幅与ALP在0.3~12.0 nmol/L的浓度范围内线性相关，检出限为0.1 nmol/L，且能用于人血清中ALP浓度的测定。Chen等^[30]研究了二茂铁羧酸(Fc)对BSA-Au₂₅簇和三乙胺共反应ECL体系的猝灭效应。该效应源于Fc/Fc⁺对三乙胺自由基的湮灭。他们在Au₂₅修饰玻碳电极上固定葡萄糖氧化酶(GOD)作为待测靶标伴刀豆球蛋白A(ConA)的捕获探针，依靠GOD上的糖基识别并固定ConA，再结合GOD@Fc-PtPd纳米立方体复合物形成夹心结构。因此ECL信号随着ConA增加而下降，降幅与待测物ConA的量呈正相关。所得固态ECL传感器具有检测线性范围宽(4个数量级)，检出限低(1 pg/mL)等特点，具有良好的生物分析前景。

  提高纳米簇ECL效率是ECL分析应用过程的关键问题。2016年，Wang等^[31]在通过自发光方式显著促进了ECL共反应。该工作将共反应物N, N-二乙基乙二胺(DEDA)共价连接到硫辛酸(LA)稳定Au簇上，由于两者的氧化还原活性相匹配，可以直接发生强烈的近红外ECL(发射波长大于700 nm)。相比常规的共反应物自由碰撞模式，这种新颖设计模式减少了物质传递过程中涉及的自由基中间体寿命问题，因而ECL显著增强(图 2)，其效率甚至高于Ru(bpy)₃²⁺/三正丙胺体系。这种多重集群式的设计利用了单个Au簇的多个能级和多个DEDA配体，节约了共反应物的用量，ECL氧化还原起始电位也低至0.78 V (vs Ag/AgCl)。该策略具有普适性，可以延伸到其它材料的共反应体系，此近红外ECL也可在生物检测时显著降低干扰信号。最近，他们还发现LA-Au的ECL可以被乙二胺四乙酸(EDTA)增强，pH 7.4时增强效果最佳^[32]。由于Mg²⁺与EDTA络合，ECL信号可以被Mg²⁺调控。该体系具有无需除氧、生理pH条件发光、低干扰的近红外发射等诸多优点，对其传感和分析应用都非常有利。

  图 2

  

  图 2.  DEDA-Au簇的ECL分多步完成：(1)电极氧化；(2)脱质子；(3)自发光湮灭；(4) ECL ^[31]

  Figure 2.  Electrochemiluminescence (ECL) emission by diethylethylenediamine (DEDA) linked Au nanoclusters was accomplished in multiple steps: (1) electrode oxidation; (2) deprotonation; (3) annihilation; (4) ECL ^[31]

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  利用特殊的配体调节纳米簇, 特别是Au簇的氧化还原活性，可提高纳米簇ECL的反应效率。Jiang等^[33]发现在玻碳电极上表面不饱和的GSH-Au簇和三乙胺共反应的阳极ECL较弱，ECL发射峰电位为+1.8 V(vs. Ag/AgCl)，波长580 nm(与荧光一致)。但将巯基乙醇加入该体系后，在+1.4 V(vs. Ag/AgCl)产生ECL，其发射峰值位于630 nm。双配体外壳Au簇的产生是造成ECL电位降低和发射红移的主要原因。该ECL体系有一定特殊性，其它常见硫醇都不能产生类似增强作用，在ITO和铂电极上也没有观察到ECL。这一发现为设计电位分辨型的ECL新系统提供了可能性。Peng等^[34]发现2.5 nm甲硫氨酸-Au簇修饰玻碳电极在pH 7.4下与S₂O₈^2-共反应, 产生强烈、稳定的阴极ECL信号。峰电位在-1.86 V，强度较BSA-Au簇修饰电极提高5倍。多巴胺能抑制此ECL信号，其响应线性范围0.1~4.0 μmol/L，检出限为32 nmol/L。该方法适用于K⁺刺激PC12细胞时释放的多巴胺测定。该体系与前述体系^{[21, 25]}中多巴胺表现出的ECL增强效应恰好相反，这可能与形成的中间体差别有关。他们进一步阐述了价态对金纳米簇ECL性能的影响^[35]。在不同电位下电化学还原处理NAC-Au簇，发现其中Au(Ⅰ)的含量取决于还原电位，在-1.5 V(vs. Ag/AgCl)以上只有Au(0)存在。ECL信号增强与Au簇的还原程度呈正相关，而配体的脱附对ECL影响很小，说明Au的价态与ECL性能密切相关。这种方法通过控制作用电位就可以调控ECL信号强度，为设计和开发ECL传感技术开辟了新途径。

  除常规的Au、Ag簇以外，研究人员也在寻找其它具备高效ECL特性的纳米簇。Zhai等^[36]通过调节HAuCl₄/AgNO₃的摩尔比制备一系列BSA-Au-Ag双金属纳米簇(图 3)。该纳米簇与三乙胺共反应的ECL性能优于单金属簇。其最佳Au:Ag投料比为6 : 1，此时ECL增强了5倍。银掺杂后，ECL的峰值电位和起始电位较Au簇分别降低了0.23和0.10 V，ECL光谱也蓝移了38 nm。由于Hg²⁺能通过形成d¹⁰-d¹⁰金属亲和键结合到双金属簇上，猝灭其ECL，由此提出一种高灵敏、高选择性和高稳定性的Hg²⁺检测ECL传感器。Zhao等^[37]发现了以BSA为模板制备的Cu簇能与肼共反应的高效阳极ECL体系。其ECL发射波长为433 nm，较其荧光峰红移了25 nm。其可能发光机理是肼被氧化时，能量转移到Cu簇上产生其激发态，形成ECL。相比之下，Cu簇与三丙胺或H₂O₂的共反应ECL则很微弱。多巴胺阳极氧化产生的醌类能猝灭ECL，因此该ECL系统能高灵敏测定多巴胺，检出限低至3.5×10^-13 mol/L。Han等^[38]制备了2-巯基-5-正丙基嘧啶(MPP)为配体的铜簇[Cu₈(MPP)₄]，研究其在湮灭模式及三丙胺共反应模式的ECL细节。该铜簇的ECL位于605 nm，与荧光一致。有机相电化学表征证实其氧化还原行为源于Cu₈₊/Cu₈²⁺，Cu₈/Cu₈²⁺，Cu₈/Cu₈⁺簇等电对。理论计算认为该ECL过程仅涉及单一的金属簇激发态，此激发态对应于从金属到配体的电子转移，其释放能量和簇的LUMO→HOMO能隙近似。因此，发展新型高效的金属簇在ECL生物传感方面也同样具有理想的应用前景。

  图 3

  

  图 3.  BSA-Au-Ag簇的合成(A)、ECL过程及Hg²⁺测定(B) ^[36]

  Figure 3.  (A) Synthesis and (B) ECL emission of BSA-Au-Ag bimetallic NCs for detection of Hg^2+[36]

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  3.2   纳米簇ECL的机制研究

  探讨纳米簇的ECL机制对构建新型分析方法有重要的指导意义。2014年，Hesari等^[39~43]研究了不同Au簇与三正丙胺共反应的ECL机制和反应动力学。他们详细讨论了Au₂₅(SCH₂CH₂Ph)₁₈簇的ECL行为^[39]，首先通过光谱和电化学研究构建了Au簇的Latimer型图(图 4)，有助于ECL的机制探讨。Au簇的ECL发射在近红外区域，峰值波长为860、865和960 nm，分别对应于Au₂₅^+*、Au₂₅^0*和Au₂₅^-*的发射。其发光过程可用HOMO-LUMO带隙上的电子跃迁加以解释。通过改变施加电位和三正丙胺浓度能调控ECL发射波长和强度，其ECL发射效率可达经典Ru(bpy)₃²⁺/三正丙胺体系的103%。进一步研究表明，带负电荷的Au₂₅^-簇在湮没模式下没有出现ECL发射^[40]，这可能与反应中间体寿命短、反应速率慢有关；而在Au₂₅^-/三正丙胺或Au₂₅^-/过氧化苯甲酰(阴极电位下共反应物)体系中则能产生Au₂₅^2-或Au₂₅²⁺等高价还原和氧化中间体，在890和950 nm附近出现ECL。另一个带正电荷的Au簇[Au₂₅(SCH₂CH₂Ph)₁₈]⁺ [C₆F₅CO₂]^-与三正丙胺共反应产生872和945 nm的ECL发射，其强度与三正丙胺浓度和工作电极电位相关^[41]。Au₃₈(SCH₂CH₂Ph)₂₄簇与之类似，其在湮没路径中没有产生ECL发射，而与三正丙胺共反应时观察到930 nm的ECL发射，其ECL效率达到Ru(bpy)₃²⁺/三正丙胺体系的3.5倍^[42]。Au₃₈^+*及Au₃₈^3+*被认为是该发光过程中的主要激发物种。电化学过程产生的一系列Au₃₈^q (q=2-, 1-, 0, 1+, 2+, 4+)均在930 nm有荧光发射。此外，单分散Au₁₄₄(SCH₂CH₂Ph)₆₀簇的近红外ECL(峰值波长930 nm)与电解生成的激发态Au₁₄₄^4+*和Au₁₄₄^5+*的荧光发射一致^[43]。

  图 4

  

  图 4.  Au₂₅簇的Latimer型图^[39]

  Figure 4.  Latimer diagram of Au₂₅ nanoclusters ^[39]

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  Hesari等^[11]最近详细总结了相关ECL机制，认为不同的ECL发射取决于不同的电激发中间体，而这一过程与不同施加电位下电极表面的电子交换情况相关。如在不同电位下产生的Au₂₅^0*和Au₂₅^+*，ECL机制类似(图 5)；而Au₂₅^-*的ECL过程则因为要预先转化为Au₂₅²⁺等，情况复杂得多，需结合Latimer型图作具体分析。

  图 5

  

  图 5.  Au₂₅⁰/TPrA体系中产生(A) Au₂₅^0*和(B) Au₂₅^+*的ECL发光机制^[39]

  Figure 5.  Proposed ECL mechanisms for Au₂₅⁰/TPrA to generate (A) Au₂₅^0* and (B) Au₂₅^+*[39]

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  3.3   利用纳米基底和生物放大效应增强纳米簇ECL性能

  作为新型ECL材料，金属纳米簇面临的一个棘手问题是发光效率相对较低，应用受到限制。因此近两年来的工作更关注如何提高纳米簇的ECL性能。这里主要介绍利用纳米基底效应和生物放大增强两类方法。

  纳米基底的引入可以提高电子转移效率，加速ECL进程。Tian等^[44]发现以纳米基底改善材料荧光效率在一定程度上可以提高ECL量子产率。将1.5 nm Au簇层层组装在层间间隙2.0 nm的二维层状双氢氧化物(LDH)纳米片上，获得了有序而致密的(Au/LDH)_n超薄膜，提高Au簇的荧光性能。理论模拟和实验结果都表明，LDH纳米片施加的局域和约束效应诱导Au(Ⅰ)单元的比例显著增加，荧光效率提升5倍以上。该有序结构与S₂O₈^2-共反应时ECL响应增强，且这种增强受环境温度调控。这个工作对纳米簇的快速固定具有积极意义，也对发展优异的ECL温敏材料具有潜在价值。Lyu等^[45]用碱溶液去除NiGdAl合金中Al，获得多孔三维纳米NiGd合金(NP-NiGd)。在该合金表面生长氧化物并结合金纳米颗粒，构建具有高比表面积和快速电子传递能力的NP-NiGd-Ni₂O₃-Gd₂O₃@Au界面来固定癌胚抗原(CEA)的捕获抗体。使用生物相容的BSA-Au簇修饰石墨烯氧化物标记第二抗体，制备了新型ECL免疫传感器。其线性范围为0.1 pg/mL~5.0 ng/mL，检出限为0.03 pg/mL。Zhou等^[46]在含甘氨酸的电解液中电化学原位产生Ag簇，发现其ECL峰位置(458 nm)与荧光峰(450 nm)接近。他们进一步提出以Fe₃O₄-CeO₂-Pt纳米复合物为第二抗体的标记物，促进纳米Ag簇与S₂O₈^2-的ECL共反应。待测靶标细胞周期蛋白D1(CCND1)越多，则标记上的纳米复合物越多，对ECL增强效应也越明显。由此可超灵敏检测50 fg/mL~50 ng/mL的CCND1，检出限为28 fg/mL。该传感器还可以用于抗癌中药的筛查研究。由于CCND1与人乳腺癌MCF-7细胞的生长和转移相关，而中药苦参对MCF-7细胞过表达的CCND1具有抑制作用，因此检测苦参处理后的MCF-7细胞表面CCND1时ECL信号出现下降。Yang等^[47]提出了一种基于Pt簇/石墨烯复合物与三乙醇胺的ECL共反应体系，石墨烯可显著增强阳极ECL信号。在Cu²⁺存在下ECL强度被大大削弱，由此发展了检测实际水样中痕量Cu²⁺的ECL传感器。但该工作中Pt颗粒的尺寸远超纳米簇的阈值，其ECL机制还有待进一步研究。Zhang等^[48]在ITO电极表面电聚合聚苯胺/聚吡咯复合物，再电镀Ag纳米树枝作为捕获抗体的基底；以载荷大量Ag簇的多孔ZnO球为第二抗体标记物，实现Ag簇与S₂O₈^2-共反应的信号放大。针对癌胚抗原构建ECL夹心免疫传感器。其最佳响应浓度达5个数量级(1 pg/mL~100 ng/mL)，检出限为0.4 pg/mL。

  将纳米簇ECL与核酸的生物放大策略相结合也是一类常见ECL增强方法。Chen等^[49]提出了一种简单而超灵敏的microRNA的ECL生物传感器。采用滚环放大(RCA)技术放大信号，结合原位电化学生成Ag簇作为信号探针。该工作巧妙地设计了一个圆形模板，其中一端为富含鸟嘌呤区域，另一端为miRNA的识别域。以靶miR-21为靶标模型，其与圆形模板杂交形成三元P结(Ternary “P” junction)结构，由phi29DNA聚合酶启动RCA过程，miR-21从模板上释放后继续进入RCA循环。由于模板中富含鸟苷，RCA循环后其互补链上将产生大量富胞苷的周期性串联序列，可作为模板原位电化学合成Ag簇，再与S₂O₈^2-共反应产生ECL信号。最终的ECL强度取决于Ag簇量，而后者与靶miR-21浓度正相关。该传感器可以选择性地检测miR-21，检测范围达6个数量级(10^-16~10^-10 mol/L)，检出限低至22 amol/L。以miR-21高表达的肺癌A549细胞和miR-21低表达的宫颈癌HeLa细胞作为模型，检测结果证实了该方法的可靠性。Zhou等^[50]以ECL猝灭剂二茂铁(Fc)-DNA结构介导的ECL开关为信标，结合TiO₂纳米花对Ag簇-溶解O₂共反应ECL的促进作用，设计了淀粉样蛋白(Aβ)的生物传感器(图 6)。微量的靶蛋白被免疫识别后能诱导形成DNA纳米结构，利用核酸外切酶Ⅲ剪切产生大量次级靶DNA，后者结合到电极上的ECL信标后继续被剪切，触发Fc的释放，ECL信号得以恢复。其检测线性范围为50 fg/mL~500 ng/mL，检出限低至32 fg/mL。Jie等^[51]使用DNA酶辅助目标循环和杂交链反应多重扩增策略在电极上获得大量Ag簇，作为凝血酶检测的ECL探针。凝血酶首先与包含其适配体的发夹DNA结合，诱导DNA解链，所得单链DNA与特异底物序列结合，再用DNA酶循环切割产生大量底物碎片。这些碎片被Au纳米颗粒修饰电极上的互补DNA序列捕获后，触发富含胞苷发夹的两段DNA探针轮番结合，形成长链DNA。该DNA作为模板与AgNO₃温育，以硼氢化钠还原合成大量Ag簇，实现了ECL信号放大。该法测定凝血酶的线性范围为10.0 fmol/L~10.0 nmol/L，有望为各类适配体靶标提供高灵敏的传感平台。Feng等^[52]以三链DNA制备位点特异、尺寸均匀和稳定性强的Ag_n (n=2或3)簇，发现相比于双链和单链DNA模板，三链模板制备的Ag簇与S₂O₈^2-共反应时的ECL信号更强，且ECL启动电位降低。由于三链Ag簇和半胱氨酸等硫醇之间有强烈的相互作用，影响DNA模板的微环境而改变ECL强度，该工作开发了一种简单、无标记的硫醇检测方法，可在20%稀释血清基质中检测0.5~50 μmol/L半胱氨酸。因此，通过将生物放大策略融入纳米簇ECL过程，可以更好地拓展其生物分析应用范围。

  图 6

  

  图 6.  TiO₂纳米花-Ag簇的制备(A)、核酸信号放大过程(B)及ECL机制(C) ^[50]

  Figure 6.  (A) Synthesis of TiO₂ nanoflower-Ag nanoclusters, (B) nucleic acids signal amplification and (C) ECL mechanism^[50]

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  3.4   纳米簇作为ECL的能量转移受体

  除了本征的ECL，纳米簇还可以作为能量转移受体参与其它ECL检测体系的构建。Cheng等^[53]基于CdTe纳米晶和Au簇设计了距离依赖性ECL共振能量转移(ERET)系统，用于miRNA的高选择性检测。他们在电极上固定CdTe纳米晶(荧光发射波长475 nm)，将不同长度的GSH-Au簇(荧光发射波长约580 nm)标记的发夹DNA连接到CdTe上，此时CdTe纳米晶与Au簇之间的能量匹配导致CdTe与溶解氧的共反应ECL发生猝灭。DNA连接酶选择性将miRNA和辅助DNA连接在发夹DNA链上，形成长链的DNA-RNA异源双链体。此时ERET因为距离太远无法发生，ECL信号得以大幅恢复；而如果按常规的信标方式，仅由miRNA打开发夹DNA时，CdTe纳米晶与Au簇之间距离过短，仍存在ERET效应，ECL信号较弱。该工作以ECL为“尺”设计距离依赖性的ERET系统，miRNA的检测线性范围为100 fmol/L~100 nmol/L，且特异性强、速度快。该策略核心的发夹DNA设计多样性强，方便扩展到其它相似体系。同一课题组的Huang等^[54]还将该CdTe-发卡-Au簇的ERET组合与Au簇对共反应氧的电催化还原联合，构建双重猝灭途径，用于超灵敏检测ATP。该设计将靶辅助型Zn²⁺依赖性DNA酶分割为两个片段，在两个辅助DNA和ATP协助下，在发夹上特定位点形成了ATP适体的G-四联体结构。此时Zn²⁺依赖性DNA酶两个片段靠近，Zn²⁺存在时即切割基质链，释放Au簇，导致ECL信号恢复。其核心思路在于表面原位产生Zn²⁺依赖性DNA酶。该传感器可用于血清样品中的ATP检测。Zhang等^[55]提出了双ECL猝灭效应的思路来实现信号放大(图 7)。由于CdS纳米晶的ECL发射与寡核苷酸模板制备的Ag簇的吸收带相匹配，Ag簇可以作为CdS纳米晶ECL的能量受体，发生有效的ERET；同时，Ag簇能催化S₂O₈^2-的电化学还原，减少有效的共反应物供给，ECL强度进一步下降。当miRNA打开电极上发夹结构后，Ag簇标记核苷酸即结合到电极上，发生双ECL猝灭效应，其效应与miRNA负相关。该方法可检测10 fmol/L~100 pmol/L范围的miRNA，具有高稳定性和重复性。

  图 7

  

  图 7.  (A) 双ECL猝灭效应的设计思路；(B) DNA-银纳米簇合成^[55]

  Figure 7.  (A) Design of dual ECL quenching effect; (B) Preparation of DNA templated Ag nanoclusters^[55]

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  除了能量转移，也有工作报道纳米簇对经典ECL体系的增强效应。Wei等^[56]以纳米二氧化钛负载AuAg合金簇修饰到ITO电极表面。在该电极上鲁米诺微乳液的ECL发射大大增强，表现出纳米复合物和微乳液的协同增敏效应。该电极对H₂O₂的ECL响应更灵敏，检出限低至nmol/L级，可应用于水果的总抗氧化活性测定，效果良好。

  4.   展望

  近年来，纳米簇的ECL研究飞速发展，在机制研究和检测应用方面都取得了不少成果。但还有一些关键问题值得深入思考：(1)需要研究通过工程化手段获得高品质纳米簇的方法。尽管纳米簇具有确定的分子结构，但在其制备时通常产物均一性差，多数情况下得到多种簇的混合物，其分离纯化和表征必须借助色谱和电泳技术，增加了制备成本。因此发展高效、可控的纳米簇制备技术对于其广泛应用有着至关重要的意义。(2)需要在获得高品质纳米簇的基础上深入研究其构效关系，挖掘ECL动力学信息，诠释ECL机制与荧光等其它发光机制的相关性，对发展稳定、高效的纳米簇ECL分析体系至关重要。(3)数个工作报道了具有近红外ECL发射的纳米簇，但如何充分利用这一特性尚需理性设计。近红外发光的优势通常表现为生物背景干扰较低，因此能否将近红外纳米簇与近来发展的细胞ECL成像技术^[57~59]结合，有待进一步探索。(4)努力寻找纳米簇ECL在物质科学和生物医学前沿交叉研究中的角色定位。例如在生物医学领域发展集ECL检测、成像、载药控释、靶向治疗等一体化的复合型纳米簇，可能有更为实际的应用前景。

  
  
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  图 1  金簇合成的发展历程^[8]

  Figure 1  Timeline of synthesis of Au nanoclusters ^[8]

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  图 2  DEDA-Au簇的ECL分多步完成：(1)电极氧化；(2)脱质子；(3)自发光湮灭；(4) ECL ^[31]

  Figure 2  Electrochemiluminescence (ECL) emission by diethylethylenediamine (DEDA) linked Au nanoclusters was accomplished in multiple steps: (1) electrode oxidation; (2) deprotonation; (3) annihilation; (4) ECL ^[31]

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  图 3  BSA-Au-Ag簇的合成(A)、ECL过程及Hg²⁺测定(B) ^[36]

  Figure 3  (A) Synthesis and (B) ECL emission of BSA-Au-Ag bimetallic NCs for detection of Hg^2+[36]

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  图 4  Au₂₅簇的Latimer型图^[39]

  Figure 4  Latimer diagram of Au₂₅ nanoclusters ^[39]

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  图 5  Au₂₅⁰/TPrA体系中产生(A) Au₂₅^0*和(B) Au₂₅^+*的ECL发光机制^[39]

  Figure 5  Proposed ECL mechanisms for Au₂₅⁰/TPrA to generate (A) Au₂₅^0* and (B) Au₂₅^+*[39]

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  图 6  TiO₂纳米花-Ag簇的制备(A)、核酸信号放大过程(B)及ECL机制(C) ^[50]

  Figure 6  (A) Synthesis of TiO₂ nanoflower-Ag nanoclusters, (B) nucleic acids signal amplification and (C) ECL mechanism^[50]

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  图 7  (A) 双ECL猝灭效应的设计思路；(B) DNA-银纳米簇合成^[55]

  Figure 7  (A) Design of dual ECL quenching effect; (B) Preparation of DNA templated Ag nanoclusters^[55]

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