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基于Cu2-xSe纳米颗粒与罗丹明B的能量转移测定L-半胱氨酸

王雪 ,  杨焜诚 ,  毛智远 ,  黄承志 ,  王健

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引用本文: 王雪,  杨焜诚,  毛智远,  黄承志,  王健. 基于Cu2-xSe纳米颗粒与罗丹明B的能量转移测定L-半胱氨酸[J]. 分析化学, 2016, 44(10): 1482-1486. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160409 shu
Citation:  WANG Xue,  YANG Kun-Cheng,  MAO Zhi-Yuan,  HUANG Cheng-Zhi,  WANG Jian. Determination of L-Cysteine Based on Energy Transfer between Cu2-xSe Nanoparticles and Rhodamine B[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(10): 1482-1486. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160409 shu

基于Cu2-xSe纳米颗粒与罗丹明B的能量转移测定L-半胱氨酸

  • 发光与实时分析教育部重点实验室, 西南大学药学院, 重庆 400715

  • 基金项目:

    本文系国家自然科学基金（No.21405123）、重庆市基础与前沿研究计划项目（No.cstc2014jcyjA50006）、西南大学国家级大学生创新训练项目（No.201610635050）和西南大学药学院大学生创新创业项目资助。

摘要: 以硒化铜纳米颗粒为能量受体，以罗丹明B为能量供体，二者之间通过光诱导电子转移而猝灭罗丹明B的荧光；而L-半胱氨酸能够诱导罗丹明B荧光的恢复，从而建立了测定L-半胱氨酸的新方法。在pH 4.6、温度为30℃条件下混合2 min后，罗丹明B在575 nm处的荧光强度与溶液中L-半胱氨酸的浓度在2.5×10-7~1.1×10-6 mol/L浓度范围内呈良好的线性关系，检出限（3σ/k）为5.5×10-8 mol/L。常见的氨基酸对半胱氨酸的测定干扰小，方法快速、选择性好。

English

  • 1.   引 言

    半胱氨酸(L-Cys)是生物体内一种常见的氨基酸,主要存在于蛋白质、谷胱甘肽中,与动物体内营养和免疫等生理功能有着重要联系[1]。目前,常用的检测方法有电化学法[2]、荧光法[3, 4]、散射法[5, 6]及比色法[7~9]等。本课题组利用金、银纳米颗粒建立了L-Cys的散射法[5]和比色法[8, 9]检测技术。基于L-Cys和金纳米颗粒(AuNPs)之间的共价键以及L-Cys分子之间的COO-和NH4+的静电作用,AuNPs发生聚集且伴随着共振光散射信号的增强,建立了检测L-Cys的散射法,但该过程要25 min才能完成[5]。AuNPs具有较强的催化活性,而L-Cys诱导AuNPs聚集后其催化活性降低,伴随着溶液颜色的变化,从而实现了L-Cys的可视化检测,方法灵敏,但整个过程需要60 min,耗时较长[9]。因此需要发展一些快速检测L-Cys的方法。

    非计量硒化铜纳米颗粒(Cu2-xSe NPs)作为一种硫属铜化物半导体,具有特殊的光学性质、可调的粒径、优越的光热性能等优点[10]。本研究的原理如图 1所示,Cu2-xSe NPs能够猝灭染料罗丹明B(RhB)的荧光,而L-Cys可恢复RhB的荧光,从而建立了L-Cys的检测方法。本研究中,溶液之间主要通过电荷转移进行能量转移,RhB溶液在激发态更容易接受电子,与Cu2-xSe发生电子转移从而猝灭RhB的荧光。

    图 1

    图 1  Cu2-xSe NPs检测半胱氨酸的原理
    Figure 1.  Schematic diagram of detection of L-cysteine with Cu2-xSe nanoparticles (NPs)
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    2.   实验部分

    2.1.   仪器与试剂

    UV-2600紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);F-2700荧光分光光度计(日本日立公司);Fluorolog-3模块式荧光光谱仪(Horiba Jobin Yvon Inc,法国);S-4800扫描电子显微镜(SEM,日本日立公司);pHS-3C型酸度计(成都方舟科技开发公司);HCJ-6D水浴数显磁力搅拌器(常州朗越公司);H1650W台式高速离心机(湖南湘仪公司)。

    聚乙烯吡咯烷酮溶液(PVP,Mw 55 kDa)、二氧化硒溶液(SeO2)、乙酸铜[Cu(CH3COO)2·H2O]、抗坏血酸(Vc)、RhB溶液,L-Cys溶液均置于4℃保存,使用 pH 4.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液控制酸度。实验所用试剂均为分析纯,实验用水均为18.2 MΩ cm 超纯水。

    2.2.   实验方法

    2.2.2.   荧光测定

    向1.5 mL EP管中依次加入0.2 mL RhB溶液(3.1×10-6 mol/L)、0.20 mL Cu2-xSe NPs溶液(2.5×10-7 mol/L)、0.1 mL pH 4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,混匀后再加入适量L-Cys溶液,最后定容至1.0 mL,摇匀后在30℃水浴中反应2 min。在F-2700荧光分光光度计扫描测荧光光谱,激发波长为540 nm,狭缝为5 nm。

    2.2.1.   硒化铜纳米颗粒的制备

    本研究采用一锅法制备硒化铜纳米颗粒[11]。在圆底烧瓶中加入1.6 mL 5 g/L PVP和5.5 mL超纯水,再依次加入0.1 mL SeO2溶液(0.1 mol/L)和0.3 mL Vc溶液(0.2 mol/L)。反应10 min后,在剧烈搅拌下,加入0.1 mL Cu(CH3COO)2·H2O溶液(0.2 mol/L)和0.4 mL Vc溶液(0.2 mol/L)。剧烈混匀约30 s后置于30℃恒温水浴锅中搅拌10 h,直至溶液颜色变为墨绿色。所得产物用3500 kDa透析袋纯化24 h,再离心重悬至浓度为2.5×10-4 mol/L(按照硒原子浓度来计算),4℃保存备用。

    3.   结果与讨论

    3.1.   Cu2-xSeNPs的性质表征

    由扫描电镜图 (SEM,图 2A)和透射电镜图(TEM,图 2B)可见,Cu2-xSe NPs粒径分布较均匀,约为80 nm。通过Nano-Measurer软件对图中的全部Cu2-xSe NPs进行统计,其粒径分布如图 2C所示,最大粒径99.2 nm,最小粒径62.4 nm,平均粒径79.2 nm。

    图 2

    图 2  Cu2-xSe NPs的粒径表征. (A)扫描电镜图;(B)透射电镜图;(C)粒度分布图
    Figure 2.  Size characterization of Cu2-xSe NPs. (A) SEM; (B) TEM; (C) Particle size distribution
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    3.2.   基于罗丹明B荧光变化检测半胱氨酸

    Cu2-xSe NPs对RhB的荧光有猝灭作用,其猝灭程度与Cu2-xSe NPs浓度之间的关系如图 3A所示。结果表明,Cu2-xSe NPs浓度小于5.0×10-8 mol/L时,RhB荧光强度变化较剧烈;当Cu2-xSe NPs浓度大于5.0×10-8 mol/L时,荧光强度变化缓慢,可能原因是Cu2-xSe NPs浓度较小时,溶液中游离的RhB较多,荧光不能被完全猝灭,荧光强度变化较急剧;而当Cu2-xSe NPs浓度较大时,绝大多数的RhB吸附在Cu2-xSe NPs表面,荧光猝灭程度较大,所以再增大Cu2-xSe NPs浓度时,RhB荧光强度变化较缓慢。

    向已被Cu2-xSe NPs猝灭的RhB溶液中加入L-Cys,RhB的荧光逐渐恢复,且随着L-Cys浓度的增大,荧光恢复强度增加(图 3B)。基于恢复的RhB荧光,可以建立测定L-Cys的方法。

    图 3

    图 3  荧光变化。(A) Cu2-xSe NPs对RhB的猝灭效果及(B) L-Cys对RhB的荧光恢复效果
    Figure 3.  Changes of fluorescence. (A) Quenching of rhodamine B (RhB) fluorescence induced by Cu2-xSe NPs. Conditions: RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs (from 0 to 6 μmol/L),0,0.010,0.025,0.050,0.075,0.100,0.150; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem,575 nm. (B) Recovery of RhB fluorescence caused by cysteine. Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; RhB,6.2×10-7 mol/L; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem,575 nm
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    如图 4A所示,猝灭剂Cu2-xSe NPs的存在使RhB 的荧光寿命缩短。由此可知,Cu2-xSe NPs对RhB荧光的猝灭是一个动态猝灭过程[10],且在Cu2-xSe-RhB体系中加入L-Cys后,RhB的荧光寿命基本恢复到之前的水平。动态荧光猝灭过程中,荧光物质的激发态分子通过与猝灭剂分子的碰撞作用,以能量转移的机制或电子转移的机制丧失其激发能而返回基态。如图 4B,Cu2-xSe NPs的最大吸收峰在1045 nm处(图 4B内插图),在500~700 nm范围内基本无吸收,与RhB的发射光谱基本无重叠,因此荧光猝灭方式排除荧光共振能量转移。因此推测本研究中的猝灭方式是通过电子转移进行猝灭[12]。

    图 4

    图 4  罗丹明B荧光的猝灭机理研究. (A)荧光寿命变化; (B)等离子体共振吸收光谱图
    Figure 4.  Quenching mechanism of RhB fluorescence: (A) Lifetime change of RhB; (B) absorption spectra of RhB and Cu2-xSe
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    本实验条件下,RhB的Zeta电位为-6.0 mV; 加入Cu2-xSe NPs后,Zeta电位变为-19.8 mV,表明Cu2-xSeNPs与RhB发生结合,增加了RhB表面的负电荷。当加入L-Cys后,Zeta电位降低为-10.4 mV,表明L-Cys通过巯基与Cu2-xSe NPs发生结合,使得RhB表面的电荷得以暴露,与周围分子的定向极化率提高,从而荧光得以恢复。

    3.3.   反应条件的优化

    图 5为反应条件的优化。pH(图 4A)对体系荧光恢复效率的影响表明,L-Cys对荧光恢复效率随着pH值的增大先增加后减小,最后趋于稳定,且在pH 4.6时荧光恢复效率最高。这是由于在pH 4.6的弱酸性条件下,L-Cys接近其等电点(pI=5.07),此时为两性离子,易通过静电作用与Cu2-xSe NPs结合,更有利于巯基与Cu2-xSe NPs结合[12~14],从而增强该体系的荧光,因此选择pH 4.6作为最佳酸度条件。

    图 5

    图 5  实验条件优化. A,pH值; B,反应时间; C,温度.
    Figure 5.  Optimization of experimental conditions. A,pH. RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; Cys,7.0×10-7 mol/L; T,30℃; t,2 min. B,Reaction time. RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; Cys,7.0×10-7 mol/L; T,30℃; pH 4.6. C,Temperature. RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; Cys,7.0×10-7 mol/L; pH 4.6; t,2 min.
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    图 5B为反应时间对体系荧光恢复效率的影响,将Cu2-xSe NPs加入RhB溶液中,荧光强度显著下降,再向体系中加入L-Cys溶液,荧光恢复,且在2 min内逐渐趋于稳定,说明该反应速率较快。图 5C为温度对体系荧光的影响。当温度小于30℃时,荧光恢复效率较小,当温度大于30℃时,荧光恢复效率较大且基本不再变化。故选取反应时间2 min、反应温度30℃为最佳反应条件。

    3.4.   方法的灵敏度和选择性

    图 6A为最优条件下,L-Cys浓度与RhB荧光强度之间的关系。随着L-Cys浓度的增大,RhB的荧光逐渐恢复。L-Cys浓度在2.5×10-7~ 1.1×10-6 mol/L范围内与RhB荧光强度呈正比,线性方程为F=378.8 + 783.4c,相关系数为0.9935,检出限(3σ/k)为5.5×10-8 mol/L。图 6A内插图为在365 nm紫外灯照射下,RhB的荧光变化。随着溶液中L-Cys浓度增大,RhB的荧光逐渐增强,据此可以实现L-Cys的可视化检测。

    图 6

    图 6  方法的(A)灵敏度和(B)选择性。
    Figure 6.  A,Sensitivity of the proposed method. Conditions: RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem,575 nm. B,Selectivity of the proposed method. Conditions: RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe,5.0×10-8 mol/L; amino acids and heparin,7.0×10-7 mol/L; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem 575 nm.
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    图 6B考察了不同氨基酸以及肝素在同一浓度 (7.0×10-7 mol/L) 下对RhB荧光的恢复效果,其中包括非极性氨基酸脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe),极性不带电氨基酸甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr),极性带正电氨基酸组氨酸(His),极性带负电氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。结果表明,这些物质对该体系的荧光恢复效果均不明显,而L-Cys能够引起RhB荧光的显著恢复。本方法较高的选择性可能与L-Cys的巯基相关。

    4.   结 论

    利用Cu2-xSe NPs既可以猝灭RhB的荧光,又可以与半胱氨酸相互作用,从而使RhB的荧光恢复的特性,建立了一种检测半胱氨酸含量的荧光分析法。作为新型荧光猝灭探针,Cu2-xSe的合成方法相比其它方法[15]简单容易;与其它纳米材料[16]相比,本研究建立的检测半胱氨酸的荧光分析法具有相对较高的灵敏度;相比于本研究组前期检测半胱氨酸的工作[5, 9],本方法具有检测快速的优点。

    1. [1]

      Li R S, Zhang H Z, Ling J, Huang C Z, Wang J. Appl. Spectrosc. Rev., 2016, 51(2): 129-147

    2. [2]

      ZHONG Yuan-Wen, LIN Mou-Hong, ZHOU Jie-Dan, LIU Ying-Ju. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38(2): 229-232 钟苑雯, 林谋宏, 周洁丹, 刘英菊. 分析化学, 2010, 38(2): 229-232

    3. [3]

      CHEN Shu, FAN Ya, YANG Ying, YE Li-Ying, LONG Yun-Fei. Chinese J. Anal. Chem., 2012, 40(1): 173-176 陈 述, 范 亚, 杨 颖, 叶丽英, 龙云飞. 分析化学, 2012, 40(1): 173-176

    4. [4]

      LIAO Xiao-Qing, WANG Hui-Ying, LI Zai-Jun. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(12): 1820-1828 廖小晴, 王会影, 李在均. 分析化学, 2015, 43(12): 1820-1828

    5. [5]

      Wang J, Li Y F, Huang C Z, Wu T. Anal. Chim. Acta, 2008, 626(1): 37-43

    6. [6]

      Li Z, Duan X, Liu C, Du B. Anal. Biochem., 2006, 351(1): 18-25

    7. [7]

      LI Zheng-Ping, DUAN Xin-Rui, BAI Yu-Hui. Chinese J. Anal. Chem., 2006, 34(8): 1149-1152 李正平, 段新瑞, 白玉惠. 分析化学, 2006, 34(8): 1149-1152

    8. [8]

      Huang J T, Zeng Q L , Yang X X, Wang J. Analyst, 2013, 138(18): 5296-5302

    9. [9]

      Li R S, Liu H, Chen B B, Zhang H Z, Huang C Z, Wang J. Anal. Methods, 2016, 8(11): 2494-2501

    10. [10]

      Lie S Q, Wang D M, Gao M X, Huang C Z. Nanoscale, 2014, 6(17): 10289-10296

    11. [11]

      Zhao H X, Liu L Q, Liu Z D, Wang Y, Zhao X J, Huang C Z. Chem. Commun., 2011, 47(9): 2604-2606

    12. [12]

      XU Qin, WEI Huan-Ping, HU Xiao-Ya. Chinese J. Anal. Chem., 2013, 41(7): 1102-1106 徐 琴, 魏焕平, 胡效亚. 分析化学, 2013, 41(7): 1102-1106

    13. [13]

      Zheng H, Rivest J B, Miller T A. Science, 2011, 333(6039): 206-209

    14. [14]

      Luther J M, Jain P K, Ewers T, Alivisatos A. Nat. Mater., 2011, 10(5): 361-366

    15. [15]

      Chen L, Chen Y B, Wu L M. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126 (50): 16334-16335

    16. [16]

      Šimšíková M, Čechal J, Zorkovská A, Antalík M, Sikola T. Colloid. Surface B, 2014, 123: 95-958

  • Figure 1  Schematic diagram of detection of L-cysteine with Cu2-xSe nanoparticles (NPs)

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    Figure 2  Size characterization of Cu2-xSe NPs. (A) SEM; (B) TEM; (C) Particle size distribution

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    Figure 3  Changes of fluorescence. (A) Quenching of rhodamine B (RhB) fluorescence induced by Cu2-xSe NPs. Conditions: RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs (from 0 to 6 μmol/L),0,0.010,0.025,0.050,0.075,0.100,0.150; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem,575 nm. (B) Recovery of RhB fluorescence caused by cysteine. Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; RhB,6.2×10-7 mol/L; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem,575 nm

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    Figure 4  Quenching mechanism of RhB fluorescence: (A) Lifetime change of RhB; (B) absorption spectra of RhB and Cu2-xSe

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    Figure 5  Optimization of experimental conditions. A,pH. RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; Cys,7.0×10-7 mol/L; T,30℃; t,2 min. B,Reaction time. RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; Cys,7.0×10-7 mol/L; T,30℃; pH 4.6. C,Temperature. RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; Cys,7.0×10-7 mol/L; pH 4.6; t,2 min.

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    Figure 6  A,Sensitivity of the proposed method. Conditions: RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe NPs,5.0×10-8 mol/L; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem,575 nm. B,Selectivity of the proposed method. Conditions: RhB,6.2×10-7 mol/L; Cu2-xSe,5.0×10-8 mol/L; amino acids and heparin,7.0×10-7 mol/L; T,30℃; t,2 min; pH 4.6; λem 575 nm.

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  • 收稿日期:  2016-05-27
  • 修回日期:  2016-08-14
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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