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• 随着现代社会生活节奏的加快, 癌症、病毒性疾病时刻威胁着人类的健康, 研制高效、低毒、低耐药性的药物成为当今医药领域科研人员刻不容缓的使命.核苷类药物目前用于治疗多种病毒性感染疾病如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和艾滋病病毒(HIV)等, 一些核苷也用于治疗肿瘤^{[1, 2]}.磺胺类药物是以对氨基苯磺酰胺(简称磺胺)为基本结构的衍生物的总称^{[3, 4]}, 是应用最早的一类化学合成抗菌药物.随着人们对磺胺类药物的深入研究, 发现修饰磺胺母体的磺酰胺基、苯胺基可以改善磺胺类药物的理化性质, 增强其潜在生物活性, 同时还可赋予其一些新的生物功能.其中含氮杂环尤其是嘧啶环修饰的磺胺类药物显示出卓越的药用价值.例如治疗敏感脑膜炎奈瑟菌导致的脑膜炎的磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺地索辛(Sulfadimethoxypyrimi- dine)(图 1); 以及将碱基(尿嘧啶)连上磺胺基团得到的新型衍生物A(图 1), 对流感病毒等具有显著抑制作用, 且毒副作用小^[5].

  图 1

  

  图 1.  磺胺类药物结构式

  Figure 1.  Structures of Sulfa drugs

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  传统核苷糖环修饰或改造是开发新型高效低毒核苷的有效方法之一.通过六元吗啉环取代核糖核苷的五元糖环可得到六元环吗啉核苷.进一步利用吗啉环中氨基, 对磺胺类化合物的苯磺酰基进行取代, 将两个活性药效团拼接可合成新型吗啉核苷磺胺衍生物.

  本工作以核苷为原料, 通过氧化、氨化及还原首先得到系列吗啉核苷, 再以吗啉环的氮原子和对乙酰氨基苯磺酰氯发生取代反应合成了新型吗啉核苷磺胺衍生物.测定了目标化合物的体外抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)病毒活性.进一步抗病毒活性筛选正在进行中.

  1.   结果与讨论

  1.1   吗啉核苷类似物的合成

  根据文献[6~11]报道, 设计了一条简洁合理的吗啉核苷类似物合成方法:经过高碘酸钠氧化、硼酸铵氨化、氰基硼氢化钠还原, 得到目标化合物.以尿苷为起始物, 通过薄层层析法检测对三步反应条件进行了优化.

  氧化开环反应条件优化见表 1. (1)溶剂的选择:考虑到原料及NaIO₄的溶解性, 初步选择丙酮/水、二氯甲烷/甲醇、四氢呋喃、甲醇为溶剂进行筛选, 发现保持温度(室温)不变、高碘酸钠用量(1.1 equiv.)相同时, 用甲醇作溶剂时, 反应时间短且反应完全(Entry 4), 因此选择甲醇为最佳溶剂. (2)温度的选择:实验发现温度升至50 ℃时, 反应时间明显缩短(Entry 6), 温度升高至70 ℃时, 有杂质产生(Entry 7), 因此选择50 ℃为最佳反应温度.

  表 1

  

  表 1  氧化反应条件优化

  Table 1.  Screening for oxidation reaction conditions

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  Entry	Solvent	NaIO4/equiv.	Temp./℃	Time/h	Phenomenon
  1	Acetone/H2O	1.1	25	24	体系复杂
  2	DCM/CH3OH	1.1	25	6	反应较少
  3	THF	1.1	25	4	体系复杂
  4	CH3OH	1.1	25	6	反应完全
  5	CH3OH	1.1	40	5	反应完全
  6	CH3OH	1.1	50	2	反应完全
  7	CH3OH	1.1	70	1.5	体系复杂

  氨化反应条件优化见表 2, 初步探索氨化反应时发现, 中间体3a可能不稳定导致体系复杂, 为减少副反应, 选择室温(25 ℃)条件下, 优化硼酸铵用量.当硼酸铵为1 equiv.时, 上一步的氧化产物反应不完全, 增加用量至1.5 equiv., 氧化产物反应完全, 且反应时间有所缩短(Entry 2), 继续增加至2 equiv.时, 反应速度无明显变化, 因此为避免原料浪费, 选择1.5 equiv.为硼酸铵的最佳用量.

  表 2

  

  表 2  氨化反应条件优化

  Table 2.  Screening for amination reaction conditions

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  Entry	(NH4)2B4O7/equiv.	Time/h	Phenomenon
  1	1.0	5	反应不完全
  2	1.5	3	反应完全
  3	2.0	3	反应完全

  还原反应条件优化见表 3, 室温条件下, 优化氰基硼氢化钠用量.实验发现氰基硼氢化钠用量为3.5 equiv.时, 氨化产物反应完全, 反应时间缩短(Entry 4).继续增加至4 equiv., 杂质增多.

  表 3

  

  表 3  还原反应条件优化

  Table 3.  Screening for reduction reaction conditions

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  Entry	NaCNBH3/equiv.	Time/h	Phenomenon
  1	2.0	5	反应不完全
  2	2.5	5	反应不完全
  3	3.0	5	反应不完全
  4	3.5	3	反应完全
  5	4.0	3	反应完全

  因此确定最佳反应条件:甲醇为溶剂; 投料物质的量比为核苷:NaIO₄:(NH₄)₂B₄O₇:NaCNBH₃=1:1.1:1.5:3.5;氧化开环反应温度为50 ℃, 氨化反应和还原反应的温度为室温.在此反应条件下, 反应时间短且杂质较少, 收率较高.以此最佳条件, 采用不同的起始核苷合成了一系列吗啉核苷类似物4a~4h(表 4).

  表 4

  

  表 4  吗啉核苷类似物的合成收率

  Table 4.  Yields of morpholine nucleoside analogues

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  Entry	B	Product	Yield/%
  1		4a	75
  2		4b	80
  3		4c	76
  4		4d	67
  5		4e	59
  6		4f	56
  7		4g	45
  8		4h	52
  9		4i	12

  但是由表 4可见, 以相同方法合成5-碘-尿嘧啶吗啉核苷时只有少量5-碘-尿嘧啶吗啉核苷产物(表 4, Entry 9), 而有大量副产物4a生成.推测是由于反应过程中, 氰基硼氢化钠同时会还原5位I.为避免此副反应的发生, 拟采用最后碘代的方法制备.因此, 以4a为原料, 对其碱基的5位用碘取代.合成路线如Scheme 1.

  图式 1

  

  图式 1.  5-碘-尿嘧啶吗啉核苷的合成

  Scheme 1.  Synthesis of 5-indo-uridine-morpholine nucleosides

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  为避免吗啉环氨基对反应造成干扰, 首先选择性保护氨基.以吡啶(Py)作为溶剂, 用三甲基氯硅烷(TMS- Cl)对6'-OH进行临时保护, 再加入三苯基氯甲烷保护3'-NH.在碘代^[12]时, 选择氯化碘(ICl)作为碘代试剂^[13], 碳酸钾(K₂CO₃)提供碱性环境, 最后以80%冰醋酸(体积分数)水溶液脱去保护基, 得到最终产物4i, 此路线五步反应最终的总产率为65%.

  1.2   基于吗啉核苷的磺胺衍生物的合成

  1.2.1   3'-对乙酰氨基苯磺酰基-吗啉核苷的合成

  对乙酰胺基苯磺酰氯作为磺酰化试剂, 利用吗啉环上胺基和6'位羟甲基亲核性的不同, 控制反应试剂的比例和反应温度, 使吗啉杂环氮原子与磺胺母核链接, 得到吗啉核苷类磺胺衍生物.以吡啶作为溶剂和缚酸剂, 吗啉核苷在低温下(－20 ℃)与对乙酰氨基苯磺酰氯反应过夜, 得到目标化合物5(表 5).

  表 5

  

  表 5  4'-对乙酰氨基苯磺酰基-吗啉核苷的合成收率

  Table 5.  Yields of 4'-(N-acetylsulfanilyl)morpholine nucleosides

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  Entry	B	Product	Yield/%
  1		5a	75
  2		5b	65
  3		5c	72
  4		5e	53
  5		5g	50
  6		5h	52

  1.2.2   6'-氨甲基-3'-对乙酰氨基苯磺酰基吗啉核苷的合成

  为了比较6'位取代基对此类磺胺类衍生物的生物活性的影响, 将6'-CH₂OH转化为6'-CH₂NH₂^[14~16].因此分别以合成的吗啉核苷4a和4b为原料, 室温条件下, 直接用对乙酰氨基苯磺酰氯进行磺酰化反应, 得到6'-羟甲基及吗啉环胺基双磺酰化产物6a, 6b; 利用磺酸酯基团较强的离去能力, 以叠氮基进行取代, 得到6'-叠氮甲基化合物7a, 7b; 经过还原^[17~21]得到6'-氨甲基取代的吗啉核苷磺胺衍生物8a和8b (Scheme 2).

  图式 2

  

  图式 2.  6'-氨基甲基-4'-对乙酰氨基苯磺酰基-吗啉核苷的合成

  Scheme 2.  Synthesis of 6'-aminomethyl-4'-(N-acetylsulfanilyl)- morpholine nucleosides

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  1.3   目标化合物的体外抗病毒活性初步研究

  采用噻唑蓝(MTT)法, 测定部分目标化合物的体外抗BVDV病毒活性, 以利巴韦林为阳性对照, 作用时间4 d.结果表明, 所合成的大部分吗啉核苷及其磺胺衍生物无明显抗BVDV病毒活性(EC₅₀均大于100 μmol/L), 只有2-氨基腺嘌呤吗啉核苷4g (EC₅₀=12.5 μmol/L)及其磺酰化衍生物5g (EC₅₀=50 μmol/L)显示出微弱的抗病毒活性, 并且磺酰化使母体核苷抗病毒活性降低.

  2.   结论

  以核苷为原料, 合成了一系列吗啉核苷类化合物; 并以所合成的吗啉核苷为原料, 制备了一系列吗啉核苷类磺胺衍生物, 所有化合物均经过¹H NMR和¹³C NMR和HRMS确证.所合成化合物体外抗BVDV病毒活性较弱.进一步的抗病毒活性筛选正在进行中.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  ¹H NMR和¹³C NMR谱使用瑞典Bruker公司AVANCE Ⅲ-400型超导核磁共振仪测定, TMS为内标; 高分辨质谱使用美国Waters-Micromass公司Q-TofMicro高分辨四极杆-飞行时间串联质谱仪测定.

  3.2   实验方法

  3.2.1   目标化合物4a~4h的合成

  将1 g尿嘧啶核糖核苷(1a)溶于50 mL甲醇中, 加入963 mg (1.1 equiv.)高碘酸钠, 50 ℃搅拌2 h, 薄层色谱(TLC)监测反应.反应完全后, 降至室温, 过滤白色不溶物.加入硼酸铵1 g (1.5 equiv.), 室温搅拌3 h, TLC监测反应, 反应完全后滤去不溶物.分批加入氰基硼氢化钠900 mg (3.5 equiv.)时, 室温搅拌5 h, TLC监测反应.反应完全后, 浓缩反应液, 硅胶柱层析分离[V(二氯甲烷):V(甲醇)=5:1]得到697 mg白色固体1-[6-(羟甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2, 4(1H, 3H)-二酮(4a), 产率75%. m.p. 240~242 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 11.37 (s, 1H), 7.68 (d, J=8.1 Hz, 1H), 5.61 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.52 (dd, J=10.0, 2.5 Hz, 1H), 4.72 (s, 1H), 3.71~3.54 (m, 1H), 2.83 (dd, J=12.2, 2.3 Hz, 1H), 2.76 (dd, J=12.6, 1.8 Hz, 1H), 2.58 (dd, J=12.1, 10.3 Hz, 1H), 2.37 (dd, J=12.5, 10.9 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 162.8, 150.50, 140.9, 101.4, 79.7, 78.9, 62.0, 48.1, 45.9; HRMS calcd for C₉H₁₄N₃O₄ [M+H]⁺ 228.0979, found 228.0982.

  化合物4b~4h的制备方法及投料比同化合物4a.

  1-[6-(羟甲基)吗啉-2-基]-1H-1, 2, 4-三唑-3-甲酰胺(4b):淡黄色固体粉末, 产率80%. m.p. 179~182 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.85 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 5.60 (dd, J=9.1, 3.2 Hz, 1H), 4.76 (t, J=5.7 Hz, 1H), 3.72 (dd, J=5.1, 3.2 Hz, 1H), 3.39 (dd, J=11.9, 5.9 Hz, 2H), 3.04 (dd, J=17.9, 8.1 Hz, 2H), 2.84 (d, J=11.1 Hz, 2H), 2.46~2.37 (m, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.3, 156.8, 144.8, 124.4, 83.8, 78.5, 61.9, 48.2, 46.3; HRMS calcd for C₈H₁₄N₅O₃ [M+H]⁺ 228.1091, found 228.1095.

  1-[6-(羟甲基)吗啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2, 4(1H, 3H)-二酮)(4c):黄色粉末, 产率76%. m.p. 197~199 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 7.55 (s, 1H), 5.53 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.64 (d, J=4.9 Hz, 1H), 3.40 (dd, J=11.4, 7.7 Hz, 2H), 2.78 (t, J=10.5 Hz, 2H), 2.68~2.60 (m, 1H), 2.44~2.33 (m, 1H), 1.89 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.6, 150.1, 136.5, 109.2, 79.6, 78.9, 62.1, 47.9, 46.0, 11.9; HRMS calcd for C₁₀H₁₆N₃O₄ [M+H]⁺ 242.1135, found 242.1132.

  4-氨基-1-[6-(羟甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2(1H)-酮(4d):黄色粉末, 产率67%. m.p. 210~214 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.64 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.24 (d, J=51.5 Hz, 2H), 5.83~5.74 (m, 1H), 5.62 (d, J=9.6 Hz, 1H), 4.07 (s, 1H), 3.65 (t, J=14.3 Hz, 1H), 3.46 (dd, J=10.6, 4.2 Hz, 1H), 2.85 (t, J=12.8 Hz, 2H), 2.52~2.44 (m, 1H), 2.40 (t, J=11.6 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 165.5, 154.55, 141.3, 93.8, 80.4, 78.8, 62.2, 48.6, 46.3; HRMS calcd for C₉H₁₅N₄O₃ [M+H]⁺ 227.1139, found 227.1135.

  9-[6-(羟甲基)吗啉-2-基]-3H-嘌呤-6(9H)-酮(4e):白色固体, 产率59%. m.p. 199~202 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.23 (d, J=37.6 Hz, 1H), 8.09 (d, J=8.5 Hz, 1H), 5.67 (dd, J=10.0, 2.3 Hz, 1H), 3.73 (dd, J=5.1, 3.1 Hz, 1H), 3.44~3.39 (m, 1H), 3.38~3.34 (m, 1H), 3.17~3.09 (m, 1H), 3.06~2.97 (m, 1H), 2.86 (d, J=11.4 Hz, 1H), 2.49~2.41 (m, 1H); HRMS calcd for C₁₀H₁₄N₅O₃ [M+H]⁺ 252.1091, found 252.1087.

  2-氨基-9-[6-(羟甲基)吗啉-2-基]-3H-嘌呤-6(9H)-酮(4f):白色固体, 产率56%. m.p. 236~239 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.75 (s, 1H), 6.53 (s, 2H), 5.34 (d, J=9.5 Hz, 1H), 4.62 (s, 1H), 4.03 (s, 1H), 3.52 (s, 1H), 3.10 (dd, J=21.8, 7.5 Hz, 2H), 2.97~2.89 (m, 1H), 2.87~2.78 (m, 1H), 2.72 (d, J=12.6 Hz, 1H), 2.35~2.26 (m, 1H); HRMS calcd for C₁₀H₁₅N₆O₃ [M+H]⁺ 267.1200, found 267.1204.

  [6-(2, 6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)吗啉-2-基]甲醇(4g):黄色固体, 产率45%. m.p. 234~236 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.87 (s, 1H), 6.71 (s, 2H), 5.84 (s, 2H), 5.48 (d, J=8.6 Hz, 1H), 4.69 (s, 1H), 3.64 (s, 1H), 3.36 (s, 2H), 3.07 (t, J=10.7 Hz, 1H), 2.94 (d, J=11.4 Hz, 1H), 2.84 (d, J=12.6 Hz, 1H), 2.4 (d, J=10.1 Hz, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 165.6, 161.4, 156.6, 140.3, 117.9, 84.1, 83.9, 67.4, 53.9, 51.7; HRMS calcd for C₁₀H₁₆N₇O₂ [M+H]⁺ 266.1360, found 266.1357.

  [6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)吗啉-2-基]甲醇(4h):黄色固体, 产率52%. m.p. 225~229 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.32 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.29 (s, 2H), 5.69 (dd, J=10.1, 2.2 Hz, 1H), 4.35 (dd, J=41.7, 34.7 Hz, 1H), 3.77~3.68 (m, 1H), 3.38 (t, J=5.2 Hz, 2H), 3.21~3.12 (m, 2H), 3.01 (d, J=12.2 Hz, 1H), 2.86 (d, J=11.3 Hz, 1H), 2.49~2.41 (m, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 155.9, 152.7, 148.9, 138.8, 118.4, 79.5, 78.7, 62.1, 48.6, 46.3; HRMS calcd for C₁₀H₁₅N₆O₂ [M+H]⁺ 251.1251, found 251.1247.

  3.2.2   1-[6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]嘧啶-2, 4 (1H, 3H)-二酮(4a')的合成

  取尿嘧啶吗啉核苷(4a) 200 mg, 用干燥吡啶带水三次, 溶于5 mL无水吡啶, 加入550 μL (5 equiv.)三甲基氯硅烷, 氮气保护反应1 h, 加入294 mg (1.2 equiv.)三苯基氯甲烷, 搅拌5 h后, 加入5 mL冰水猝灭, 搅拌10 min.用二氯甲烷萃取三次, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥过夜, 硅胶柱层析纯化[V(二氯甲烷):V(甲醇)=20:1], 得351 mg白色固体4a', 产率85%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.91 (s, 1H), 7.46 (s, 6H), 7.29 (t, J=7.5 Hz, 6H), 7.19 (d, J=7.9 Hz, 3H), 6.17 (d, J=7.7 Hz, 1H), 5.59 (d, J=8.1 Hz, 1H), 4.37~4.21 (m, 1H), 3.71~3.51 (m, 3H), 3.36 (d, J=11.2 Hz, 1H), 3.09 (d, J=11.8 Hz, 1H), 2.16 (s, 1H), 1.72 (s, 1H), 1.43 (dd, J=21.9, 11.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 162.8, 149.6, 139.8, 129.2, 127.9, 126.6, 102.2, 80.6, 77.6, 63.6, 52.1, 50.8, 48.8, 29.7; HRMS calcd for C₂₈H₂₈N₃O₄ [M+H]⁺ 470.2074, found 470.2071.

  3.2.3   1-[6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-5-碘嘧啶-2, 4(1H, 3H)-二酮(4i')的合成

  将200 mg化合物4a'、碳酸钾88 mg (1.5 equiv.)加入10 mL甲醇和二氯甲烷(V:V=2:1)的混合溶剂中, 冰浴搅拌, 避光加入氯化碘65 μL (3 equiv.), 搅拌15 min后, 移至40 ℃, TLC监测反应, 约1.5 h后反应完毕.冷却至室温, 加入二氯甲烷20 mL、饱和硫代硫酸钠10 mL搅拌分层, 再用20 mL二氯甲烷萃取二次, 合并有机层, 无水硫酸钠干燥过夜, 硅胶柱层析分离[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=2:1], 得到215 mg白色固体4i', 产率85%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.59 (s, 1H), 7.46 (d, J=2.8 Hz, 6H), 7.30 (t, J=7.6 Hz, 6H), 7.19 (t, J=7.1 Hz, 3H), 6.12 (dd, J=9.5, 2.2 Hz, 1H), 4.29 (dd, J=6.2, 4.3 Hz, 1H), 3.61 (s, 2H), 3.39 (d, J=11.3 Hz, 1H), 3.10 (d, J=11.9 Hz, 1H), 2.14 (s, 1H), 1.68 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 162.6, 159.9, 149.4, 144.3, 129.2, 127.9, 126.6, 81.1, 78.1, 68.3, 63.5, 52.9, 52.3, 48.8, 45.7; HRMS calcd for C₂₈H₂₇IN₃O₄ [M+H]⁺ 596.1041, found 596.1045.

  3.2.4   1-[6-(羟甲基)吗啉-2-基]-5-碘嘧啶-2, 4(1H, 3H)-二酮(4i)的合成

  取100 mg化合物4i'溶于5 mL体积分数为80%的醋酸水溶液, 50 ℃搅拌, TLC监测, 约2 h反应完毕, 浓缩, 硅胶柱层析分离[V(二氯甲烷):V(甲醇)=5:1], 得到65 mg白色粉末4i, 产率90%. m.p. 186~189 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.98 (s, 1H), 5.40 (dd, J=9.9, 2.4 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.00 (s, 1H), 3.63~3.48 (m, 1H), 3.33~3.29 (m, 2H), 2.75~2.68 (m, 1H), 2.63 (d, J=11.0 Hz, 1H), 2.57~2.48 (m, 1H), 2.38~2.30 (m, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.3, 149.7, 144.9, 80.1, 79.2, 69.6, 62.0, 48.2, 45.7; HRMS calcd for C₉H₁₃IN₃O₄ [M+H]⁺ 353.9945, found 353.9942.

  3.2.5   化合物5a~5h的合成

  取化合物4a 200 mg干燥吡啶带水三次, 溶于5 mL无水吡啶, N₂保护, －20 ℃下搅拌10 min, 加入对乙酰氨基苯磺酰氯165 mg (0.8 equiv.), TLC监测反应, 反应结束后, 加入水、乙酸乙酯萃取, 合并有机层, 无水硫酸钠干燥过夜, 硅胶柱层析分离[V(二氯甲烷):V(甲醇)=20:1], 得到279 mg淡黄色固体N-(4-((2-(2, 4-二氧代-3, 4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-6-(羟甲基)吗啉基)磺酰基)苯基)乙酰胺(5a), 产率75%. m.p. 198~201 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 11.41 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 7.77 (dd, J=59.4, 8.6 Hz, 4H), 7.63 (d, J=8.1 Hz, 1H), 5.65 (d, J=8.1 Hz, 1H), 5.58 (d, J=7.7 Hz, 1H), 4.87 (s, 1H), 3.83 (s, 1H), 3.70 (d, J=10.9 Hz, 1H), 3.59 (d, J=11.2 Hz, 1H), 3.46 (dd, J=9.2, 4.8 Hz, 2H), 2.33 (t, J=10.7 Hz, 1H), 2.20 (t, J=11.1 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.2, 162.9, 149.8, 143.8, 140.7, 128.9, 127.8, 118.8, 101.9, 78.5, 76.1, 61.2, 47.7, 46.2, 24.1; HRMS calcd for C₁₇H₂₁N₄O₇S [M+H]⁺ 425.1125, found 425.1129.

  化合物5b~5h的制备方法及投料比同化合物5a.

  1-(4-((4-乙酰氨基苯基(磺酰基)-6-(羟甲基)吗啉-2-基)-1H-1, 2, 4-三唑-3-甲酰胺(5b):白色固体, 产率65%. m.p. 173~175 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.68 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 7.91 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.89 (s, 1H), 7.73 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.63 (s, 1H), 5.94 (dd, J=9.7, 2.1 Hz, 1H), 5.01 (s, 1H), 3.90 (t, J=9.4 Hz, 2H), 3.67 (d, J=11.1 Hz, 1H), 3.51~3.44 (m, 2H), 2.74 (t, J=10.6 Hz, 1H), 2.19 (t, J=11.2 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO- d₆) δ: 176.3, 169.3, 160.1, 157.1, 145.6, 144.0, 128.9, 127.5, 118.8, 81.7, 75.8, 61.1, 48.5, 47.6, 46.5, 24.1. HRMS calcd for C₁₆H₂₁N₆O₆S [M+H]⁺ 425.1238, found 425.1233.

  N-(4-((6-(羟甲基)-2-(5-甲基-2, 4-二氧代-3, 4-二氢嘧啶-1(2H)-基)吗啉基)磺酰基)苯基)乙酰胺(5c):白色固体5c, 产率72%. m.p. 178~180 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 11.41 (s, 1H), 10.41 (s, 1H), 7.77 (dd, J=53.8, 8.7 Hz, 4H), 7.52 (s, 1H), 5.65 (dd, J=9.8, 2.4 Hz, 1H), 4.98~4.69 (m, 1H), 3.89~3.73 (m, 1H), 3.66 (d, J=10.9 Hz, 1H), 3.60 (d, J=11.2 Hz, 1H), 3.50~3.43 (m, 2H), 2.38 (t, J=10.7 Hz, 1H), 2.20 (t, J=11.1 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H), 1.72 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.1, 163.5, 149.8, 143.7, 136.1, 128.9, 128.1, 118.8, 109.5, 78.3, 76.1, 61.3, 47.6, 46.2, 24.1, 11.9; HRMS calcd for C₁₈H₂₃N₄O₇S [M+H]⁺ 439.1282, found 439.1285.

  N-(4-((6-(羟甲基)-2-(6-氧代-3H-嘌呤-9-(6H)-基)吗啉基)磺酰基)苯基)乙酰胺(5e):淡黄色固体, 产率53%. m.p. 192~196 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.54 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.09 (d, J=12.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 2H), 5.85 (d, J=7.8 Hz, 1H), 4.97 (s, 1H), 3.87 (d, J=9.5 Hz, 1H), 3.72~3.60 (m, 2H), 3.17 (s, 1H), 2.94 (d, J=10.9 Hz, 1H), 2.89 (d, J=6.3 Hz, 1H), 2.24 (t, J=11.2 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 169.3, 156.5, 147.6, 146.1, 143.8, 139.5, 138.5, 128.8, 126.1, 118.9, 117.9, 78.8, 76.09, 61.2, 47.9, 46.4, 24.1, 23.9; HRMS calcd for C₁₈H₂₁N₆O₆S [M+H]⁺ 449.1238, found 449.1231.

  N-(4-((2-(2, 6-二氨基-9H-嘌呤-9-基)-6-(羟甲基)吗啉基)磺酰基)苯基)乙酰胺(5g):黄色固体87 mg, 产率50%. m.p. 210~214 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.47 (d, J=10.7 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.85 (d, J=4.4 Hz, 2H), 7.74 (d, J=8.7 Hz, 2H), 6.79 (s, 2H), 5.92 (s, 2H), 5.66 (dd, J=10.0, 2.3 Hz, 1H), 4.90 (d, J=34.4 Hz, 1H), 3.83 (dd, J=11.1, 8.4 Hz, 1H), 3.79 (d, J=10.6 Hz, 1H), 3.71~3.61 (m, 2H), 2.85 (t, J=10.8 Hz, 1H), 2.26 (dd, J=20.3, 9.1 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H); HRMS calcd for C₁₈H₂₃N₈O₅S [M+H]⁺ 463.1507, found 463.1511.

  N-(4-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-6-(羟甲基)吗啉基)磺酰基)苯基)乙酰胺(5h):白色固体, 产率52%. m.p. 208~210 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.59 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.88 (dd, J=56.2, 8.8 Hz, 4H), 7.41 (s, 2H), 5.95 (dd, J=10.1, 2.5 Hz, 1H), 5.00 (t, J=5.7 Hz, 1H), 3.99 (s, 1H), 3.95 (d, J=12.1 Hz, 1H), 3.76 (d, J=11.2 Hz, 1H), 3.54 (dd, J=11.9, 6.0 Hz, 2H), 3.09 (t, J=10.7 Hz, 1H), 2.33 (t, J=11.1 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ: 169.2, 156.0, 152.8, 148.8, 143.9, 139.0, 128.9, 128.0, 118.8, 118.5, 78.6, 76.0, 61.2, 47.7, 46.5, 24.2.HRMS calcd for C₁₈H₂₂N₇O₅S [M+H]⁺ 448.1398, found 448.1393.

  3.2.6   1-(4-((4-乙酰氨基苯基(磺酰基)-6-((4-乙酰氨基苯基)磺酰氧甲基)吗啉-2-基)-1H-1, 2, 4-三唑-3-甲酰胺(6b)的合成

  取100 mg化合物4b干燥吡啶带水三次, 溶于5 mL无水吡啶, 氮气保护, 室温搅拌10 min, 加入411 mg (4 equiv.)对乙酰氨基苯磺酰氯, 少量4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化, 室温反应, TLC监测, 约5 h反应完毕, 加水, 二氯甲烷萃取, 合并有机层, 无水硫酸钠干燥过夜, 浓缩, 得到粗产物6b约199 mg, 直接用于下一步反应.

  3.2.7   1-(4-((4-乙酰氨基苯基(磺酰基)-6-(叠氮甲基)吗啉-2-基)-1H-1, 2, 4-三唑-3-甲酰胺(7b)的合成

  取如上所得粗产物6b、叠氮化钠104 mg (5 equiv.)溶于10 mL无水N, N-二甲基甲酰胺, 100 ℃搅拌, TLC监测, 2 h反应结束.减压浓缩, 硅胶柱层析分离[V(二氯甲烷):V(甲醇)=20:1], 得113 mg淡黄色固体7b(以从4a计算两步), 产率57%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d₆) δ: 10.45 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 7.88 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.86~7.59 (m, 4H), 5.99 (d, J=8.5 Hz, 1H), 4.11 (s, 1H), 3.93 (d, J=10.5 Hz, 1H), 3.68 (d, J=10.7 Hz, 1H), 3.55 (d, J=10.7 Hz, 1H), 3.44 (dd, J=12.9, 5.9 Hz, 1H), 2.78 (d, J=10.8 Hz, 1H), 2.29~2.20 (m, 1H), 2.11 (s, 3H); HRMS calcd for C₁₆H₂₀N₉O₅S [M+H]⁺ 450.1303, found 450.1306.

  3.2.8   1-(4-((4-乙酰氨基苯基(磺酰基)-6-(氨甲基)吗啉-2-基)-1H-1, 2, 4-三唑-3-甲酰胺(8b)的合成

  取100 mg化合物7b, 硼氢化钠16 mg (2 equiv.)溶于无水N, N-二甲基甲酰胺, 室温搅拌, TLC监测反应, 反应完毕后浓缩反应液, 硅胶柱层析分离[V(二氯甲烷):V(甲醇)=10:1], 得到70 mg白色固体8b, 产率75%. m.p. 205~207 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.43 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 7.89 (s, 2H), 7.74 (dd, J=52.8, 44.1 Hz, 4H), 6.06~5.92 (m, 1H), 4.17~4.06 (m, 1H), 3.93 (d, J=10.4 Hz, 1H), 3.68 (d, J=11.0 Hz, 1H), 3.55 (dd, J=13.3, 3.4 Hz, 1H), 3.44 (dd, J=13.3, 6.2 Hz, 1H), 2.79 (d, J=10.8 Hz, 1H), 2.25 (t, J=11.1 Hz, 1H), 2.11 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.2, 160.1, 157.2, 145.6, 144.0, 128.9, 127.6, 118.9, 81.7, 74.1, 50.9, 47.3, 24.1; HRMS calcd for C₁₆H₂₂N₇O₅S [M+H]⁺ 424.1398, found 424.1392.

  3.2.9   N-(4-((2-(2, 4-二氧代-3, 4-二氢嘧啶-1(2H)-基)- 6-(氨甲基)吗啉基)磺酰基)苯基)乙酰胺(8a)的合成

  制备方法与从4b制备8b相同, 得白色固体, 产率47%. m.p. 196~198 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 10.63 (s, 1H), 7.77 (dd, J=62.2, 8.8 Hz, 4H), 7.58~7.51 (m, 1H), 5.64 (dd, J=9.8, 2.4 Hz, 1H), 5.48 (d, J=8.0 Hz, 1H), 3.82 (s, 1H), 3.64 (d, J=12.2 Hz, 2H), 2.65~2.55 (m, 2H), 2.31~2.22 (m, 1H), 2.16 (d, J=11.3 Hz, 1H), 2.11 (d, J=5.1 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.2, 165.0, 151.2, 143.8, 140.0, 128.8, 127.9, 118.8, 102.0, 78.6, 77.2, 48.6, 47.9, 43.5, 24.1; HRMS calcd for C₁₇H₂₂N₅O₆S [M+H]⁺ 424.1285, found 424.1289.

  3.2.10   体外抗病毒活性实验

  将牛肾(MDBK)细胞以每孔2×10⁴的密度接种在含有1640培养基的96孔板中, 在温度37 ℃, CO₂浓度5%的环境中培养24 h后, 弃去上清液, 并向每孔中加入100 μL含2%胎牛血清(FBS)的经维持培养基稀释的BVDV病毒悬液, 感染2 h后取出接种物, 加入磷酸缓冲盐溶液洗涤两次, 并立即加入200 μL已经稀释为12.5、25、50和100 μmol/L的目标化合物, 阳性对照为利巴韦林, 37 ℃培养四天.然后每孔加入20 μL MTT溶液继续培养4 h.小心倒掉上清液, 每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解, 酶标仪测定490 nm处吸光度, 计算药物的EC₅₀值.

  辅助材料(Supporting Information) 化合物4a~8b的¹H NMR和¹³C NMR谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图 1  磺胺类药物结构式

  Figure 1  Structures of Sulfa drugs

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  图式 1  5-碘-尿嘧啶吗啉核苷的合成

  Scheme 1  Synthesis of 5-indo-uridine-morpholine nucleosides

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  图式 2  6'-氨基甲基-4'-对乙酰氨基苯磺酰基-吗啉核苷的合成

  Scheme 2  Synthesis of 6'-aminomethyl-4'-(N-acetylsulfanilyl)- morpholine nucleosides

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  表 1  氧化反应条件优化

  Table 1.  Screening for oxidation reaction conditions

  Entry	Solvent	NaIO4/equiv.	Temp./℃	Time/h	Phenomenon
  1	Acetone/H2O	1.1	25	24	体系复杂
  2	DCM/CH3OH	1.1	25	6	反应较少
  3	THF	1.1	25	4	体系复杂
  4	CH3OH	1.1	25	6	反应完全
  5	CH3OH	1.1	40	5	反应完全
  6	CH3OH	1.1	50	2	反应完全
  7	CH3OH	1.1	70	1.5	体系复杂

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  表 2  氨化反应条件优化

  Table 2.  Screening for amination reaction conditions

  Entry	(NH4)2B4O7/equiv.	Time/h	Phenomenon
  1	1.0	5	反应不完全
  2	1.5	3	反应完全
  3	2.0	3	反应完全

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  表 3  还原反应条件优化

  Table 3.  Screening for reduction reaction conditions

  Entry	NaCNBH3/equiv.	Time/h	Phenomenon
  1	2.0	5	反应不完全
  2	2.5	5	反应不完全
  3	3.0	5	反应不完全
  4	3.5	3	反应完全
  5	4.0	3	反应完全

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  表 4  吗啉核苷类似物的合成收率

  Table 4.  Yields of morpholine nucleoside analogues

  Entry	B	Product	Yield/%
  1		4a	75
  2		4b	80
  3		4c	76
  4		4d	67
  5		4e	59
  6		4f	56
  7		4g	45
  8		4h	52
  9		4i	12

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  表 5  4'-对乙酰氨基苯磺酰基-吗啉核苷的合成收率

  Table 5.  Yields of 4'-(N-acetylsulfanilyl)morpholine nucleosides

  Entry	B	Product	Yield/%
  1		5a	75
  2		5b	65
  3		5c	72
  4		5e	53
  5		5g	50
  6		5h	52

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