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• 以天然产物为先导进行结构修饰与改造是创制新药物的重要途径之一^[1].天然产物stilbenes, 即二苯乙烯化合物, 是植物受到病虫害侵害或其他不利刺激时产生的应急产物, 在自然界中广泛存在.大量研究表明, 二苯乙烯及其衍生物具有广泛的抗癌^[2]、抗氧化^[3]、抗炎^[4]、抗白血病^[5]、抗血小板凝集^[6]和血管舒张^[7]等生物生理功能, 在医药、保健品等领域受到人们广泛关注, 其中白藜芦醇(Resveratrol)、紫檀芪(Pterostilbene)已具有很大的市场需求, 且与日剧增.相对其医药活性而言, 二苯乙烯化合物的农药活性研究较少, 文献报道其具有杀虫^[8]、杀菌^[9]、杀线虫^[10]和抑藻^[11]等活性.本课题组研究工作^[12]也表明, 部分3, 5-二甲氧基二苯乙烯化合物具有良好的杀蚊和抑菌活性.鉴于其广谱的生物活性, 基于天然二苯乙烯骨架为先导进行生物活性结构的发展和优化越来越受到研究者的关注^{[13, 14]}.

  含氮杂环化合物由于其类似生物体内生物碱结构, 具有对靶标专一性高、环境相容性好等特点, 已成为新药创制的主流研究领域.作为一个经典的含氮杂环, 噻唑杂环及其衍生物已经被发现具有抗癌^[15]、镇痛^[16]、抗炎^[17]、抗菌^[18]、杀虫^[19]和除草^[20]等广谱的生物活性.其中, 很多噻唑类化合物已在医药和农药等领域商品化应用, 比如消炎药物美洛昔康、抗癌药物达沙替尼、杀虫剂噻虫胺和杀菌剂苯噻菌胺等.据文献[21]报道以及本课题组^[22]研究结果表明, 一些4-(2, 6-二氟苯基)噻唑衍生物具有良好的抑菌和杀虫活性.

  由上可知, 二苯乙烯类和噻唑类化合物均具有广泛的医药和农药活性.为了继续寻找具有良好生物活性的新型杂环药物先导化合物, 本课题组在前期工作^[23~26]基础上, 利用活性亚结构杂合策略, 将二苯乙烯骨架中的一个苯环用4-(2, 6-二氟苯基)噻唑环替换, 设计合成了一系列未见报道的取代苯乙烯基噻唑类化合物(图 1), 同时测试了其抗菌活性和Top1抑制活性.目标化合物的结构均经¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS表征确证, 合成路线如Scheme 1所示.

  图 1

  

  图 1.  目标化合物的设计策略

  Figure 1.  Design strategy of title compounds

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  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物的合成路线

  Scheme 1.  Synthetic route of title compounds

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  1.   结果与讨论

  1.1   合成与波谱

  以2, 6-二氟苯乙酮为起始原料, 与溴化铜反应进行α-溴化后, 再与硫代乙酰胺环合制得到4-(2, 6-二氟苯基)-2-甲基噻唑(2), 中间体2的噻唑环5-位和苄位在不同的条件下相继被溴化得到5-溴-2-(溴甲基)-4-(2, 6-二氟苯基)噻唑(4).在中间体4的制备过程中, 由于5-位反应活性高于苄位, 5-位优先被溴化, 因此难以通过单步苄位溴化反应得到单一苄位溴化的产物.同时, 将中间体2与过量的NBS进行一锅法溴化反应, 仅仅得到少量的二溴中间体4.因此, 中间体4的制备采取分步溴化, 首先中间体2的5-位首先通过亲核取代机理被NBS溴化, 随后得到的中间体3进一步在光照条件下与NBS发生苄位自由基溴化, 得到二溴中间体4.中间体4和亚磷酸三乙酯发生Arbuzov反应得到膦酸酯5, 不经分离直接与取代苯甲醛在碱性条件下通过Wittig-Horner反应得到目标产物6a~6p, 收率为47.4%~66.3%.目标化合物结构均经¹H NMR, ¹³C NMR和ESI-HRMS表征确证.从¹H NMR数据可以看出, 与噻唑环相连的烯烃CH化学位移为δ 7.14~7.37, 而与苯环相连的烯烃CH化学位移出现为δ 7.31~7.74, 均呈现双重峰, 其偶合常数J＝16.00 Hz或16.50 Hz, 说明了目标化合物中烯烃双键为E构型^[12].在ESI-HRMS图谱中可以看出, 所有目标化合物均显示出了较强的[M+H]⁺峰.

  1.2   目标化合物的杀菌活性

  采用含药马铃薯琼脂培养基(PDA)法测试了目标化合物对小麦赤霉病菌(FusaHum graminearum), 玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis), 黄瓜蔓枯病菌(Mycosphaerella melonis)和水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)四种菌体的抑制活性, 药剂质量浓度为100 μg/mL.以嘧菌酯(Azoxystrobin)为对照药剂, 以无菌水为空白对照(CK), 测试结果见表 1.

  表 1

  

  表 1  目标化合物6a~6p的杀菌活性(抑制率/%)^a

  Table 1.  Antifungal activities of compounds 6a~6p (inhibition rate/%)

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  Compd.	R	小麦赤霉病菌				玉米小斑病菌	黄瓜蔓枯病菌	水稻纹枯病菌
  		100 μg/mL	20 μg/mL	4 μg/mL		100 μg/mL	100 μg/mL	100 μg/mL
  6a	H	51.2	—	—		48.3	30.6	11.0
  6b	2-CH3	43.6	—	—		19.2	19.8	0.0
  6c	3-CH3	27.3	—	—		25.7	21.1	6.8
  6d	4-CH3	20.0	—	—		5.6	57.2	13.4
  6e	4-tert-C4H9	19.7	—	—		58.1	41.8	7.8
  6f	2-OCH3	35.4	—	—		12.2	50.7	9.3
  6g	3-OCH3	11.9	—	—		63.5	17.6	8.7
  6h	4-OCH3	33.5	—	—		20.3	25.6	12.5
  6i	4-SCH3	27.0	—	—		30.0	20.0	0.0
  6j	4-F	67.6	0	0		28.1	22.4	10.9
  6k	2-Cl	71.6	16.7	0		13.6	42.3	14.6
  6l	4-Cl	51.1	—	—		38.4	34.9	14.0
  6m	2, 4-Cl2	58.3	—	—		0.0	39.7	0.0
  6n	2-Br	52.9	—	—		40.7	27.5	0.0
  6o	3-Br	48.1	—	—		66.2	23.7	10.4
  6p	4-CF3	86.7	21.6	0		32.1	56.7	18.7
  Control	Azoxystrobin	94.4	87.0	45.4		79.2	91.7	90.0
  CK	Water	0				0.0	0	0.0
  a — refers to “not tested”.

  初步杀菌活性测试结果表明, 大部分目标化合物在100 μg/mL浓度下对小麦赤霉病菌、玉米小斑病菌和黄瓜蔓枯病菌均呈现出一定的抑制活性, 但对水稻纹枯病菌基本没有抑制活性.在100 μg/mL浓度下, 部分化合物表现出中等及以上抑制活性, 如化合物6a、6j、6k、6l、6m、6n和6p对小麦赤霉病菌的抑制率均超过50%, 其中6j、6k和6p的抑制率分别为67.6%、71.6%和86.7%, 且总体上当在苯环上引入吸电子基团(如卤素或三氟甲基)时, 化合物活性比在苯环上引入供电子基团(如烷基或甲氧(硫)基)时要好.测试了化合物6j、6k和6p在20和4 μg/mL浓度下对小麦赤霉病菌的抑制活性, 发现其抑制活性随浓度降低而下降较快, 在20 μg/mL时其活性基本消失.此外, 在100 μg/mL浓度下化合物6e、6g和6o对玉米小斑病菌的抑制率均超过50%, 其中6o的抑制率为66.2%, 化合物6d、6f和6p对黄瓜蔓枯病菌的抑制率也超过50%, 其活性与结构之间未表现出明显规律性.

  1.3   目标化合物的Top1抑制活性

  DNA拓扑异构酶(topoisomerase)是抗肿瘤药物的重要靶点.本实验以拓扑异构酶I (Top1)作靶标酶, 采用DNA松散实验测试了50 μmol·L^－1浓度下目标化合物6a~6p对Top1的抑制活性, 以喜树碱(CPT)为阳性对照药剂.所得数据相对于CPT抑制活性, 半定量表达如下: ++++表示80%以上的活性; +++表示40%~79%; ++表示10%~39%; +表示小于10%的活性.每个实验至少重复两次.测试结果见表 2.从表中可以看出, 在50 μmol·L^－1浓度下, 所有化合物对Top1均表现出一定程度的抑制活性, 其中化合物6c、6e、6j、6l、6m、6n和6p的抑制活性为++, 化合物6k的抑制活性显示为+++.选取活性较好的化合物6k (R＝2-Cl)进行了125~0.2 μmol·L^－1浓度梯度的活性测试, 结果见图 2.从图中可以看出, 化合物6k对Top1的抑制作用呈现剂量依赖性, 浓度越低抑制活性越差, 但当测试浓度降至0.2 μmol·L^－1时仍呈现出一定程度的抑制活性.

  表 2

  

  表 2  50 μmol·L^－1浓度下化合物6a~6p的Top1抑制活性

  Table 2.  Top1 inhibitory activities of compounds 6a~6p at 50 μmol·L^－1

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  Compd.	Relaxation assay
  6a	+
  6b	+
  6c	++
  6d	+
  6e	++
  6f	+
  6g	+
  6h	+
  6i	+
  6j	++
  6k	+++
  6l	++
  6m	++
  6n	++
  6o	+
  6p	++

  图 2

  

  图 2.  125~0.2 μmol·L^－1浓度梯度下化合物6k抑制Top1介导的DNA松散实验

  Figure 2.  Top1-mediated relaxation assay of compound 6k at 125~0.2 μmol·L^－1

  Lane 1, pBR322 DNA alone; Lane 2, pBR322 DNA and Top1 without compound; Lanes 3~7, pBR322 DNA. Top1 and compounds at 0.2, 1, 5, 25, 125 μmol·L^－1, respectively. R, relaxed DNA; Sc, supercoiled DNA

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  2.   结论

  基于天然stilbenes骨架结构, 采用活性亚结构杂合策略将其与含氟苯基噻唑环结构相杂合, 设计合成了16个未见文献报道的新型取代苯乙烯基噻唑类化合物.目标化合物结构均经¹H NMR、¹³C NMR和ESI-HRMS确证.初步生物活性测试结果表明, 在100 mg/L浓度下部分化合物对若干病原真菌表现出中等抑制活性, 其中化合物6p对小麦赤霉病菌的抑制率为86.7%;同时, 所有化合物在50 μmol·L^－1浓度下均具有一定的Top1抑制活性, 其中化合物6k在0.2 μmol·L^－1浓度下仍呈现出一定程度的Top1抑制活性, 结果表明上述新型取代苯乙烯基噻唑结构具有进一步优化的潜在价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振仪(以CDCl₃为溶剂, TMS为内标), Shimadzu LCMS-IT-TOF质谱仪(ESI), X-4型数字显示熔点测定仪(温度计未校正).本实验所用试剂均为市售分析纯.中间体2-溴-1-(2, 6-二氟苯基)乙酮(1)参照文献[27]合成, 收率92.6%;中间体4-(2, 6-二氟苯基)-2-甲基噻唑(2)参照文献[28]合成, 收率90.9%.

  3.2   化合物的合成

  3.2.1   5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-甲基噻唑(3)的合成

  将4-(2, 6-二氟苯基)-2-甲基噻唑(2) (2.11 g, 10 mmol)和N-溴代丁二酰亚胺(NBS) (1.96 g, 11 mmol)溶于20 mL乙酸乙酯中, 然后加热至回流反应3 h.冷却至室温, 水洗, 有机相干燥, 减压脱溶, 所得固体用无水乙醇重结晶得到黄色固体5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-甲基噻唑(3) 2.44 g, 收率84.0%. m.p 71~72 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.46~7.33 (m, 1H), 7.00 (t, J＝7.50 Hz, 2H), 2.73 (s, 3H).其熔点及核磁数据与文献^[28]值一致.

  3.2.2   中间体5-溴-2-(溴甲基)-4-(2, 6-二氟苯基)噻唑(4)的合成

  将中间体3 (2.90 g, 10 mmol)和NBS (1.96 g, 11 mmol)溶于20 mL乙腈中, 15 W LED灯(波长λ＝450~465 nm)照射下常温搅拌反应.薄层色谱(TLC)检测反应进程, 约4 h后反应完毕.加入50 mL乙酸乙酯, 依次用饱和碳酸氢钠和水洗涤, 有机相干燥, 减压脱溶, 所得固体用无水乙醇重结晶得到黄色固体5-溴-2-(溴甲基)-4-(2, 6-二氟苯基)噻唑(4) 2.81 g, 收率76.1%. m.p 85~86 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.48~7.34 (m, 1H), 7.02 (dd, J＝8.50, 7.50 Hz, 2H), 4.72 (s, 2H).其熔点及核磁数据与文献值^[28]一致.

  3.2.5   二乙基((4-(2, 6-二氟苯基)噻唑-2-基)甲基)膦酸酯(5)的合成

  将中间体4 (3.70 g, 10 mmol)和亚磷酸三乙酯(3.34 g, 20 mmol)溶于20 mL甲苯中, 加热至回流反应2 h.反应结束, 减压脱去溶剂及过量亚磷酸三乙酯, 得到深棕色油状液体, 即中间体膦酸酯5粗品, 不经提纯直接进入下步反应.

  3.2.6   目标化合物(E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-取代苯乙烯基噻唑(6)的合成

  将上步所得膦酸酯5、取代苯甲醛(12 mmol)和NaOH (0.48 g, 12 mmol)溶于20 mL DMF中, 室温下搅拌反应, TLC检测反应过程.反应结束, 加入50 mL水, 继续搅拌30 min, 然后用CHCl₃萃取(30 mL×3), 有机层合并, 无水硫酸钠干燥、过滤、减压脱溶, 残余物用柱层析[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝5:1]纯化得到目标化合物6a~6p.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-苯乙烯基噻唑(6a):黄色固体, 收率53.2%. m.p. 103~105 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.54 (d, J＝7.50 Hz, 2H), 7.49~7.33 (m, 5H), 7.27 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.09~7.00 (m, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 167.2, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.3, 135.5, 135.3, 131.1 (t, J＝10.00 Hz), 129.3, 128.9, 127.2, 121.1, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.2 (t, J＝18.75 Hz), 109.0. HRMS (ESI) calcd C₁₇H₁₁BrF₂NS [M+H]⁺ 377.9765, found 377.9759.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(2-甲基苯乙烯基)噻唑(6b):黄色固体, 收率49.7%. m.p. 128~130 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.64~7.58 (m, 2H), 7.43 (m, 1H), 7.30~7.16 (m, 4H), 7.08~7.01 (m, 2H), 2.47 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 167.5, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.3, 136.7, 134.3, 133.3, 131.1 (t, J＝10.00 Hz), 130.8, 129.1, 125.5, 124.8, 122.3, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.1 (t, J＝20.00 Hz), 108.9, 19.9. HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₃BrF₂NS [M+H]⁺ 391.9915, found 391.9912.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(3-甲基苯乙烯基)噻唑(6c):黄色固体, 收率65.3%. m.p. 68~70 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.47~7.39 (m, 1H), 7.37~7.32 (m, 3H), 7.31~7.24 (m, 2H), 7.17 (d, J＝7.50 Hz, 1H), 7.04 (dd, J＝8.50, 7.5 Hz, 2H), 2.39 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 167.2, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.2, 138.5, 135.6, 135.2, 131.0 (t, J＝10.00 Hz), 130.1, 128.8, 127.9, 124.3, 120.8, 111.6 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.1 (t, J＝20.00 Hz), 108.8, 21.3. HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₃BrF₂NS [M+H]⁺ 391.9915, found 391.9928.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(4-甲基苯乙烯基)噻唑(6d):黄色固体, 收率63.4%. m.p. 144~146 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.46 (d, J＝8.00 Hz, 2H), 7.44 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.37 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.35~7.31 (m, 1H), 7.21 (d, J＝8.00 Hz, 2H), 7.02 (t, J＝8.00 Hz, 2H), 2.39 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.7, 160.6 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.1, 139.2, 134.9, 132.9, 129.7, 129.6, 129.6, 127.1, 120.6, 118.9 (t, J＝2.50 Hz), 112.8 (t, J＝17.50 Hz), 111.8 (dd, J＝21.25, 5.00 Hz). HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₃BrF₂NS [M+H]⁺ 391.9915, found 391.9941.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(4-叔丁基苯乙烯基)噻唑(6e):黄色液体, 收率60.1%. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.48 (d, J＝8.50 Hz, 2H), 7.44~7.39 (m, 3H), 7.35 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.25 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.08~7.01 (t, J＝8.50 Hz, 2H), 1.35 (s, 9H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 167.4, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 152.7, 144.2, 135.4, 132.5, 131.0 (t, J＝10.00 Hz), 127.0, 125.9, 120.3, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.2 (t, J＝18.90 Hz), 108.6, 34.8, 31.2. HRMS (ESI) calcd C₂₁H₁₉BrF₂NS [M+H]⁺ 434.0384, found 434.0411.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(2-甲氧基苯乙烯基)噻唑(6f):黄色液体, 收率53.6%. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.42 (m, 1H), 7.36~7.28 (m, 2H), 7.26 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.12 (d, J＝8.00 Hz, 1H), 7.09~7.00 (m, 3H), 6.91 (dd, J＝8.00, 2.50 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 167.0, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 159.9, 144.3, 136.6, 135.3, 131.0 (t, J＝10.00 Hz), 129.9, 121.3, 119.9, 115.2, 112.0, 111.6 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.1 (t, J＝20.00 Hz), 109.0, 55.2. HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₃BrF₂NOS [M+H]⁺ 407.9864, found 407.9869.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(3-甲氧基苯乙烯基)噻唑(6g):黄色液体, 收率47.4%. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.47~7.39 (m, 1H), 7.36~7.29 (m, 2H), 7.26 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.13 (d, J＝7.50 Hz, 1H), 7.09~7.01 (m, 3H), 6.91 (dd, J＝8.00, 2.50 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.3, 160.4 (dd, J＝300.00, 6.30 Hz), 144.1, 137.0, 134.8, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 121.7, 119.9, 119.2, 115.0, 112.6 (t, J＝17.50 Hz), 111.8 (dt, J＝21.00, 6.30 Hz), 55.2. HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₃BrF₂NOS [M+H]⁺ 407.9864, found 407.9867.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(4-甲氧基苯乙烯基)噻唑(6h):黄色固体, 收率66.3%. m.p. 102~103 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.48 (d, J＝9.00 Hz, 2H), 7.43 (m, 1H), 7.31 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.14 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.07~7.00 (m, 2H), 6.93 (d, J＝8.50 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.9, 160.6 (dd, J＝250.0, 6.25 Hz), 160.4, 144.0, 134.6, 129.6 (t, J＝10.00 Hz), 128.6, 128.4, 119.5, 118.6, 114.3, 112.9 (t, J＝17.50 Hz), 111.8 (dd, J＝21.25, 6.25 Hz), 55.3. HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₃BrF₂NOS [M+H]⁺ 407.9864 found. 445.9884.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(4-硫甲基苯乙烯基)噻唑(6i):黄色固体, 收率60.1%. m.p. 102~104 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.49~7.38 (m, 3H), 7.31 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.28~7.16 (m, 3H), 7.04 (dd, J＝8.50, 7.50 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 167.2, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.3, 140.5, 134.8, 132.0, 131.1 (t, J＝10.00 Hz), 127.5, 126.3, 120.2, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.2 (t, J＝20.00 Hz), 108.8, 15.3. HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₃BrF₂NS₂ [M+H]⁺423.9635, found 423.9636.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(4-氟苯乙烯基)噻唑(6j):黄色固体, 收率57.3%. m.p. 105~106 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.51 (dd, J＝8.50, 5.50 Hz, 2H), 7.43 (m, 1H), 7.33 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.18 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.09 (t, J＝8.50 Hz, 2H), 7.04 (t, J＝8.50 Hz, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.9, 163.3 (d, J＝251.25 Hz), 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.4, 134.1, 131.6 (d, J＝3.75 Hz), 131.1 (t, J＝11.25 Hz), 129.0, 128.9, 120.8 (d, J＝2.50 Hz), 116.1, 116.0, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.1 (t, J＝20.00 Hz), 109.0. HRMS (ESI) calcd C₁₇H₁₀BrF₃NS [M+H]⁺ 395.9664, found 395.9688.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(2-氯苯乙烯基)噻唑(6k):黄色固体, 收率60.3%. m.p. 145~147 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.74 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.70~7.64 (m, 1H), 7.48~7.38 (m, 2H), 7.33~7.24 (m, 3H), 7.11~6.98 (m, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.9, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.5, 134.1, 133.5, 131.4, 131.1 (t, J＝10.00 Hz), 130.1, 127.2, 126.9, 123.7, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.1 (t, J＝18.75 Hz), 109.7. HRMS (ESI) calcd C₁₇H₁₀BrClF₂NS [M+H]⁺ 411.9368, found 411.9380.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(4-氯苯乙烯基)噻唑(6l):黄色固体, 收率55.1%. m.p. 117~119 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.46 (d, J＝8.50 Hz, 2H), 7.43~7.40 (m, 1H), 7.36 (d, J＝8.50 Hz, 2H), 7.32 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.22 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.04 (m, J＝8.50 Hz, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.6, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.5, 135.0, 133.9, 133.8, 131.2 (t, J＝10.00 Hz), 129.2, 128.3, 121.5, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.1 (t, J＝18.75 Hz), 109.3. HRMS (ESI) calcd C₁₇H₁₀BrClF₂NS [M+H]⁺ 411.9368, found 411.9384.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(2, 4-二氯苯乙烯基)噻唑(6m):黄色固体, 收率59.3%. m.p. 99~100 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.66 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.60 (d, J＝8.50 Hz, 1H), 7.46~7.41 (m, 2H), 7.30~7.28 (m, 1H), 7.25 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.04 (t, J＝8.50, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 165.7, 160.6 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.5, 134.9, 134.4, 132.5, 129.8 (t, J＝8.80 Hz), 129.5, 127.6, 127.5, 124.5, 119.9 (t, J＝3.75 Hz), 112.6 (t, J＝17.50 Hz), 111.9 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz). HRMS (ESI) calcd C₁₇H₉BrCl₂F₂NS [M+H]⁺ 445.8986, found 445.8981.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(2-溴苯乙烯基)噻唑(6n):黄色固体, 收率51.9%. m.p. 141~143 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.70 (d, J＝16.00 Hz, 1H), 7.66 (dd, J＝8.00, 1.50 Hz, 1H), 7.62 (dd, J＝8.00, 1.00 Hz, 1H), 7.43 (m, 1H), 7.35 (t, J＝7.50 Hz, 1H), 7.27~7.17 (m, 2H), 7.04 (dd, J＝8.50, 7.50 Hz, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.8, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.5, 135.2, 134.0, 133.4, 131.1 (t, J＝10.00 Hz), 130.3, 127.8, 127.1, 124.6, 123.9, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.1 (t, J＝18.75 Hz), 109.7. HRMS (ESI) calcd C₁₇H₁₀Br₂F₂NS [M+H]⁺ 455.8863, found 455.8855.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)噻唑-2-(3-溴苯乙烯基)噻唑(6o):黄色固体, 收率47.9%. m.p. 85~87 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.68 (t, J＝2.00 Hz, 1H), 7.51~7.39 (m, 3H), 7.33~7.20 (m, 3H), 7.04 (dd, J＝8.50, 7.50 Hz, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 166.3, 160.7 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.6, 137.5, 133.6, 132.0, 131.2 (t, J＝10.00 Hz), 130.4, 130.0, 125.7, 123.1, 122.2, 111.7 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz), 111.0 (t, J＝18.75 Hz), 109.6. HRMS (ESI) calcd C₁₇H₁₀Br₂F₂NS [M+H]⁺ 455.8863, found 455.8873.

  (E)-5-溴-4-(2, 6-二氟苯基)-2-(4-三氟甲基苯乙烯基)噻唑(6p):黄色固体, 收率65.3%. m.p. 89~91 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.70~7.59 (dd, J＝8.50, 5.00 Hz, 4H), 7.44 (m, 1H), 7.39 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.33 (d, J＝16.50 Hz, 1H), 7.09~7.01 (m, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 165.4, 160.6 (dd, J＝250.00, 6.25 Hz), 144.6, 139.1, 132.9, 130.5 (d, J＝32.50 Hz), 129.9 (t, J＝11.25 Hz), 127.2, 125.8 (q, J＝2.50 Hz), 123.7, 122.9, 119.9 (t, J＝2.50 Hz), 112.6 (t, J＝16.25 Hz), 111.9 (dd, J＝20.00, 5.00 Hz). HRMS (ESI) calcd C₁₈H₁₀BrF₅NS [M+H]⁺ 445.9632, found 445.9643.

  3.3   杀菌活性测试

  杀菌活性采用含药培养基法^[29]测试:取各500 mg/L化合物药液2 mL, 加入冷却至45 ℃的8 mL的PDA中, 制成终浓度为100 mg/L的含药培养基平板.以嘧菌酯(Azoxystrobin)为对照药剂, 以无菌水为空白对照(CK).然后从培养好的试验病菌菌落边缘取4 mm直径菌丝块, 移至含药培养基上, 每处理3次重复.处理完毕, 置于(24±1) ℃的恒温生化培养箱中培养, 72 h后测量菌落直径, 计算生长抑制率.计算公式如下:

  $ 生长抑制率(\%)＝[(空白对照菌落直径－处理菌落\\直径)/空白对照菌落直径]×100 \% $

  3.4   Top1抑制活性测试

  采用DNA松散实验测试了50 μmol·L^－1浓度下化合物对Top1的抑制活性, 以喜树碱(CPT)为阳性对照药剂.对活性较好的化合物进行了125~0.2 μmol·L^－1浓度梯度的活性测试.具体实验过程如下:

  3.4.1   初筛

  反应系统(20 μL): 0.2 μg负超螺旋型质粒pBR322 DNA 1 μL, 0.5 U的Top1 1 μL, 50 μmol·L^－1待测化合物1 μL, 缓冲溶液(20 mmol·L^－1 Tris, pH 7.5, 0.1 mmol·L^－1 EDTA, 10 mmol·L^－1 MgCl₂, 100 mmol·L^－1 KCl, 50 μg/mL acetylated BSA)补足体积.配置好样品后, 在37 ℃下孵育0.5 h.孵育完毕后加入4 μL 6×Loading buffer混合, 加入0.8%琼脂糖凝胶的样品孔中, 4.6 V/cm电泳1.5 h.电泳结束后, 将琼脂糖凝胶放入1×gel red的水溶液中染色0.5 h, 照相.

  3.4.2   浓度梯度

  初筛活性较优的化合物分别配制成0.2, 1, 5, 25, 125 μmol·L^－1的待测化合物.反应系统(20 μL): 0.5 μg负超螺旋型质粒pBR322 DNA 1 μL, 1 U的Top1 1 μL, 0.2, 1, 5, 25, 125 μmol·L^－1待测化合物1 μL, 缓冲溶液(20 mmol·L^－1 Tris, pH 7.5, 0.1 mmol·L^－1 EDTA, 10 mmol· L^－1 MgCl₂, 100 mmol·L^－1 KCl, 50 μg/mL acetylated BSA)补足体积.后续操作同初筛.

  辅助材料(Supporting Information)  化合物6a~6p的¹H NMR, ¹³C NMR和ESI-HRMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn)上下载.

  
  
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  图 1  目标化合物的设计策略

  Figure 1  Design strategy of title compounds

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  图式 1  目标化合物的合成路线

  Scheme 1  Synthetic route of title compounds

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  图 2  125~0.2 μmol·L^－1浓度梯度下化合物6k抑制Top1介导的DNA松散实验

  Figure 2  Top1-mediated relaxation assay of compound 6k at 125~0.2 μmol·L^－1

  Lane 1, pBR322 DNA alone; Lane 2, pBR322 DNA and Top1 without compound; Lanes 3~7, pBR322 DNA. Top1 and compounds at 0.2, 1, 5, 25, 125 μmol·L^－1, respectively. R, relaxed DNA; Sc, supercoiled DNA

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  表 1  目标化合物6a~6p的杀菌活性(抑制率/%)^a

  Table 1.  Antifungal activities of compounds 6a~6p (inhibition rate/%)

  Compd.	R	小麦赤霉病菌				玉米小斑病菌	黄瓜蔓枯病菌	水稻纹枯病菌
  		100 μg/mL	20 μg/mL	4 μg/mL		100 μg/mL	100 μg/mL	100 μg/mL
  6a	H	51.2	—	—		48.3	30.6	11.0
  6b	2-CH3	43.6	—	—		19.2	19.8	0.0
  6c	3-CH3	27.3	—	—		25.7	21.1	6.8
  6d	4-CH3	20.0	—	—		5.6	57.2	13.4
  6e	4-tert-C4H9	19.7	—	—		58.1	41.8	7.8
  6f	2-OCH3	35.4	—	—		12.2	50.7	9.3
  6g	3-OCH3	11.9	—	—		63.5	17.6	8.7
  6h	4-OCH3	33.5	—	—		20.3	25.6	12.5
  6i	4-SCH3	27.0	—	—		30.0	20.0	0.0
  6j	4-F	67.6	0	0		28.1	22.4	10.9
  6k	2-Cl	71.6	16.7	0		13.6	42.3	14.6
  6l	4-Cl	51.1	—	—		38.4	34.9	14.0
  6m	2, 4-Cl2	58.3	—	—		0.0	39.7	0.0
  6n	2-Br	52.9	—	—		40.7	27.5	0.0
  6o	3-Br	48.1	—	—		66.2	23.7	10.4
  6p	4-CF3	86.7	21.6	0		32.1	56.7	18.7
  Control	Azoxystrobin	94.4	87.0	45.4		79.2	91.7	90.0
  CK	Water	0				0.0	0	0.0
  a — refers to “not tested”.

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  表 2  50 μmol·L^－1浓度下化合物6a~6p的Top1抑制活性

  Table 2.  Top1 inhibitory activities of compounds 6a~6p at 50 μmol·L^－1

  Compd.	Relaxation assay
  6a	+
  6b	+
  6c	++
  6d	+
  6e	++
  6f	+
  6g	+
  6h	+
  6i	+
  6j	++
  6k	+++
  6l	++
  6m	++
  6n	++
  6o	+
  6p	++

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