English

• 1.   引 言

  蛋白质的S-棕榈酰化修饰是指饱和十六碳棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白质半胱氨酸的巯基上^[1],是蛋白质翻译后脂质共价修饰的重要形式。S-棕榈酰化修饰是一种可逆修饰,在细胞信号转导、癌症、神经传递、以及细胞膜间运输发挥着重要作用^[2~4]。尽管脂质对蛋白的修饰作用尤其是S-棕榈酰化修饰的重要性得到了广泛共识,人们对这类蛋白质修饰很多方面的了解仍然不足,在这个研究领域中的缓慢进展也在很大程度上反映了其研究方法的所面临的巨大挑战^[5]。早期对蛋白质S-棕榈酰化修饰的分析,主要是利用质谱技术对含有S-棕榈酰化修饰的蛋白片段进行直接测定^{[6, 7]}。这种方法一般需要首先对特定的目的蛋白进行分离纯化,这对于疏水性较强而含量较少的棕榈酰化修饰蛋白而言,无论是分析的灵敏度和通量,都是不小的挑战。近年来,发展了多种蛋白质S-棕榈酰化修饰的分析表征方法,主要都是通过对S-棕榈酰化修饰的特异性标记,达到对其表征和分析的目的^[8]。这些方法主要分为体内代谢标记法^[9~11]和体外化学标记法^[12~14]两大类。体内代谢标记法是将带有叠氮或炔基的棕榈酸类似物加入到细胞的培养基中,通过代谢通路进入到细胞蛋白质中,再经过点击化学反应选择性地将被修饰的蛋白质上的叠氮或炔基与生物素等纯化标签进行连接,从而可以富集和检测棕榈酰化修饰蛋白。体外化学标记法于2004 年提出^[15],是先将蛋白质半胱氨酸上所有自由巯基完全封闭,再利用羟胺(Hydroxylamine,HA)将蛋白质半胱氨酸和脂肪酸修饰基团之间的巯酯键断开,采用含有生物素(Biotin)的功能分子对新产生的自由巯基进行标记,再经过富集纯化并利用质谱技术鉴定棕榈酰化修饰蛋白(图 1)。这种技术路线涉及的一个主要反应为酰基-生物素置换法(Acyl-biotinyl exchange,ABE),即酰基基团与生物素基团的交换。

  图 1

  

  图 1  (A)HPDP-Biotin分子结构; (B)酰基-生物素置换法(Acyl-biotinyl exchange,ABE)原理示意图

  Figure 1.  (A)Structure of N-[6-(biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pynidyldithio)propionamide (HPDP-Biotin)(B)workflow of acyl-biotinyl exchange (ABE) method

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  在本研究中,利用酰基-生物素置换反应、亲和层析和质谱技术,对A型流感病毒血凝素蛋白上的S-棕榈酰化修饰进行了分析,鉴定了其中两个S-棕榈酰化修饰位点。本研究为大规模研究S-棕榈酰化修饰蛋白提供了一种特异、有效的分析方法。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  QExactive质谱仪(美国Thermo Scientific公司);Easy-nLC 1000纳升液相色谱系统(美国Thermo Scientific公司);PepMap100 C₁₈富集柱(75 μm × 20 mm,3 μm,美国ThermoFisher Dionex公司);PepMap100 C₁₈反相毛细管色谱分析柱(150 mm × 0.075 mm,3 μm,美国ThermoFisher Dionex公司);Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳(美国Bio-Rad公司);Allegra TM X-22R离心机(美国Beckman Coulter公司);PowerLook 2100XL-USB with UTA & MagicScan凝胶成像仪(美国UMAX公司);Varioskan Flash酶标仪(美国Thermo公司,);BE-1100四维旋转混合仪(海门其林贝尔公司)。HPDP-Biotin(N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamide)、琼脂糖链霉亲和素(Streptavidin-agarose)(美国Pierce公司);测序级TPCK修饰的胰蛋白酶(美国Promega公司);碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺(美国Bio-Rad公司);10% Triton X-100、N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide,NEM)、羟胺(Hydroxylamine,HA)、甲酸、氯仿、乙腈、苯甲基磺酰氟(PhenylmethanesμLfonyl fluoride,PMSF) (美国Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司);增强化学发光底物试剂(ECL Prime,美国GE Healthcare公司);其它试剂均为国产分析纯。人流感病毒株H3N2由本实验室保存;实验用水为经Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备的超纯水。

  2.2.   流感病毒的鸡胚扩增及纯化

  将A型禽流感病毒H3N2接种于鸡胚中,35℃孵育72 h后,收集尿囊液,于4℃,5000 r/min离心15 min,收集上清液。取适量上清液,加入到20%~60% (w/w)蔗糖梯度溶液液面上,用SW40Ti转子(Beckman-Coulter)于4℃,以 35000 r/min离心1 h。收集含有病毒的区带,用4倍体积的含有100 mmol/L Tris,10 mmol/L MgCl₂(pH 7.4)的缓冲液稀释成病毒悬浮液。再加入到不连续蔗糖梯度(30%和60% (w/w))溶液液面上,在4℃以38000 r/min离心1 h。至少重复3次不连续蔗糖梯度溶液超速离心,以保证病毒颗粒的纯度。小心收集含有病毒的液体带,混悬于上述缓冲液中,冻存于-80℃待用。

  2.3.   酰基-生物素置换反应

  配制足量Lysis Buffer(LB)(150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,5 mmol/L EDTA)。将1 mL病毒样品加入2 mL封闭缓冲液(LB,含50 mmol/L NEM,1 mmol/L PMSF,2% Triton X-100),4℃用四维旋转混匀器翻转振荡1 h。加入5倍体积的丙酮,于-20℃沉淀3 h,3500 r/min离心3 min,收集沉淀,加入400 μL 含有1 % SDS,10 mmol/L NEM的LB缓冲液,37℃孵育10 min。加入2 mL 缓冲液(LB 含50 mmol/L NEM,1 × PI,1 mmol/L PMSF,0.2% Triton X-100),4℃用四维旋转混匀器翻转振荡过夜。5倍体积丙酮-20℃沉淀3 h,离心收集沉淀(3500 r/min,3 min),加入400 μL 含有1% SDS的LB缓冲液,37℃孵育10 min,依沉淀溶解,再进行丙酮沉淀,重复3次,最后一次沉淀后,加入480 μL含有1% SDS的LB缓冲液,37℃孵育10 min。

  将孵育后的样品均分为2份(240 μL/份),其中一份样品加入含有HA的缓冲液(1 mmol/L HPDP-Biotin,0.2% Triton X-100,1 × PI,1 mmol/L PMSF,0.7 mol/L HA,pH 7.4)960 μL。另外一份作为对照,加入不含HA的缓冲液(1 mmol/L HPDP-Biotin,50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,0.2% Triton X-100,1 × PI,1 mmol/L PMSF)960 μL。2份样品经充分振荡混匀后,室温下用四维旋转混匀器翻转振荡1 h。

  将两组样品分别加入4倍体积甲醇、1.5倍体积氯仿、3倍体积水,振荡后离心(4000 r/min,15 min),吸去上面的氯仿层。再分别加入3倍体积甲醇,振荡混匀后离心去除上清(3500 r/min,10 min)。将两组样品的沉淀各用240 μL 含1% SDS的LB缓冲液溶解,37℃孵育10 min,各加入960 μL缓冲液(150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris pH 7.4,5 mmol/L EDTA,0.2 mmol/L HPDP-Biotin,0.2% Triton X-100,1 mmol/L PMSF,1 × PI)。再进行3次丙酮沉淀。最后一次沉淀后加入200 μL 含1% SDS的LB缓冲液,溶解后以15000 r/min离心1 min,取上清液备用。

  取两份20 μL链霉亲和素,分别用750 μL含0.1% SDS,0.2% TritonX-100的LB缓冲液稀释。将上述样品分别加入到平衡后的链霉亲和素琼脂糖树脂(Streptavidin-agarose)中,4℃下用四维旋转混匀器翻转振荡1h。分别用750 μL LB缓冲液洗涤4次。最后一次离心去除上清液后,各加入200 μL洗脱液(50 mmol/L DTT),37℃孵育30 min。再加入碘乙酰胺溶液(终浓度75 mmol/L),37℃避光孵育60 min。离心取上清液(8200 r/min,30 s),-20℃保存。

  2.4.   酶联免疫吸附分析

  将稀释成一定浓度的两组蛋白样品及标准品包被ELISA反应板,100 μL/孔。4℃过夜。PBST(10 mmol/L Na₂HPO₄,1.9 mmol/L KH₂PO₄,2.7 mmol/L KCl,136 mmol/L NaCl,Tween-20 0.5%(V/V))洗涤3次,每次3 min。每孔加100 μL 封闭液(0.5% BSA,0.1% Tween,PBS)室温放置1 h。PBST洗涤3次。加用封闭液1:3000稀释的HRP-亲和素,100 μL/孔,37℃孵育1 h。PBST洗涤3次。加底物溶液(TMB,1 ×) 100 μL/孔,室温反应30 min。加入终止液(2 mol/L H₂SO₄)50 μL,室温放置5 min。酶标仪测450 nm波长下的OD值。

  2.5.   SDS-PAGE

  取适量样品,加入等体积的上样缓冲液,沸水煮5 min后,用Mini-Cell垂直电泳系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行蛋白分离^[16]。电泳结束后,将胶片进行银染^[17],然后用扫描仪进行扫描。

  2.6.   蛋白质样品的胶内水解

  用洁净的刀片将蛋白条带切取后,再切成1 mm³左右的颗粒,用脱色液(15 mmol/L K₃[Fe(CN)₆],50 mmol/L Na₂S₂O₃)将颜色完全脱除。用25 mmol/L NH₄HCO₃清洗胶粒3次后,再用乙腈将胶粒脱水,置室温自然干燥。加入含有胰蛋白酶的缓冲液(10~15 μg/mL,以25 mmol/L NH₄HCO₃稀释,pH 8.0),37℃保温30 min后,补加适量缓冲液(50 mmol/L NH₄HCO₃)至完全覆盖胶粒,37℃保温20 h,吸取上清液,经ZipTip C₁₈吸头脱盐后,冻干,-20℃保存。

  2.7.   液质联用分析鉴定蛋白

  将冻干的多肽样品溶解在流动相溶液A(0.1%甲酸、98%水、2%乙腈)中。溶解后的样品先被富集到C₁₈ Trap柱,再以流动相A和B(0.1%甲酸、2%水、98%乙腈)进行梯度洗脱,洗脱梯度为70 min内流动相B由5%升高至35%。洗脱出的多肽经纳升喷雾离子源进入Q Exactive质谱进行分析。喷雾电压为1.6 kV,毛细管温度为250°C,质谱扫描方式为数据依赖的采集工作模式下(Data dependent analysis,DDA),每次全扫描后最多采集20个碎片图谱。母离子扫描范围m/z 300>~1800;碰撞能量:27% HCD。数据处理采用Mascot 2.3软件(Matrix Science)进行,数据库为病毒数据库,酶为胰蛋白酶;固定修饰为:Carbamidomethyl (C);可变修饰为: Deamidated (NQ)、Dioxidation (W)、Oxidation (M);MS容差为±15 ppm,MS/MS容差为±0.15 Da。

  3.   结果与讨论

  3.1.   利用酰基-生物素置换法标记A型流感病毒棕榈酰化修饰蛋白

  在一定条件下,羟胺可以切断蛋白质半胱氨酸和脂肪酸修饰基团之间的巯酯键。基于这一反应而发展起来的酰基-生物素置换法被广泛应用于研究蛋白质棕榈酰化修饰^[15]。由于生物体系的复杂性,样品中可能含有内源性的生物素化的蛋白,以及可以与生物素标记试剂进行反应的其它类型的基团。这些因素都会影响到亲和素富集和质谱分析的各个步骤,最终使分析的假阳性结果增多。因此,必须通过设定适当的空白对照组(未加羟胺处理,-HA)实验,尽可能减少假阳性结果。以往研究多是通过对比实验组和空白对照组的质谱分析的蛋白质结果,筛选出相对丰度的比值大于一定数值的蛋白质,作为棕榈酰化修饰蛋白的结果^{[18, 19]}。由于计算某个蛋白相对丰度时,多采用质谱信号峰强度或所归属的质谱图数目为依据,所以常造成定量数据的误差较大。此外,仅靠这种方法并不能直接发现酰基-生物素置换反应步骤中可能发生的操作上的失误。为此,有必要对酰基-生物素置换反应本身进行监控,判断反应是否正常。

  在本研究组前期研究中,以多种实验材料(培养的细胞、各种组织等)为对象,发现可以将酰基-生物素置换后的蛋白质耦联生物素的量(羟胺处理,+HA)与空白对照组(未加羟胺处理,-HA)的比值作为反应的质控参数,比值≥3,可以认为置换反应成功。如果比值＜3,甚至比值≈1,则可以断定酰基-生物素置换反应不成功,就没有必要进行后续的亲和纯化和质谱分析等实验(实验结果略)。在本研究中,将流感病毒裂解产物经酰基-生物素置换方法处理后,用建立的ELISA方法测定其中蛋白质耦联生物素的浓度(见图 2)。羟胺处理组(+HA)与未加羟胺处理的空白对照组(-HA)的比值≈3(见图 2B)。实验结果表明,加入羟胺处理后,连接棕榈酸盐和蛋白质半胱氨酸残基上的硫酯键被断开,从而能结合上更多的生物素标记分子,即发生了酰基-生物素置换。

  图 2

  

  图 2  酰基-生物素置换反应产物中的蛋白质耦联Biotin量的酶联免疫吸附法分析:(A)ELISA方法测定蛋白质耦联Biotin的标准曲线(B)流感病毒裂解产物经酰基-生物素置换反应后的蛋白质耦联Biotin量

  Figure 2.  Determination of biotin linked with proteins after acyl-biotinyl exchange reaction by ELISA assay: (A)standard curve of ELISA of biotin linked with protein (B) biotin concentration of virus lysate after acyl-biotinyl exchange treatment with hydroxylamine (+HA) or without hydroxylamine (-HA)

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  3.2.   A型流感病毒棕榈酰化修饰蛋白的富集与分离

  将酰基-生物素置换后的蛋白质样品(每种样品都对应有+HA和-HA两种处理方式)经过甲醇-氯仿沉淀处理后,再经过3次连续的丙酮沉淀,将样品中未反应的HPDP-Biotin等干扰亲和纯化试剂去除。再利用链霉亲和素琼脂糖树脂(Streptavidin-agarose)将样品中的耦联有Biotin标签的蛋白富集并纯化出来(图 3)。由图 3可见,A型流感病毒裂解液(1号样品)中的S-棕榈酰化修饰蛋白在有羟胺的环境中可以发生酰基-生物素置换(2号样品),从而能够被链霉亲和素琼脂糖树脂高效地富集纯化出来(6号样品);而未经过羟胺处理的对照样品则不能进行酰基-生物素置换反应,也就不能被亲和富集纯化(7号样品)。8号和9号样品分别为+HA和-HA两种处理方式的样品经过链霉亲和素树脂纯化过程中的洗涤液,都呈现出非常浅的蛋白条带,应为与链霉亲和素树脂非特异性吸附的蛋白。样品6在66和28 kDa上显示的条带在样品7相应的位置上并未出现,说明未经过酰基-生物素置换反应的蛋白在后续步骤中不能被亲和富集而在电泳中没有显示条带,也说明本方法用于富集S-棕榈酰化修饰蛋白的特异性非常高。

  图 3

  

  图 3  A型流感病毒S-棕榈酰化修饰蛋白的富集与纯化. M. Marker; 1. H3N2病毒原样; 2. 酰基-生物素置换反应(+HA)后的病毒样品; 3. 酰基-生物素置换反应(-HA)后的病毒样品; 4. 样品2经链霉亲和素吸附后的上清液(+HA); 5.样品3经链霉亲和素吸附后的上清液(-HA); 6. 样品2经链霉亲和素纯化后洗脱液(+HA); 7.样品3经链霉亲和素纯化后洗脱液(-HA); 8. 样品2经链霉亲和素纯化过程中的洗涤液(+HA); 9. 样品3经链霉亲和素纯化过程中的洗涤液(-HA)

  Figure 3.  Enrichment and purification of S-palmitoylated proteins in influenza A virus; M. Marker; 1,H₃N₂ virus sample; 2,Virus sample after acyl-biotin exchange reaction(+HA); 3,Virus sample after acyl-biotin exchange reaction (-HA); 4,Supernatant of sample 2 after adsorption of streptavidin (+HA); 5,Supernatant of sample 3 after adsorption of streptavidin(-HA); 6,Eluent of sample 2 from streptavidin (+HA); 7,Eluent of sample 3 from streptavidin (-HA); 8,Washing solution during purification of sample 2 by streptavidin (+HA); 9,Washing solution during purification of sample 3 by streptavidin(-HA)

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  3.3.   A型流感病毒血凝素蛋白棕榈酰化修饰的质谱分析

  电泳分离结果显示,经酰基-生物素置换、亲和素树脂纯化得到的样品在60 kDa左右位置有一主要条带(图 3中6号样品)。将其切下,进行胶内水解得到多肽混合物。采用液相色谱与质谱联用技术得到样品中肽段的串联质谱数据,经 Mascot 2.3数据处理软件在 SwissProt 蛋白数据库中进行检索。鉴定结果显示为A型流感病毒中的血凝素蛋白(表 1),鉴定肽段的覆盖率约为29%。

  表 1

  

  表 1  A型流感病毒中的血凝素蛋白的质谱鉴定

  Table 1.  Identification of hemagglutinin from influenza A virus by mass spectrometry

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  肽段 Peptide	修饰类型 Modification type (s)	实测 Observed(m/z)	电荷 z	实测分子量 Observedmass (M+H)	理论分子量 Calc.mass (M+H)	质量偏差 Mass error(×10-6)
  K.TNEKFHQIEK.E		425.221	3	1273.647	1273.654	-4.9
  K.C[+57.021]DNAC[+57.021]IGSIR.N	C[+57]*2	583.256	2	1165.504	1165.509	-3.8
  R.ENAEDMGNGC[+57.021]FK.I	C[+57]	686.269	2	1371.530	1371.530	-0.5
  R.ENAEDM [+15.995]GNGC[+57.021]FK.I	C[+57], M[+16]	694.265	2	1387.523	1387.525	-1.6
  R.NGTYDHDVYR.D		620.272	2	1239.536	1239.539	-2.3
  K.EFSEVEGR.I		476.721	2	952.435	952.437	-2.3
  K.IYHKC[+57.021] DNAC[+57.021]IGSIR.N	C[+57]*2	569.605	3	1706.802	1706.810	-4.9
  R.FQIKGVELK.A		354.549	3	1061.632	1061.635	-3.4
  R.ITYGAC[+57.021]PR.Y	C[+57]	469.230	2	937.452	937.456	-4.1
  K.FHQIEK.E		401.214	2	801.421	801.425	-5.3
  R.IQDLEK.Y		373.207	2	745.407	745.409	-2.6
  K.STQAAINQINGK.M		622.832	2	1244.656	1244.659	-2.3
  R.PFQNVNR.I		437.727	2	874.447	874.453	-7.4
  R.IQDLEKYVEDTK.I		494.254	3	1480.748	1480.753	-3.5
  K.KWDLFVER.S		546.794	2	1092.580	1092.584	-3.2
  R.C[+57.021]NIC[+57.021]I.-	C[+57]*2	340.147	2	679.287	679.290	-4.3
  K.YVEDTK.I		377.683	2	754.359	754.362	-3.9
  K.GNIRC[+57.021] NIC[+57.021]I.-	C[+57]*2	560.271	2	1119.535	1119.540	-4.4

  目前,对于A型流感病毒血凝素蛋白结构的研究已较为深入。其中,通过定点突变等分子生物学技术已经探明其棕榈酰化的位点为3个半胱氨酸残基:1个位于跨膜区(transmembrane region,TMR)与胞质尾区(Cytoplasmic domain tail,CDT)的交界处,2个位于胞质尾区^[20]。利用酰基-生物素置换反应、亲和层析和质谱技术,鉴定出A型流感病毒血凝素蛋白胞质尾区的两个棕榈酰化位点(Cys₅₆₂和Cys₅₆₅)。图 4为检测到的包含这两个位点的两个肽段C^*NIC^*I和GNIRC^*NIC^*I的串联质谱图,在序列中存在一个胰酶的漏切位点(R)。通过数据库检索,没有找到A型流感病毒血凝素蛋白中另外的一个棕榈酰化的位点。这可能是由于其所在的胰酶酶切肽段的分子量较大(>3000 Da)、离子化效率低等因素,导致其质谱信号响应较低,从而没有被质谱选择做串联分析,或者串联质谱数据质量太差而数据库检索得不到可信的结果。

  图 4

  

  图 4  血凝素蛋白棕榈酰化修饰位点(C₅₆₂ 和 C₅₆₅)的串联质谱分析鉴定.(A)肽段 C^*NIC^*I的串联质谱分析.(B)肽段 GNIRC^*NIC^*I的串联质谱分析

  Figure 4.  MS/MS spectra of peptide C^*NIC^*I (A)and peptide GNIR C^*NIC^*I (B),of which two palmitoylation sites including C₅₆₂and C₅₆₅ in viral hemagglutinin protein were identified

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  4.   结 论

  本研究提出了酰基-生物素置换反应的质控参数,并利用酰基-生物素置换反应、亲和层析和质谱技术,对A型流感病毒血凝素蛋白上的S-棕榈酰化修饰进行了分析,鉴定了其中的两个S-棕榈酰化修饰位点。本研究为大规模研究S-棕榈酰化修饰蛋白提供了一种特异、有效的分析方法。

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  Figure 1  (A)Structure of N-[6-(biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pynidyldithio)propionamide (HPDP-Biotin)(B)workflow of acyl-biotinyl exchange (ABE) method

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  Figure 2  Determination of biotin linked with proteins after acyl-biotinyl exchange reaction by ELISA assay: (A)standard curve of ELISA of biotin linked with protein (B) biotin concentration of virus lysate after acyl-biotinyl exchange treatment with hydroxylamine (+HA) or without hydroxylamine (-HA)

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  Figure 3  Enrichment and purification of S-palmitoylated proteins in influenza A virus; M. Marker; 1,H₃N₂ virus sample; 2,Virus sample after acyl-biotin exchange reaction(+HA); 3,Virus sample after acyl-biotin exchange reaction (-HA); 4,Supernatant of sample 2 after adsorption of streptavidin (+HA); 5,Supernatant of sample 3 after adsorption of streptavidin(-HA); 6,Eluent of sample 2 from streptavidin (+HA); 7,Eluent of sample 3 from streptavidin (-HA); 8,Washing solution during purification of sample 2 by streptavidin (+HA); 9,Washing solution during purification of sample 3 by streptavidin(-HA)

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  Figure 4  MS/MS spectra of peptide C^*NIC^*I (A)and peptide GNIR C^*NIC^*I (B),of which two palmitoylation sites including C₅₆₂and C₅₆₅ in viral hemagglutinin protein were identified

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  Table 1.  Identification of hemagglutinin from influenza A virus by mass spectrometry

  肽段 Peptide	修饰类型 Modification type (s)	实测 Observed(m/z)	电荷 z	实测分子量 Observedmass (M+H)	理论分子量 Calc.mass (M+H)	质量偏差 Mass error(×10-6)
  K.TNEKFHQIEK.E		425.221	3	1273.647	1273.654	-4.9
  K.C[+57.021]DNAC[+57.021]IGSIR.N	C[+57]*2	583.256	2	1165.504	1165.509	-3.8
  R.ENAEDMGNGC[+57.021]FK.I	C[+57]	686.269	2	1371.530	1371.530	-0.5
  R.ENAEDM [+15.995]GNGC[+57.021]FK.I	C[+57], M[+16]	694.265	2	1387.523	1387.525	-1.6
  R.NGTYDHDVYR.D		620.272	2	1239.536	1239.539	-2.3
  K.EFSEVEGR.I		476.721	2	952.435	952.437	-2.3
  K.IYHKC[+57.021] DNAC[+57.021]IGSIR.N	C[+57]*2	569.605	3	1706.802	1706.810	-4.9
  R.FQIKGVELK.A		354.549	3	1061.632	1061.635	-3.4
  R.ITYGAC[+57.021]PR.Y	C[+57]	469.230	2	937.452	937.456	-4.1
  K.FHQIEK.E		401.214	2	801.421	801.425	-5.3
  R.IQDLEK.Y		373.207	2	745.407	745.409	-2.6
  K.STQAAINQINGK.M		622.832	2	1244.656	1244.659	-2.3
  R.PFQNVNR.I		437.727	2	874.447	874.453	-7.4
  R.IQDLEKYVEDTK.I		494.254	3	1480.748	1480.753	-3.5
  K.KWDLFVER.S		546.794	2	1092.580	1092.584	-3.2
  R.C[+57.021]NIC[+57.021]I.-	C[+57]*2	340.147	2	679.287	679.290	-4.3
  K.YVEDTK.I		377.683	2	754.359	754.362	-3.9
  K.GNIRC[+57.021] NIC[+57.021]I.-	C[+57]*2	560.271	2	1119.535	1119.540	-4.4

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