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• 作为支撑生命运动的关键物质, 天然蛋白质由L型α-氨基酸构成, 展现单一的手性.与此相对应, 由D型α-氨基酸构成, 与天然蛋白互为对映体的蛋白分子, 被称为镜像蛋白(图 1).研究镜像蛋白为解答人们长期以来感兴趣的生命起源问题提供有益线索, 例如地球生命为何采用L型蛋白而非D型蛋白^[1]?另一方面, D型蛋白质具有稳定性好、结构多样等特点, 可以作为一类结构明确而且可调的新型功能物质, 在仿生催化^[2]、软物质材料、疾病诊断与治疗^[3]等方面带来新的机遇.

  图 1

  

  图 1.  镜像手性氨基酸及蛋白示意图

  Figure 1.  Mirror-image enantiomers of amino acid and protein

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  为了针对镜像蛋白质展开研究, 需要获取结构均一的D蛋白.自然界中, 一些含有D型氨基酸的蛋白质或多肽通过旋光异构酶来介导实现某些特定位点氨基酸的手性翻转^[4].但依赖生物重组技术来获取全部由D型氨基酸构成的镜像蛋白难以实现^[2], 化学全合成是目前高效获得镜像蛋白的唯一途径.本文综述了蛋白质化学合成方法用于镜像蛋白的研究进展, 介绍了镜像蛋白在蛋白消旋结晶、镜像蛋白药物和镜像生命再造方面的应用.

  1.   蛋白的化学合成

  1.1   固相多肽合成与片段连接

  目前, 多肽的化学全合成普遍采用Merrifield^[5]于1963年发明的固相多肽合成(solid phase peptide synthesis, SPPS)法(图 2).合成过程中, 首先多肽C端的第一个氨基酸被共价连接到树脂载体上.在后续氨基酸加入前, 需先脱除前一个氨基酸的α氨基保护基, 并进行洗涤.后续的氨基酸以α氨基保护, 主链羧基活化的形式加入.与前一氨基酸缩合形成酰胺键后, 将过量的活化氨基酸及溶液中的副产物洗涤除去, 得到肽链延长的产物.这一步骤被不断重复直到完成所有氨基酸的组装.随后所有保护基被切除, 肽链与树脂连接键也被切断, 经后续分离得到多肽产物.

  图 2

  

  图 2.  多肽固相合成法

  Figure 2.  Solid phase peptide synthesis

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  根据缩合过程中对主链氨基/侧链官能团采用保护基的不同, 固相多肽合成分为两种^[6]: (1)叔丁氧羰基(Boc)法, 采用叔丁氧羰基/苄基作为保护基^[7]. (2) 9-芴甲氧羰基(Fmoc)法, 采用9-芴甲氧羰基/叔丁基(t-Bu)作为保护基^[8].固相多肽合成法将多肽始终固定在不溶于有机相的树脂载体上, 使得每步反应后可通过洗涤、过滤手段快速分离反应液, 简化了操作, 降低了处理过程的损失, 并且可通过增大每步反应中原料的用量来提高产率.这一方法使得可以通过一次合成获得包含几十个氨基酸的多肽链, 有效提高了蛋白合成的效率.

  1992年, Kent等^[3a]通过Boc法固相合成得到了第一个镜像蛋白, 即由99个氨基酸残基组成的D型HIV-1蛋白酶(HIV-1 protease, HIV PR)(图 3).共价结构、物理性质、圆二色谱以及酶活性等方面比对表明, 合成的D型蛋白酶与天然蛋白酶具有相同的相对分子质量以及氨基酸序列.圆二色谱图(CD)上两蛋白测量数值相等但旋光相反, 符合其互为镜像的关系.酶活测试表明, 两种手性的蛋白酶只对与自身具有相同手性的底物具有水解活性, 对不同手性的底物没有活性.加入已知的肽类抑制剂时, 也只有相同手性的抑制剂对活性产生抑制作用, 然而非手性抑制剂则对两种手性的蛋白酶都产生抑制作用.

  图 3

  

  图 3.  L型(左侧)和D型(右侧)HIV-1蛋白酶

  Figure 3.  L-(left) and D-HIV-1 protease (right)

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  1.2   自然化学连接法

  虽然固相多肽合成技术的出现使多肽的获取得以实现, 但多肽合成仍存在长度的限制.由于树脂上副产物的累积, 随着肽链的延长, 粗肽纯度逐渐下降, 使得后续样品纯化变得愈发困难甚至无法实现, 因此单次固相合成的长度一般不超过60个氨基酸.但自然界中许多典型的蛋白质包含约300个残基^[9], 依靠单次固相合成是难以获取的, 这就促使化学家开发出一系列位点选择性的化学连接方法:从早期的通过生成硫酯^[10]及肟实现的片段连接^[11]到能形成天然酰胺键结构的自然化学连接(native chemical ligation)^[12]、丝氨酸/苏氨酸连接^[13]和α-酮酸羟胺连接^[14]等.其中发展的自然化学连接方法是目前应用最广泛的方法之一^[15].

  自然化学连接采用侧链无保护的肽段进行位点选择性的连接反应, 原料水溶性更好, 且生成天然蛋白中含有的酰胺键, 能够更好地反映蛋白的天然结构^[16].参与反应的肽段1的C端具有硫酯结构, 肽段2的N端为半胱氨酸残基(Scheme 1).在中性条件下, 半胱氨酸的侧链巯基对C端硫酯进行亲核进攻, 发生可逆的硫酯交换, 形成通过硫酯相连的肽段连接中间体.中间体迅速通过五元环结构发生分子内的酰基重排, 肽段1整体由巯基重排至半胱氨酸氨基, 得到稳定的天然酰胺键相连的连接产物.重排过程的不可逆性促进了反应的正向进行^[12].通过这一方法, 研究者成功合成了HIV-1蛋白酶共价二聚体^[17]、人溶菌酶^[18]及均一糖基化修饰的促红细胞生成素^[19]等.另一方面, 化学自然连接法也为获取镜像蛋白提供了可能, 其中重要的一个案例是Kent等^[20]合成的血管内皮生长因子(D-VEGF).他们首先全合成了D-VEGF的三个多肽片段, 后通过化学自然连接法拼接得到目的蛋白^[21].

  图式 1

  

  图式 1.  自然化学连接机理

  Scheme 1.  Principle of native chemical ligation

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  1.3   多肽酰肼连接法

  伴随着自然化学连接的广泛使用, 如何高效获取含C端硫酯的肽段成为人们关心的关键问题.传统方法中, 多肽硫酯可以通过Boc法固相合成获取^[7].但是Boc法在肽链切割时需要使用腐蚀性很强的氢氟酸, 并且脱保护中需反复使用三氟乙酸, 这使得Boc法不适用于含对酸敏感翻译后修饰(如糖基化、磷酸化等)的多肽合成^[22].相比之下, Fmoc法具有条件温和、对翻译后修饰兼容性性好以及利于自动化等优势, 受到研究人员的广泛应用^[23].但Fmoc法中脱保护所用的哌啶具有亲核性^[24], 在反复使用中将造成硫酯结构的氨解断裂, 限制了多肽硫酯的直接合成.

  针对这一问题, 一种可行的解决策略是在完成多肽组装后再通过一系列转化引入硫酯基团.按照该思路, 研究者发展了多种巧妙的转化方法, 例如分子内O到S^[25]和N到S^[26]酰基迁移活化法以及通过固相外加试剂活化连接臂的方法.后者所使用的连接臂包括活化磺酰胺“保险栓”(Safety-Catch)连接臂^[27]、N-酰基脲连接臂^[28]和骨架焦谷氨酰亚胺连接臂^[29]等.但是这些方法存在结构单元合成繁琐、操作复杂且很难获得硫酯活性掩蔽的硫酯前体用于大蛋白的高效收敛式合成等问题.

  2011年, 我们团队^[30]发展了蛋白酰肼法(Scheme 2).该方法将无保护多肽酰肼作为多肽硫酯前体运用到蛋白质化学合成中.在酸性水溶液(pH=3)中, 多肽酰肼在亚硝酸钠作用下可定量转化为酰基叠氮, 随后与加入到该体系的硫醇反应即可发生原位转硫酯化得到所需的酰基硫酯, 进而与另一肽段进行自然化学连接.该方法连接效率高, 消旋倾向极低, 且多肽酰肼简便易得:多肽酰肼不仅可通过Fmoc法固相合成, 还可通过intein融合表达^[31]、Sortase酶促反应^[32]、非天然氨基酸嵌入^[33]等多种方法获得, 增加了该反应的应用范围.此外, 利用多肽酰肼的活性掩蔽特性, 可以实现蛋白的收敛式合成.使用这一方法, 人们近年来成功合成了D型泛素^[45]、D型PD-L1胞外域V-domain^[56]及D型DNA聚合酶^[34]等镜像蛋白, 用于辅助蛋白结晶、D-蛋白药物研发和镜像生命再造等方面的研究.

  图式 2

  

  图式 2.  多肽酰肼连接

  Scheme 2.  Chemical ligation of peptide hydrazides

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  2.   蛋白消旋结晶

  通过X射线衍射法解析自然蛋白的晶体结构时, 需要获取振幅和相位数据来计算分子电子密度.但是自然蛋白是手型分子, 它的晶体空间上缺少一个对称中心或对称轴, 意味着它的X射线衍射相位可能会落在0和360°之间任意值, 即出现随机相位问题^[35].多种方案可用于规避上述问题, 如多波长反常色散、多重同晶置换以及分子置换等^[36]. 1993年Zawadzke等^[37]提出的外消旋蛋白结晶提供了一种新思路.他们在等量L型和D型蛋白形成的外消旋蛋白溶液中长出了非手性具有对称中心的蛋白晶体.这种晶体在X射线衍射中的相位为0°或180°, 消除了随机相位问题.

  此外, X射线衍射法存在蛋白结晶成功率较低的问题. Wukovitz与Yeates等^[38]在1995年分析指出, 外消旋蛋白结晶技术能向自然蛋白晶体中引入对称.根据空间群理论, 自然蛋白晶体缺少对称中心或对称轴的二级对称操作, 因此只能落入推算的230个空间群中有手性的65个.该技术使蛋白晶体可落入其余的165个非手性空间群中, 提高了蛋白结晶的成功率.

  凭借外消旋蛋白结晶技术的以上优势, 科学家得到了多种难以解析的自然蛋白晶体结构. Kent等在近些年利用该技术解析雪蚤抗冻蛋白(snow flea antifreeze protein)^[35a]、蝎毒BmBKTx1^[39]和kaliotoxin^[40]、蛇毒蛋白omwaprin^[41]、真菌防御素plectasin^[42]、海葵毒素ShK^[43]等蛋白和多肽的结构.其他科学家也通过这种方法得到许多类型的自然蛋白结构, 例如糖蛋白、胰岛素及其变体、绒毛蛋白以及结核杆菌蛋白^[44]等, 推进了结构生物学的研究. 2016年, 我们团队^[45]合成了27位赖氨酸位点连接的二/三泛素及其镜像对映体类似物, 并采用外消旋蛋白结晶技术, 成功解析了它们的晶体结构.

  受现有蛋白合成技术的制约, 蛋白镜像异构体的获取有时比较困难, 限制了外消旋蛋白结晶技术的运用范围.针对这一问题Kent等^[35a]于2008年首次提出了准外消旋蛋白结晶这个概念, 并且在2014年成功利用等量无糖基化的D型CCL1与N端糖基化的L型CCL1孵育出了共晶结构^[46].这说明目标蛋白可跟与其镜像相似而不完全相同的蛋白分子形成共晶, 因此在外消旋结晶中使用的镜像蛋白可被更容易合成的类似物代替.我们团队利用准外消旋蛋白结晶法对几种具有不同键接方式的寡聚泛素——M1连接的线性三/四泛素以及K11和K63连接的分叉三泛素进行了研究^[47].

  此外, L型线性三/四泛素蛋白可通过蛋白半合成方式得到, 但其严格镜像形式的化学全合成存在困难.因此, 我们团队全合成了D型的泛素单体, 然后将这两种蛋白共同孵育获取共晶结构.对该结构的分析显示出镜像泛素单体在结晶过程中会依据天然泛素链的结构进行自组装, 与其形成准外消旋体(图 4).这种方法被命名为单体/寡聚体准外消旋结晶法(monomer/oligomer quasi-racemic protein crystallography).这一方法不仅帮助解析了L型线性三/四泛素的晶体结构, 同时也证明了在准外消旋结晶中, 可以通过镜像单体的非共价组装形成天然寡聚体的镜像类似物, 拓展了人们对于底物形式的认识.

  图 4

  

  图 4.  线性四泛素形成的准外消旋体示意图

  Figure 4.  Quasi-racemates of linear tetra-Ub

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  3.   镜像蛋白药物

  与传统小分子药物相比, 蛋白与多肽药物例如白细胞介素、表皮生长因子等具有更高的靶向特异性.然而蛋白质在生物体内易被蛋白酶水解, 降低了它们的生物可利用度.解决这一问题的通常策略是在已知结构基础上对蛋白骨架或侧链进行修饰或改造以提高其抗酶解稳定性^[48].镜像D蛋白为解决该问题提供了新思路.由于与天然蛋白具有不同的手性, D型蛋白难以被体内蛋白酶识别, 不易被降解, 具备了更好的代谢稳定性^{[48, 49]}和较低免疫原性^[3], 为口服用药提供了可能^[50].

  蛋白药物筛选需要建立合适的文库, 并进行多轮的标记和区分, 最终得到目标蛋白.人们通常将目标蛋白质的基因与特殊的表达生物体结合, 然后通过表达将蛋白质展示出来.噬菌体展示技术就是能够标记和区分目标蛋白的手段之一.科学家将目标蛋白基因与噬菌体载体中的衣壳蛋白基因融合, 这样可以在不影响衣壳蛋白生物功能的情况下, 把目标蛋白展示在噬菌体表面.根据目标蛋白展示的位置不同, 展示的具体功能和特点也不大相同, 因此可对目标的文库进行区分.噬菌体展示最大的优点是可以很方便地与亲和筛选结合进行下游的筛选工作以对文库进行处理, 并且易于纯化和鉴定目标分子^[51]. Kim等^[52]于1996年建立了镜像噬菌体展示(mirror-image phase display)技术(图 5), 实现了D型多肽筛选.他们选用了酪氨酸激酶c-Src的SH3结构域作为靶蛋白, 首先通过化学全合成得到天然SH3的镜像分子D-SH3, 然后利用噬菌体展示技术筛选得到能特异性结合D-SH3的配体(L型多肽), 最后合成所得配体的镜像分子(D型多肽).由于筛选得到的L型多肽配体能特异性结合D-SH3, 根据镜像对称关系, 相应D型多肽配体也能特异性结合天然SH3 (L-SH3), 因此该D型多肽即为天然靶蛋白的镜像配体.

  图 5

  

  图 5.  镜像噬菌体展示技术示意图

  Figure 5.  Mirror-image phage display

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  镜像噬菌体展示技术的应用催生了大量潜在镜像蛋白药物(表 1).现阶段成果包括特异性结合Src SH3结构域的镜像蛋白Pep-Dl, 可辅助治疗骨疏松^[52]; 还有针对抑癌因子p53与MDM2相互作用的D-PMI及其衍生物^[53], 以及具有潜在口服性, 可抑制HIV-1进入细胞的镜像蛋白2K-PIE1及其衍生物^[54].除此之外, 经过Willbold等的验证, D1/ACI-80的衍生蛋白D3展现出了可穿透血脑屏障的特性, 该镜像蛋白可抑制淀粉体形成进而有望成为未来治疗阿茨海默症的候选药物之一^[55].我们团队也以免疫检查点PD-L1为靶标, 通过酰肼法化学全合成D型PD-L1胞外域V-domain (18-133), 利用镜像噬菌体筛选技术, 得到了第一例靶向免疫检查点PD-L1的多肽抑制剂^[56].该多肽抑制剂对PD-L1具有较好的体内活性和血清稳定性, 能够有效抑制PD-1/ PD-L1蛋白蛋白相互作用, 可减缓荷瘤小鼠的肿瘤生长, 为免疫疗法药物发现提供了新思路.

  表 1

  

  表 1  已报道的镜像蛋白药物研究

  Table 1.  Previously reported mirror-image proteins for drug development studies

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  序号	作用靶标	蛋白名称	蛋白序列	潜在药用价值
  1a	尼古丁乙酰胆碱受体	RI-CDX[63]	D-(GREIRTGRAERWSEKF)	选择性地打开血脑屏障(BBB)/血脑肿瘤屏障(BBTB), 改善用于脑靶向药物递送的体外血脑屏障单层中的胞吞效率
  2a	低密度脂蛋白相关蛋白1	RI-agiopeptide2[64]	D-(YEETKFNNRKGRSGGYFFT)
  3a	膜转移受体	未命名[65]	D-(THRPPMWSPVWP)
  4a	缓激肽2型受体	RI-bradykinin[66]	D-(RFPSFGPPR)
  5a	神经纤毛蛋白-1受体	R1-CendR[67]	D-(RPPREGR)	增强肿瘤球体的渗透能力, 在胶质母细胞瘤基因治疗中具有潜在应用
  6a	整联蛋白家族α6β1和αvβ3	D-VS[68]	D-(SVAFPSYRHRSFWSV)	靶向结合α6β1和αvβ3, 可递送药物
  7a	膜联蛋白(Anxa1)	RI-IF7[69]	D-(RQWLLFI)	与受体靶向结合, 用于药物递送
  8a	膜受体Fn14	D-Fn14 CRD[70]	D-(EGAKHGLTFSGG)
  9a		D-FNB-MPD[71]	D-(CHPREVDVELYSTVFGH)
  10a	表皮生长因子受体	D-AE[72]	D-(FALGEA)
  11a	血管内皮生长因子受体2	RIV-VEGF[73]	D-(FSMEGIHQGQHPKIRMIQMTI)
  12a		D-A7R[74]	D-(ATWLPPR)
  13b	血管内皮生长因子A	RFX037.D[75]	D-(RRRRRGGSTYKLILNGKTLKGETTTEAVDVFDAFDVFFVYAASNFSDFDDWTYDDATKTFTVTEGGSDK)	治疗性血管生成拮抗剂
  14b	Src的SH3结构域	Pep-DI[52]	D-(RCLSGLRLGLVPCA)	可能用于治疗骨质疏松症
  15b	MDM2	D-PMIα[53a]	D-(TNWYANLEKLLR)	p53-MDM2相互作用抑制剂, 恶性肿瘤的靶向分子治疗
  16b		D-PMIβ[53b]	D-(TAWYANFEKLLR)
  17b		D-PMIγ[53a]	D-(DWWPLAFEALLR)
  18b		FOXO4-DRI[59]	D-(AREGRI)
  19b		D-MDM2[76]	D-(NEPLLKWLDSFTEQSSGSG)
  20b	HIV gp41	2K-PIE1[54a]	D-(KKGACESPEWRWLCAA)	HIV-1抑制剂, 抗HIV抗病毒优势候选药
  21b		PIE7[54a]	D-(KGACDYPEWQWLCAA)
  22b		PIE12-trimer[54b]	D-(HPCDYPEWQWLCELGK)
  23b		D10-p(1~12)-2K[77]	D-(KKGACXXXXXEWXWLCAA)
  24b	β样淀粉(1-42)[78]	D1或ACI-80[79]	D-(QSHYRHISPAQV)	抑制淀粉斑的形成, 并减少β样淀粉的细胞毒性, 用于阿尔茨海默病的诊断和治疗
  25b		ACI-(87~89)[80]	D-((X)QSHYRHISPAQK)
  26b		D3[55, 81]	D-(RPRTRLHTHRNR)
  27b	miRNA	D-peptide-7[82]	D-(PGRC( & )KPKRRRRATC( & )RAV)c	miRNA活性抑制剂, 反向进行miRNA生理功能的调控
  28b	诱导多能干细胞上碱性磷酸酶	D-3[83]	萘酚-D-(FFFY(OPO3H2))	抗iPSC药物, 防止潜在致肿瘤风险
  29b	蛋白酶3的膜界面结合位点	D-SAK-12[84]	D-(SAKEAFFKLLAS)	抑制剂, 治疗慢性炎症的潜在靶标
  30b	Grb2的SH2结构域	D-Grb2的SH2结构域蛋白[85]	D-Grb2 SH2 domain	抑制剂, 有望用于靶向抗癌
  31b	Ras蛋白	D-KRas(G12V)[86]	D-KRas1-166	抑制剂, 相关疾病靶标的新疗法
  32b	未知的细胞靶标	RI-SP5[87]	D-(PRPSPKMGVSVS)	与肿瘤内皮有较强的关联
  a Serial number (1~12) is a recognition molecule that can be used for targeted drug delivery. b Serial number (13~32) is a therapeutic molecule that exerts its effect by directly interacting with the target. c C( & ) represents a disulfide bond.

  除文库筛选外, D型反序(D-retro inverso, DRI)也是一种蛋白药物设计的思路.这一策略将天然活性蛋白的一级序列反向颠倒, 并全部替换成相应的D型氨基酸, 使其保持相似的生物活性^[57]. Martins等^[58]在2016年发现转录因子FOXO4在细胞衰老过程中起到重要作用. FOXO4被证实能与p53发生相互作用并将其“囚禁”在衰老细胞的细胞核之中, 这些细胞之后会产生促炎性衰老相关分泌型(senescent-associated secretory phenotype, SASP)因子, 例如IL6和IL8等, 从而影响周边细胞. Baar等^[59]针对衰老过程中FOXO4与p53的相互作用设计了FOXO4的D型反序蛋白FOXO4-DRI.在之后的实验中, 他们验证了FOXO4-DRI确实会对FOXO4与p53的相互作用产生抑制.经过这种镜像D蛋白处理后的衰老细胞能将被“囚禁”的p53释放到胞质中, 而p53会进入细胞线粒体从而启动细胞色素C调控的细胞凋亡机制(图 6).发生凋亡后的细胞会被免疫系统清除, 周围组织不再受到持续的SASP分泌因子影响而回复到正常状态.他们后续的结果证明了FOXO4-DRI针对p53依赖的细胞凋亡过程有选择性和高效性, 说明这种镜像蛋白分子具备成为抗衰老药物的潜力.

  图 6

  

  图 6.  FOXO4-DRI作用示意图

  Figure 6.  Functions of D-protein FOXO4-DRI

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  4.   镜像生命再造

  生命系统存在单一手性原则, 即蛋白质和DNA/RNA分别由L型氨基酸和D型核苷酸构成.多年来人们在探究这种现象的起源.科学家提出了多个疑问:镜像生命物质如D型氨基酸和L型核酸是否能被生命体利用?由D型氨基酸构成的镜像蛋白和由L型核苷酸构成的镜像DNA/RNA可否生物合成?镜像的生命系统是否可以被构建出来?

  目前已知的生命所遵循的中心法则建立在D型DNA/RNA以及L型蛋白质基础之上. DNA在聚合酶的作用下复制形成子链DNA或转录得到RNA, RNA再通过多个过程翻译得到蛋白质.人们可以在体外重构这些过程, 例如链式聚合酶反应(polymerase chain reaction, PCR), 但是已实现的过程始终都基于天然的单一手型.我们团队完成了完全由D型氨基酸组成的镜像聚合酶, D型非洲猪瘟病毒聚合酶X (D-ASFV pol X)的体外合成与及活性测试^[2].实验表明, 这一镜像聚合酶能以L-DNA为模板进行L-DNA和L-RNA链的合成.这些催化过程都被证实是与自然形式完全互为镜像的, 即遵循了自然界现有的碱基互补配对原则且具有严格的手性特异性. D-ASFV pol X具有催化L型dNTP/NTP在L-DNA模板上聚合的能力(图 7).从中心法则的角度来看, D-ASFV pol X同时具有L-DNA/RNA聚合酶活性, 使得镜像版本的DNA复制和转录这两个中心法则的关键步骤得以实现.

  图 7

  

  图 7.  自然(左侧)及镜像(右侧)DNA聚合酶系统示意图

  Figure 7.  Natural DNA polymerase system (left) and mirror- image DNA polymerase system (right)

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  镜像DNA的成功复制为其体外获取提供了理论基础.然而D-ASFV pol X受限于其本身持续合成能力较低且不具有热稳定性, 使得该合成酶不能应用于实际的PCR实验中.因此2017年我们团队和Klussmann等同时合成了更大的镜像DNA聚合酶: D-Dpo4-5m^[34a]和D-Dpo4-3C^[62]. D-Dpo4-5m被证明可用于PCR技术, 研究者借助该镜像蛋白可以获得大肠杆菌5S核糖体RNA基因rrfB的镜像异构体.而Klussmann团队利用D-po4-3C组装了一段镜像基因Sso7d (207 bp).这两个热稳定性更好的D型聚合酶的发现进一步验证了镜像PCR实验的可行性, 为镜像PCR未来的应用奠定了基础.

  5.   总结与展望

  很长一段时间内, 科学家对蛋白质的研究专注于天然L型蛋白.随着近年化学合成手段的发展, 镜像蛋白被制备出来, 并在多个领域表现出应用潜力, 引起了人们对它们的兴趣.一方面, 生命系统单一手性的起源是个仍未得到充分解释的科学问题; 另一方面, 镜像D型蛋白质有何作用, 对生命活动会产生什么影响也值得探讨.可以预见, 随着蛋白化学合成能力的不断发展, 镜像蛋白将在结构解析、诊疗试剂发展以及重要生物问题的阐释等方面发挥巨大潜力.与此同时, 镜像核酸聚合酶的发现也将镜像生命系统的概念推向了新层次.

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  图 1  镜像手性氨基酸及蛋白示意图

  Figure 1  Mirror-image enantiomers of amino acid and protein

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  图 2  多肽固相合成法

  Figure 2  Solid phase peptide synthesis

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  图 3  L型(左侧)和D型(右侧)HIV-1蛋白酶

  Figure 3  L-(left) and D-HIV-1 protease (right)

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  图式 1  自然化学连接机理

  Scheme 1  Principle of native chemical ligation

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  图式 2  多肽酰肼连接

  Scheme 2  Chemical ligation of peptide hydrazides

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  图 4  线性四泛素形成的准外消旋体示意图

  Figure 4  Quasi-racemates of linear tetra-Ub

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  图 5  镜像噬菌体展示技术示意图

  Figure 5  Mirror-image phage display

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  图 6  FOXO4-DRI作用示意图

  Figure 6  Functions of D-protein FOXO4-DRI

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  图 7  自然(左侧)及镜像(右侧)DNA聚合酶系统示意图

  Figure 7  Natural DNA polymerase system (left) and mirror- image DNA polymerase system (right)

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  表 1  已报道的镜像蛋白药物研究

  Table 1.  Previously reported mirror-image proteins for drug development studies

  序号	作用靶标	蛋白名称	蛋白序列	潜在药用价值
  1a	尼古丁乙酰胆碱受体	RI-CDX[63]	D-(GREIRTGRAERWSEKF)	选择性地打开血脑屏障(BBB)/血脑肿瘤屏障(BBTB), 改善用于脑靶向药物递送的体外血脑屏障单层中的胞吞效率
  2a	低密度脂蛋白相关蛋白1	RI-agiopeptide2[64]	D-(YEETKFNNRKGRSGGYFFT)
  3a	膜转移受体	未命名[65]	D-(THRPPMWSPVWP)
  4a	缓激肽2型受体	RI-bradykinin[66]	D-(RFPSFGPPR)
  5a	神经纤毛蛋白-1受体	R1-CendR[67]	D-(RPPREGR)	增强肿瘤球体的渗透能力, 在胶质母细胞瘤基因治疗中具有潜在应用
  6a	整联蛋白家族α6β1和αvβ3	D-VS[68]	D-(SVAFPSYRHRSFWSV)	靶向结合α6β1和αvβ3, 可递送药物
  7a	膜联蛋白(Anxa1)	RI-IF7[69]	D-(RQWLLFI)	与受体靶向结合, 用于药物递送
  8a	膜受体Fn14	D-Fn14 CRD[70]	D-(EGAKHGLTFSGG)
  9a		D-FNB-MPD[71]	D-(CHPREVDVELYSTVFGH)
  10a	表皮生长因子受体	D-AE[72]	D-(FALGEA)
  11a	血管内皮生长因子受体2	RIV-VEGF[73]	D-(FSMEGIHQGQHPKIRMIQMTI)
  12a		D-A7R[74]	D-(ATWLPPR)
  13b	血管内皮生长因子A	RFX037.D[75]	D-(RRRRRGGSTYKLILNGKTLKGETTTEAVDVFDAFDVFFVYAASNFSDFDDWTYDDATKTFTVTEGGSDK)	治疗性血管生成拮抗剂
  14b	Src的SH3结构域	Pep-DI[52]	D-(RCLSGLRLGLVPCA)	可能用于治疗骨质疏松症
  15b	MDM2	D-PMIα[53a]	D-(TNWYANLEKLLR)	p53-MDM2相互作用抑制剂, 恶性肿瘤的靶向分子治疗
  16b		D-PMIβ[53b]	D-(TAWYANFEKLLR)
  17b		D-PMIγ[53a]	D-(DWWPLAFEALLR)
  18b		FOXO4-DRI[59]	D-(AREGRI)
  19b		D-MDM2[76]	D-(NEPLLKWLDSFTEQSSGSG)
  20b	HIV gp41	2K-PIE1[54a]	D-(KKGACESPEWRWLCAA)	HIV-1抑制剂, 抗HIV抗病毒优势候选药
  21b		PIE7[54a]	D-(KGACDYPEWQWLCAA)
  22b		PIE12-trimer[54b]	D-(HPCDYPEWQWLCELGK)
  23b		D10-p(1~12)-2K[77]	D-(KKGACXXXXXEWXWLCAA)
  24b	β样淀粉(1-42)[78]	D1或ACI-80[79]	D-(QSHYRHISPAQV)	抑制淀粉斑的形成, 并减少β样淀粉的细胞毒性, 用于阿尔茨海默病的诊断和治疗
  25b		ACI-(87~89)[80]	D-((X)QSHYRHISPAQK)
  26b		D3[55, 81]	D-(RPRTRLHTHRNR)
  27b	miRNA	D-peptide-7[82]	D-(PGRC( & )KPKRRRRATC( & )RAV)c	miRNA活性抑制剂, 反向进行miRNA生理功能的调控
  28b	诱导多能干细胞上碱性磷酸酶	D-3[83]	萘酚-D-(FFFY(OPO3H2))	抗iPSC药物, 防止潜在致肿瘤风险
  29b	蛋白酶3的膜界面结合位点	D-SAK-12[84]	D-(SAKEAFFKLLAS)	抑制剂, 治疗慢性炎症的潜在靶标
  30b	Grb2的SH2结构域	D-Grb2的SH2结构域蛋白[85]	D-Grb2 SH2 domain	抑制剂, 有望用于靶向抗癌
  31b	Ras蛋白	D-KRas(G12V)[86]	D-KRas1-166	抑制剂, 相关疾病靶标的新疗法
  32b	未知的细胞靶标	RI-SP5[87]	D-(PRPSPKMGVSVS)	与肿瘤内皮有较强的关联
  a Serial number (1~12) is a recognition molecule that can be used for targeted drug delivery. b Serial number (13~32) is a therapeutic molecule that exerts its effect by directly interacting with the target. c C( & ) represents a disulfide bond.

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