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• 目前, 该天然产物已在美国作为营养补充剂上市, 同时进行治疗糖尿病的临床试验, 科罗索酸作为纯天然植物活性成分, 既可以作为降血糖保健品, 也可作为降血糖药物对抗糖尿病和肥胖症进行治疗.所以科罗索酸具有很好的开发利用前景, 而对科罗索酸进行结构改造或者制备其衍生物也成了现在的一个研究热点.因为科罗索酸的结构是刚性环, 通过化学方法对其进行结构改造位点主要集中在3位羟基、28位羧基等部位.近年来, 被誉为“绿色化学”的生物催化因为其反应条件温和、副产物少、环境友好等优点越来越多地用于结构修饰和改造结构复杂的天然产物^[10-12]. Feng等^[11]用放线菌Streptomyces asparaginoviolaceus和丝状真菌Cochliobolus lunatus转化科罗索酸, 得到7、21、30位等羟基化产物, 且均为新化合物. Li等^[12]通过丝状真菌Fusarium equiseti CGMCC 3.3658和Gliocladium catenulatum CGMCC 3.3655得到4种结构新颖的科罗索酸衍生物, 有15位的羟基化产物, 有3位羟基丢失的产物, 有3位β构型转化成α构型产物以及A环扩环产物.微生物催化很大程度上增加了科罗索酸的结构多样性.本文通过植物内生真菌Umbelopsis isabellina与科罗索酸共培养, 得到一个结构新颖的转化产物(Eq. 1), 经过HR-ESIMS, 1D和2D NMR等数据鉴定新化合物的结构为2α, 3β, 7β-trihydroxy-urs-11-en-28, 13-lactone.

  科罗索酸(corosolic acid, CA)又名2α-羟基熊果酸, 是存在于大叶紫薇、枇杷、对萼猕猴桃中的一种三萜化合物.它以游离形式或皂甙形式存在, 且常与其同分异构体山楂酸共同存在^{[1, 2]}.由于与其同分异构体的结构和化学性质相似, 所以给分离、纯化科罗索酸及其衍生物带来很大困难.研究发现, 科罗索酸具有抗炎、降血糖、降血脂和抗癌等作用^[3~5], 科罗索酸的抗肿瘤作用已经有很多报道, 比如脑瘤、乳腺癌、白血病、肝癌、肺癌等^{[6, 7]}.但是, 人们最为关注的是科罗索酸的降血糖功能.体内、外实验结果表明, 科罗索酸通过增加葡萄糖的转运, 促进细胞对葡萄糖的吸收和利用, 从而实现降血糖功效.科罗索酸对葡萄糖转运的增加作用类似于胰岛素, 因此, 科罗索酸也被称为“植物胰岛素”(phyto-insulin, botanical insulin)^{[8, 9]}.

  1    结果与讨论

  1.1    转化反应的筛选

  在筛选的10株微生物菌株中, 10株细菌均未发现有转化活性, 而10株真菌中, 有2株真菌经TLC方法[展开剂, V(石油醚):V(乙酸乙酯)=1:1, 硫酸乙醇显色]检测具有转化科罗索酸的活性.选择其中一种02-L-37Umbelopsis isabellina进行复筛, TLC结果也显示其对科罗索酸有转化作用, 故对其进行放大培养并对转化产物进行结构鉴定.

  1.2    转化产物的结构鉴定

  化合物1为白色粉末, 硫酸乙醇105℃显色为紫红色.高分辨质谱数据(HR-ESI-MS)测量值[M+H]⁺: 487.3403, 计算值为487.3423, 可以推断出转化产物的分子式为C₃₀H₄₆O₅, 提示有8个不饱和度.与底物科罗索酸(C₃₀H₄₈O₄, 472)相比, 转化产物多了一个氧原子, 少了2个氢原子.通过¹H NMR发现高场区有7个甲基信号, 底物中12位的烯氢质子信号δ 5.49 (t-like)消失, 出现两个新的烯氢质子信号δ 6.02 (br d, J=10.4 Hz, 1H)和δ 5.71 (dd, J=1.2, 9.6 Hz, 1H), 以及3个连氧碳的质子信号δ 2.88 (d, J=9.6 Hz, 1H), 3.83 (dd, J=4.8, 9.6 Hz, 1H), 3.63 (td, J=4.8, 9.6 Hz), 提示我们转化产物中有一个位点引入了一个新的羟基.在¹³C NMR谱中, 相应的出现一对烯碳信号δ 133.6和130.6, 与底物CA中12位双键碳的化学位移也不一样(δ 126.0, 139.7), 有3个连氧碳信号δ 84.1, 73.6, 69.1, 与¹H NMR一致, 提示我们有一个新的羟基化位点, 而且双键发生变化. ¹H NMR和¹³C NMR显示转化产物与底物比较, 引入了一个新的羟基, 同时12位双键转移, 因为¹³C NMR出现一个季碳信号δ 91.9, 我们推测双键从12-13位移至11-12位, 同时13位发生羟基化.通过HMQC谱可知, δ_H 2.88 (d, J=9.6 Hz)与δ_C 84.1直接相关, δ_H 3.63 (td, J=4.8, 9.6 Hz)与δ_C 69.3直接相关, 分别与底物中C (3)和C (2)的质子信号和碳信号化学位移一致. HMBC相关谱中δ_C 48.3和38.4分别为C (14)和C (10)的化学位移. δ_H6.02与δ_C 91.9, 48.3, 38.4有远程相关, 推测δ_H 6.02为12位质子信号, 与我们预期双键移至11-12位, C-13相应的羟基化的结构相符.引入羟基我们通过26位甲基δ_H 3.83与δ_C 73.6的远程相关推断羟基位于7位碳原子上, 7位上的羟基定为β构型是由H-7的峰形及偶合常数确定. H-7如果为α构型, 其偶合常数为一大一小偶合, 与实测值4.8、9.6 Hz一致, H-7如果为β构型, 那么H-7通常表现为宽单峰或偶合常数相近的dd峰.此外7位羟基的β构型与很多文献一致^{[11, 13~15]}.双键移位至C (11)-C (12)位后13位羟基可以有两种方式:一种是13位羟基游离存在, 另一种是13位羟基与28位羧基脱水形成内酯.如果13位羟基游离, 分子量应该为488, 如果13位羟基形成内酯则分子量应该为486, 而我们实测的质谱487.3403 [M+H]⁺, 符合后一种情况, 即13位羟基与28位羧基脱水形成内酯.此外, 相同菌株催化相似五环三萜熊果酸也发生类似的反应^[13].通过转化产物的NMR、HR-ESI-MS等数据以及化合物3β, 7β-dihydroxy-urs-11-en-28, 13-lactone图谱, 最终确定转化产物为2α, 3β, 7β-三羟基-乌苏-11-烯-28, 13-内酯(图 2), 是一个新的化合物.

  2    结论

  内生真菌02-L-37Umbelopsis isabellina对CA有转化作用, 2α, 3β, 7β-三羟基-乌苏-11-烯-28, 13-内酯为一个新化合物.通过微生物转化可以增加科罗索酸结构多样性.

  3    实验部分

  3.1    仪器与试剂

  高分辨质谱用Bruker型质谱仪测定; 核磁共振用Agilent DD2400-MR型核磁共振仪测定, TMS为内标; 薄层色谱硅胶GF254和柱色谱硅胶(300~400目)均为青岛海洋化工厂生产; BHC-1300ⅡA/B3型超净工作台为苏州净化有限公司生产; YXQ-LS-50SⅡ立压式力蒸汽灭菌器由上海博讯实业有限公司医疗设备厂; HPLC柱用江苏汉邦Dubhe TM C18, 10 μm, 20 mm×250 mm, YMC C18, 5μm, 10 mm×250 mm.

  3.2    实验方法

  3.2.1    科罗索酸(CA)的微生物转化筛选

  在无菌条件下, 选择10株的细菌和10株真菌接于100 mL的三角瓶内装40 mL PDA液体培养基中, 放于TS-2102C型恒温震荡培养箱进行培养, 2 d后加入底物CA, 共培养5 d后乙酸乙酯等体积萃取2次, 同等条件下以培养基和不加底物的菌株作为对照, TLC检测转化反应.

  3.2.1    科罗索酸(CA)的放大培养及转化产物分离

  辅助材料(Supporting Information) 新化合物2的HR-ESI-MS, ¹H NMR, ¹³C NMR, HSQC和HMBC谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  阳性菌株的放大培养同样采用两步发酵法. 12 L液体培养基中共加入600 mg底物.发酵液乙酸乙酯提取减压浓缩后通过硅胶柱色谱(石油醚:乙酸乙酯), TLC点板合并相同组分, 组分Fr.312经乙酸乙酯重结晶得13 mg 2α, 3β, 7β-三羟基-11-烯-13, 28-内酯(2), 白色粉末. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) 6.02 (br d, J=10.4 Hz, H-12), 5.71 (dd, J=1.2, 9.6 Hz, H-11), 2.88 (d, J=9.6 Hz, H-3), 3.83 (dd, J=4.8, 9.6 Hz, H-7), 3.63 (td, J=4.8, 9.6 Hz, H-2), 0.97 (s, H-23), 0.92 (d, J=9.6 Hz, H-30), 0.92 (s, H-25), 098 (s, H-26), 0.76 (s, H-24), 1.23 (s, H-27), 0.99 (d, H-29); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ: 182.6 (C6), 133.6 (C12), 130.6 (C11), 91.9 (C13), 84.1 (C3), 73.6 (C7), 69.3 (C2), 61.9 (C18), 53.8 (C9), 53.6 (C5), 48.3 (C-14), 47.4 (C17), 46.5 (C8), 44.1 (C20), 41.5 (C4), 40.3 (C19), 39.2 (C1), 38.4 (C10), 32.5 (C22), 31.7 (C21), 30.4 (C6), 29.2 (C15), 28.8 (C23), 23.9 (C16), 19.4 (C30), 19.2 (C25), 18.3 (C26), 16.9 (C24), 16.8 (C27), 14.9 (C29); HR-ESI-MS cacld for C₃₀H₄₇O₅ [M+H]⁺ 487.3423, found 487.3403.

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