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• 周围神经损伤可由物理创伤、事故和遗传学引起，是全球普遍的临床问题，不仅严重影响患者的生活质量，还会带来巨大的社会负担^[1-2]。自体移植是治疗受损神经结构和功能的黄金标准，但仍然存在着许多局限，例如供体神经来源有限，造成二次创伤、组织粘连、反复手术等。近年来，神经组织工程策略受到了广泛的关注，功能性的聚合物材料结合仿生制备工艺可以为受损组织或者细胞提供有利生存的界面，加速组织愈合，是实现神经组织修复的重要途径之一^[2-6]。

  构建理想的神经组织支架从结构上来讲，首先应仿生周围神经系统的微结构，提供细胞外组织环境，以及必要的物理诱导^[7-8]。纺丝纤维具有相互连接的多孔微观结构，有利于支持受损神经组织中细胞的分布和长入，提供便利的氧气和营养物质的扩散条件。模拟细胞外基质，为神经细胞提供接触诱导，促进细胞取向及胞间信号传导，从而有效地促进轴突生长^[9-15]。电活性生物材料在神经组织工程和再生应用领域已引起广泛的关注^{[12, 16-20]}。研究表明，共轭导电高分子材料可以促进神经细胞生长、生存以及神经元分化，结合电刺激可显著促进轴突的生长，防止纤维瘢痕组织向内生长^{[16, 21-23]}。Yu等^[24]报道了基于聚(3, 4-乙烯二氧噻吩) (PEDOT)仿生合成集生物化学和电化学刺激于一体的导电共轭聚合物，结合电刺激条件，促进了大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的分化，神经长度增长124%，高于通常的20%~90%，雪旺细胞神经营养因子分泌提高165%。Wallace等^[25]制备的导电聚吡咯(PPY)/外消旋聚乳酸(PDLLA)的复合物神经导管用于修复兔坐骨神经10 mm缺损，其功能恢复与自体移植相似。常用的共轭聚合物的制备主要是通过电化学聚合获得，反应条件苛刻，难以调控相对分子质量、相对分子质量分布等，很难重复大规模合成，这是限制该类材料应用于临床的重要因素之一。我们通过催化剂转移聚合(CTP)方法制备的聚(3-己基噻吩)(P3HT)，具有相对分子质量可控、相对分子质量分布较窄等优势^[26]。为了改善导电聚合物机械性能差、加工性能差、疏水性和不可降解性等缺点，常将共轭高分子与更柔韧的、天然或合成的、生物可降解聚合物材料(如胶原蛋白、聚己内酯、聚乳酸等)相结合，制备具有电活性及力学性能的混合或复合材料用于组织工程^[27-28]。其中，聚(乙交酯-丙交酯)(PLGA)作为一种经食品及药物管理局批准的人类治疗材料，具有可控的降解速率，降解产物可以被人体吸收和代谢等优点，能够最小化神经再生中潜在的物理干扰^[28-30]。

  此外，神经营养因子是神经细胞分泌的蛋白质，具有调节神经细胞增殖、迁移、分化以及促进轴突生长等多种功能，在神经修复中起着重要的作用。例如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)等已经广泛应用在神经组织损伤修复中^[31-32]。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种广谱的生长因子，能够调节大脑发育。研究证实，IGF-1可以调节神经生长，如促进神经元分化、生长和成熟，增加树突的生长和脊柱的形成，促进轴突生长、突触形成和髓鞘化，增强间充质干细胞的多能性和自我更新能力^[33-34]。由于生长因子在体外和体内使用时存在不稳定性和扩散性等局限，将生长因子固定在基质材料上，为神经修复提供持续有效的作用，已成为一种研究趋势。受贻贝粘合原理的启发，我们团队利用基因工程技术将酪氨酸重复序列基因(Tyrosine-Lysine-Tyrosine-Lysine-Tyrosine, YKYKY)整合到IGF -1基因末端，通过对重组蛋白纯化和表达合成YKYKY-IGF-1，再利用酪氨酸羟化反应转化为DOPA-IGF-1，当pH值调节到8.5时，邻苯二酚基团的氧化反应导致化学交联，实现DOPA-IGF-1在材料表面的黏附^[31-32]。研究已经证明其在材料表面具有很好的结合能力，能够促进雪旺细胞增殖、粘附及神经营养因子的分泌^[35-36]。

  本研究中，将可控合成的电活性生物材料P3HT和生物降解大分子PLGA共混，利用静电纺丝制备不同P3HT质量分数(0、3%、5%、10%)的PLGA/P3HT复合纤维。该纤维具有细胞外基质仿生结构，能够为神经细胞生长提供接触诱导。在温和条件下实现生长因子的担载，将不同质量浓度(10、50、100 ng/mL)的DOPA-IGF-1绑定在纤维表面，达到IGF-1持续作用。结合电刺激，实现电活性和生物活性连用的协同效应。通过扫描电子显微镜、接触角测试表征材料纤维直径以及表面亲水性能，利用细胞增殖、细胞活/死染色实验选出生物相容性较好的PLGA/P3HT纤维支架。通过细胞黏附、增殖证明了结合DOPA-IGF-1质量浓度为10 ng/mL的PLGA/P3HT纤维具有更好的生物活性。这种具有电活性和生物活性的DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT纤维在神经组织修复领域具有潜在的应用价值。

  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  聚(3-己基噻吩)(P3HT, M_W=10000)、聚(乙交酯-丙交酯)(PLGA, M_W=100000)、DOPA-IGF-1根据文献[26, 36-37]报道的方法制备；培养基(RPMI-1640)、胎牛血清(FBS)、马血清购自美国Gibco公司；青霉素和链霉素购自中国上海华北制药有限公司；荧光素异硫氰酸酯(FITC)、4, 6-二氨基吲哚(DAPI)、钙黄绿素(Calcein AM)和碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司；Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)购自同仁化学分子技术有限公司；Rabbit Anti-IGF 1抗体(bs-4588R)购自北京博奥森生物技术有限公司，Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗购自碧云天生物技术有限公司。

  Krüss DSA 10型接触角测量仪(德国KREUSS公司)；XL 30ESEM-FEG型扫描电子显微镜(SEM，荷兰Philips公司)；TE2000U型荧光显微镜(日本Nikon公司)；EDX-720型能量色散X射线光谱仪(EDX，德国SPECS公司)；Keithley 2400型四探针法装置(美国Keithley公司)。

  1.2   PLGA/P3HT纤维支架的制备

  将PLGA和P3HT混溶于三氯甲烷中，高速搅拌1 h，超声30 min，使其充分溶解，制备质量分数为20%的共混溶液，其中P3HT的质量分数依次为0、3%、5%、10%，如表 1所示。采用静电纺丝装置，用一次性注射器装混合溶液，20 G钢针作为喷射孔，包被锡纸的金属平台作为接收器，将硅化的玻片固定在接收器表面，固定针头到接收器距离15 cm，电压18 kV，制备PLGA/P3HT纺丝纤维。

  表 1

  

  表 1  不同比例的PLGA/P3HT静电纺丝纤维

  Table 1.  Different weight ratio of PLGA/P3HT electrospinning fibers

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  Sample	m(PLGA)/mg	m(P3HT)/mg	V(CHCl3)/mL	w(P3HT)/%
  PLGA	400	0	2	0
  PLGA/P3HT3	400	12	2	3
  PLGA/P3HT5	400	20	2	5
  PLGA/P3HT10	400	40	2	10

  1.3   PLGA/P3HT纤维形貌

  PLGA/P3HT纤维表面喷金后在SEM下观察其表面形貌，在10 kV的加速电压下收集图像。使用图像分析软件Image J测量纤维直径并统计纤维直径分布，每个样品统计至少100根纤维直径进行数据分析, 以减小实验误差。利用EDX测试不同P3HT质量分数的PLGA/P3HT纤维表面元素。

  1.4   PLGA/P3HT电导率测试

  用四探针法测量材料的电导率，操作如下：在室温下将材料放置于四探针装置上，通过提供电流可以获得相应的电压。材料的电导率(σ)通过式(1)计算：

  $ \sigma=\frac{1}{4.534 d} \times \frac{I}{V} $

  (1)

  式中，σ是电导率(S/cm)，d是薄膜厚度(cm)，I是通过外探针的电流(A)，V是内探针之间的电压(V)。对每个样品重复实验测定8次以评估测量准确度。

  1.5   亲水性测定

  PLGA/P3HT纤维表面的亲水性利用接触角测量仪进行测试，每个样品至少3个平行样，并对每个样品进行至少5次的测试，以确保实验数据的准确性。

  1.6   PC12细胞的培养及电刺激条件

  PC12细胞培养使用RPMI-1640培养基含灭活的马血清(10%)、胎牛血清(5%)、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)。将材料放置于标准的24孔培养板中，加入75%乙醇(1 mL/每孔)对材料进行杀菌，然后弃掉75%乙醇，将孔板暴露于强紫外光下1 h再次灭菌。将灭菌完的样品在超净台中用无菌PBS洗涤3次。PC12细胞的接种密度为2×10⁴个/孔，用于评估细胞增殖、活性和形态。研究报道，细胞培养在导电基质材料上12 h后，每天施加1 h频率为100 Hz、电压为500 mV、占空比为50%的脉冲电刺激，能提高细胞活性和增殖能力^[38]，因此本文中选择此条件作为电刺激条件。

  1.7   有无电刺激条件下PLGA/P3HT纤维对PC12细胞增殖的影响

  细胞培养1、4、7 d后，使用CCK-8试剂盒进行细胞定量检测。具体实验过程为：更换新鲜培养基(1 mL/孔)，加入CCK-8(30 μL/孔)，37 ℃孵化2 h，用全波长多功能酶标仪检测450 nm处的吸光度。分析比较有无电刺激条件下，不同P3HT质量分数的纤维对细胞增殖影响。

  1.8   有无电刺激条件下PLGA/P3HT纤维对PC12细胞活性的影响

  细胞在材料上分别培养1、4、7 d，用钙黄绿素(Calcein AM, 活细胞)和碘化丙啶(PI, 死细胞)对细胞进行染色，观察细胞活性。具体实验过程如下：避光条件下，取Calcein AM(5 μL)和PI(8 μL)加入PBS(2.5 mL)中，制备混合染液。将培养基弃掉，PBS洗3次，每孔加入200 μL混合染液，37 ℃，抚育10 min。弃掉染液，PBS洗3次，在荧光显微镜下观察细胞状态。分析比较有无电刺激条件下，不同P3HT质量分数的纤维上细胞活性。选择出P3HT比例合适的纤维进行下一步绑定生长因子实验。

  1.9   有无电刺激条件下细胞在PLGA/P3HT纤维上的形态

  将PC12细胞(2×10⁴个/孔)接种到纤维上，分别在有无电刺激条件下培养7 d。弃掉培养基，用PBS清洗3次。加入4%多聚甲醛溶液(200 μL/孔)，室温下固定15 min后, 弃掉多聚甲醛。依次用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%梯度乙醇脱水，每个梯度脱水20 min。待乙醇完全挥发后，表面喷金，在SEM下收集图像。

  1.10   DOPA-IGF-1担载

  准备不同质量浓度的YKYKY-IGF-1溶液(0、10、50、100 ng/mL PBS)，加入1/3体积的VC溶液(5 g/L)，定量酪氨酸羟化酶，将体系pH值调节到7.2，室温静止2 h。将所得DOPA-IGF-1用无菌滤头过滤，加到灭菌的纤维材料上(24孔板，1 mL/孔)，再将pH值调至8.5，静止过夜。制备担载DOPA-IGF-1的PLGA/P3HT纤维(DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT)。将DOPA-IGF-1溶液弃掉，用无菌的PBS清洗材料3次。DOPA-IGF-1在材料表面的黏附性通过免疫荧光染色检测。操作如下：将制备好的材料用PBS轻轻冲洗2次，在室温下用4%多聚甲醛固定15 min。PBS轻轻冲洗2次，并用0.1%Triton X-100抚育15 min。在含1%牛血清蛋白(SBA)的PBST(含0.2%Tween-20的PBS)中封闭30 min。用PBS洗涤后加入Rabbit Anti-IGF 1抗体，4 ℃过夜。PBS洗涤2次后，加入Alexa Fluor 488二抗，并在室温下温育1 h，使用荧光显微镜观察。

  1.11   DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT对细胞黏附的影响

  将制备好的DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT纤维用无菌的PBS清洗材料3次，将PC12细胞(2×10⁴个/孔)接种到DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT材料上，加入培养基(1 mL/每孔)。电刺激条件下，细胞在材料上分别培养6和24 h后，用荧光素异硫氰酸酯(FITC)对细胞骨架进行染色，观察PC12细胞的粘附状态。方法如下：弃掉培养基，用PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液(200 μL/孔)，室温下固定15 min后, 弃掉多聚甲醛，加入FITC染液(500 μL/孔)，抚育10 min，弃掉染液，PBS清洗3次，在荧光显微镜下观察。用ImageJ对荧光图像进行分析统计。在统计细胞黏附面积时，每个样品至少3个平行样，每个平行样品至少随机选取5个不同区域。

  1.12   DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT对细胞增殖的影响

  将制备好的DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT纤维用无菌的PBS清洗材料3次，将PC12细胞(2×10⁴个/孔)接种到DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT材料上，加入培养基(1 mL/每孔)。电刺激条件下，细胞在材料上培养1、4、7 d后，使用CCK-8试剂盒检测细胞数量，操作如上所述。使用4，6-二氨基吲哚(DAPI)对细胞核染色，进一步分析DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT结合电刺激对PC12细胞增殖的影响。

  1.13   统计分析

  所有定量数据均由Origin Pro 8.0(Origin Lab Corporation，USA)分析，并以平均值±标准偏差表示。组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，当P＜0.05时被认为在统计学上有显著性差异，图中*表示P＜0.05。

  2.   结果与讨论

  2.1   PLGA/P3HT纤维形貌及直径分布

  通过静电纺丝制备的纤维具有细胞外基质仿生结构，能够为神经细胞生长提供接触诱导，并且研究证明纳米级尺寸的纤维是调节细胞行为的重要因素^[9-10]。将具有电活性的P3HT与降解生物大分子共混，通过静电纺丝制备不同P3HT质量分数的PLGA/P3HT纤维。通过SEM图像(图 1A)分析纤维形貌及直径分布(图 1B)。从图 1A看出，PLGA纤维呈现更均匀的直径分布，随着P3HT质量分数的增加出现更多的细纤维。通过统计纤维直径分布(图 1B)发现，PLGA纤维直径主要分布在2~3 μm之间。当P3HT质量分数为3%时，纤维直径主要分布在1~2 μm之间，当P3HT质量分数为5%和10%时，纤维直径主要在小于1 μm范围内分布。用EDX(图 1C)对纤维表面元素进行了分析，结果如表 2所示，PLGA/P3HT3、PLGA/P3HT5、PLGA/P3HT10的纤维表面的碳(C)和氧(O)元素比例基本不变。但是随着P3HT质量分数增加，硫(S)元素的原子质量分数增加。增加比例与计算比例基本吻合，说明成功的制备了PLGA/P3HT复合纤维，并且PLGA和P3HT在纤维中混合存在。

  图 1

  

  图 1.  PLGA、PLGA/P3HT3、PLGA/P3HT5和PLGA/P3HT10的SEM图像、纤维直径分布和EDX

  Figure 1.  SEM images(A), fiber diameter distribution(B) and EDX(C) of PLGA, PLGA/P3HT3, PLGA/P3HT5 and PLGA/P3HT10 fibers

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  表 2

  

  表 2  由图 1C得到元素的原子质量分数

  Table 2.  Atomic mass fraction of elements calculated from Fig. 1C

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  Sample	w(C)/%	w(O)/%	w(S)/%
  PLGA	54.93	40.15
  PLGA/P3HT3	55.02	31.31	0.65
  PLGA/P3HT5	56.04	32.14	0.80
  PLGA/P3HT10	56.40	32.37	1.56

  2.2   PLGA/P3HT电导率

  PLGA/P3HT3、PLGA/P3HT5和PLGA/P3HT10的电导率分别为(1.7±0.1)×10^-7、(3.1±0.2)×10^-7和(6.6±0.4)×10^-7 S/cm，P＜0.05。这些纳米纤维的电导率随着P3HT含量的增加而增加，因为较高的P3HT含量将更容易在共混体系内形成导电网络以促进导电性。基于之前的工作以及关于组织工程应用的导电生物材料的一些研究，虽然样品显示出相对低的电导率值，但足以在体内或细胞通讯中传导电信号。

  2.3   表面亲疏水性

  材料表面的亲疏水性由表面能决定，会影响血清蛋白在基质材料上的黏附，进而调控细胞行为。接触角是一种测量材料的亲疏水性或表面润湿性的方法，接触角值越低，材料的亲水性越高。对纺丝材料表面的亲水接触角进行了检测(图 2)，研究纺丝纤维及担载DOPA-IGF-1后引起的亲疏水性变化。PLGA纤维的接触角为(113.7±1.8)°、PLGA/P3HT3的接触角为(118.5±2.7)°。与纯PLGA纤维相比，由于P3HT的疏水性导致PLGA/P3HT纤维接触角呈现略微的增加。但是不同P3HT质量分数的PLGA/P3HT纤维接触角大小几乎不发生变化。当纤维表面担载DOPA-IGF-1后，接触角明显下降，从(117.1±2.1)°下降至103°(以PLGA/P3HT5纤维作为基底材料担载不同质量浓度DOPA-IGF-1)。与基底材料相比较，担载DOPA-IGF-1后的纤维表面亲水性增加，这一现象有利于细胞黏附、增殖等行为^[39-40]。但是不同质量浓度的担载量未引起接触角的明显变化(10 ng/mL：(103±2.6)°，50 ng/mL：(105±2.4)°，100 ng/mL：(103±3.2)°)。

  图 2

  

  图 2.  PLGA/P3HT纤维的亲水接触角

  Figure 2.  Contact angle of PLGA/ P3HT electrospinning fibers

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  2.4   有无电刺激条件下PLGA/P3HT纤维对PC12细胞增殖的影响

  用CCK-8定量检测PC12细胞增殖情况，测定细胞在1、4、7 d内的代谢活性。结果如图 3，随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，表现出良好的增殖状态，表明PLGA/P3HT纤维无细胞毒性并且具有细胞相容性。在无电刺激条件下，培养1 d后，PLGA纤维上的细胞数量多于其它组。在培养1到4 d时，细胞进入快速增殖生长阶段。7 d后，在PLGA、PLGA/P3HT5和PLGA/P3HT10的纤维表面出现相似的增殖效果。施加脉冲电刺激4 d后，PLGA/P3HT5纤维上细胞数量高于PLGA纤维。7 d后，PLGA/P3HT5纤维表现出比其它组更有效的促进细胞增殖效果。培养4和7 d后，电刺激条件下的PLGA/P3HT纤维上的细胞数量普遍高于未施加电刺激组，这表明电活性PLGA/P3HT5纺丝支架结合外加电刺激能够促进PC12增殖。

  图 3

  

  图 3.  有无电刺激条件下细胞增殖

  Figure 3.  Cell proliferation of PC12 cells with and without electrical stimulation

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  2.5   有无电刺激条件下PLGA/P3HT纤维对PC12细胞活性的影响

  将PC12接种在纤维上培养1、4、7 d后，分别通过活/死染色实验检测细胞的存活率。图 4为细胞活/死染色的荧光图像。随着培养时间增加，所有纤维上活细胞数量明显增加。无电刺激条件下，培养1 d后，PLGA纤维与其他纤维相比活细胞数量最多，PLGA/P3HT3纤维上活细胞数量相对较少。4 d后，PLGA/P3HT10纤维上出现较多的死细胞。施加电刺激条件下，PLGA/P3HT纤维上活细胞数量明显高于PLGA纤维。培养7 d后，PLGA/P3HT5、PLGA/P3HT10纤维上活细胞数量明显多于其他组。与PLGA/P3HT5纤维相比PLGA/P3HT10纤维上出现较多的死细胞。结果表明，PLGA/P3HT5电活性纤维结合电刺激条件具有更好的细胞响应性。所以接下来的实验选用PLGA/P3HT5纤维作为基底材料载DOPA-IGF-1，结合电刺激促进神经修复。

  图 4

  

  图 4.  活/死荧光图像(calcein AM，绿色，活细胞；PI，红色，死细胞)

  Figure 4.  LIVE/DEAD fluorescent images(calcein AM, green, live cell; propidium iodide, red, dead cell)

  A.PLGA; B.PLGA/P3HT3; C.PLGA/P3HT5; D.PLGA/P3HT10

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  2.6   有无电刺激条件下细胞在PLGA/P3HT纤维上的形态

  在纤维表面上培养PC12细胞，SEM观察细胞形态(图 5)发现，PLGA纤维上的细胞呈扩散状，表现为扁平的特征性表型，胞浆扩张。在电活性PLGA/P3HT纤维上，细胞铺展，胞体饱满，并且有伪足延伸附着在纤维表面。当施加电刺激后，可以观察到在电活性PLGA/P3HT纤维上，细胞数量增多，细胞增殖活跃，细胞扩散并伸长，并建立了细胞间接触。伪足与电纺纤维相互作用、相互关联，并通过纤维与相邻细胞连通。表明电活性PLGA/P3HT纤维具有诱导PC12细胞分化成神经元样细胞的能力。

  图 5

  

  图 5.  有无电刺激条件下PLGA、PLGA/P3HT3、PLGA/P3HT5和PLGA/P3HT10纤维上的PC12细胞形貌SEM照片

  Figure 5.  SEM images of PC12 cell morphology on PLGA, PLGA/P3HT3, PLGA/P3HT5 and PLGA/P3HT10 fibers with or without electrical stimulation

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  2.7   DOPA-IGF-1担载

  利用免疫荧光染色法验证DOPA-IGF-1是否成功担载到纤维基质上。如图 6所示，从免疫荧光染色图像上清楚地观察到PLGA/P3HT纤维基质上成功地黏附了IGF-1，表明YKYKY残基通过酪氨酸酶被羟基化成DOPA-Lys-DOPA-Lys-DOPA，其中DOPA的邻苯二酚基团被氧化形成蛋白质层(DOPA-IGF-1)，并成功黏附在纤维基质表面。DOPA-IGF-1含有多巴，DOPA修饰的材料表面功能化已被用于组织工程，可促进细胞黏附和增殖，同时，IGF-1作为广谱的生长因子，可以调节神经生长。将生长因子IGF-1固定在电活性PLGA/P3HT基质材料上，为神经修复提供持续有效的作用。然而，质量浓度为10 ng/mL的DOPA-IGF-1存在较弱的荧光图像，随着DOPA-IGF-1质量浓度提高，纳米纤维基质的荧光强度得到显着增强，表明随着DOPA-IGF-1质量浓度增加，蛋白在纤维基质上的担载量提高。

  图 6

  

  图 6.  DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT免疫荧光图像

  Figure 6.  Immunofluorescence images of 10-DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT(A), 50-DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT(B), and 50-DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT(C)

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  2.8   DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT对细胞黏附的影响

  DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT受贻贝粘合原理的启发，使用一种温和的条件将生长因子担载在材料表面，达到持续稳定的效果，克服了生长因子使用时存在不稳定性和扩散性的局限性。IGF-1作为一种广谱的生长因子，能够调节神经生长。本研究中利用酪氨酸羟化酶，将DOPA-IGF-1绑定在PLGA/P3HT纤维表面，制备一种理想型的神经修复材料，结合外加电刺激应用于神经修复。图 7A为FITC染色荧光图像，担载DOPA-IGF-1的纤维上，PC12细胞培养6和12 h后的黏附状态。6 h后，在PLGA/P3HT，10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT，50 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT的材料上呈现出较好的细胞黏附状态，细胞黏附量高于其它组。12 h后，10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT基质上细胞黏附量明显增加。从黏附面积统计数据图 7B看出，在培养6、12 h后，绑定质量浓度为10 ng/mL的材料，细胞黏附面积明显高于其他组。然而，与10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT材料相比较，PC12在50 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT纤维上黏附面积减小，100 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT材料上细胞黏附面积明显下降。结果表明，电活性PLGA/P3HT纤维绑定适量质量浓度的DOPA-IGF-1后能协同促进细胞黏附。结合DOPA-IGF-1质量浓度为10 ng/mL能达到更好地促进效果。

  图 7

  

  图 7.  (A) FITC荧光染色图像和(B)细胞6 h和12 h黏附面积

  Figure 7.  (A)FITC fluorescent staining images and (B)Quantitative analysis of cell adhesion area after 6 and 12 h

  S1.Glass; S2.PLGA/P3HT; S3.10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S4.50 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S5.100 ng/mL

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  2.9   DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT对细胞增殖影响

  图 8A是PC12细胞在材料上分别培养1、4和7 d后的细胞核染色荧光图像。随着培养时间的增加，细胞核数量呈现增加趋势，说明DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT具有良好的细胞相容性。从图 9B细胞增殖数据分析，1 d后，细胞在50 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT纤维上的数量明显高于在Glass组和PLGA/P3HT纤维上的数量。在培养4和7 d后，细胞在10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT纤维上的活性显著增加(P＜0.05)。结合电刺激条件，电活性PLGA/P3HT纤维上细胞数量高于不含导电材料的Glass组。在本研究中，3组质量浓度的DOPA-IGF-1担载在纤维基质表面，其中，质量浓度为10 ng/mL的DOPA-IGF-1在促进PC12细胞增殖方面是最有效的。并且促增殖效果高于Glass组和电活性PLGA/P3HT纤维。表明电活性材料结合生物活性生长因子能更有效的促进细胞活性，在促细胞增殖方面起到协同效应。然而，当DOPA-IGF-1溶液的质量浓度为50 ng/mL，促增殖能力和未担载生长因子的电活性纤维相似。当DOPA-IGF-1质量浓度达到100 ng/mL时，PC12细胞增殖被显著抑制(P＜0.05)。表明IGF-1与PC12细胞活性之间存在剂量相关性，小剂量(不超过50 ng/mL)的DOPA-IGF-1由于其固有的粘附性而发挥更好的生物学效应。在该研究中，10 ng/mL DOPA-IGF-1固定的电活性PLGA/P3HT纤维基质，能够促进PC12增殖，在周围神经修复和再生中具有潜在的应用前景。

  图 8

  

  图 8.  (A) DAPI染色荧光图像和(B)PC12细胞增殖

  Figure 8.  (A)DAPI staining of fluorescent images and (B)Cell proliferation of PC12 cells

  S1.Glass; S2.PLGA/P3HT; S3.10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S4.50 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S5.100 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT

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  3.   结论

  通过静电纺丝工艺制备了含P3HT质量分数为0、3%、5%和10%的PLGA/P3HT电活性纤维支架。该纤维具有仿生细胞外基质结构，能为细胞提供接触诱导，促进细胞生长。在电刺激条件下，P3HT质量分数为5%的PLGA/P3HT电活性纤维能明显地促进PC12增殖和细胞活性。PLGA/P3HT5纤维作基底材料，通过温和条件绑定不同质量浓度(10、50、100 ng/mL)的DOPA-IGF-1，实现电活性和生物活性连用的协同效应。绑定适量质量浓度(10 ng/mL)的DOPA-IGF-1能有效地促进细胞黏附以及细胞增殖。我们制备的具有电活性和生物活性的DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT纤维在神经组织修复领域具有潜在的应用价值。

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  图 1  PLGA、PLGA/P3HT3、PLGA/P3HT5和PLGA/P3HT10的SEM图像、纤维直径分布和EDX

  Figure 1  SEM images(A), fiber diameter distribution(B) and EDX(C) of PLGA, PLGA/P3HT3, PLGA/P3HT5 and PLGA/P3HT10 fibers

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  图 2  PLGA/P3HT纤维的亲水接触角

  Figure 2  Contact angle of PLGA/ P3HT electrospinning fibers

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  图 3  有无电刺激条件下细胞增殖

  Figure 3  Cell proliferation of PC12 cells with and without electrical stimulation

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  图 4  活/死荧光图像(calcein AM，绿色，活细胞；PI，红色，死细胞)

  Figure 4  LIVE/DEAD fluorescent images(calcein AM, green, live cell; propidium iodide, red, dead cell)

  A.PLGA; B.PLGA/P3HT3; C.PLGA/P3HT5; D.PLGA/P3HT10

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  图 5  有无电刺激条件下PLGA、PLGA/P3HT3、PLGA/P3HT5和PLGA/P3HT10纤维上的PC12细胞形貌SEM照片

  Figure 5  SEM images of PC12 cell morphology on PLGA, PLGA/P3HT3, PLGA/P3HT5 and PLGA/P3HT10 fibers with or without electrical stimulation

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  图 6  DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT免疫荧光图像

  Figure 6  Immunofluorescence images of 10-DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT(A), 50-DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT(B), and 50-DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT(C)

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  图 7  (A) FITC荧光染色图像和(B)细胞6 h和12 h黏附面积

  Figure 7  (A)FITC fluorescent staining images and (B)Quantitative analysis of cell adhesion area after 6 and 12 h

  S1.Glass; S2.PLGA/P3HT; S3.10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S4.50 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S5.100 ng/mL

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  图 8  (A) DAPI染色荧光图像和(B)PC12细胞增殖

  Figure 8  (A)DAPI staining of fluorescent images and (B)Cell proliferation of PC12 cells

  S1.Glass; S2.PLGA/P3HT; S3.10 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S4.50 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT; S5.100 ng/mL DOPA-IGF-1@PLGA/P3HT

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  表 1  不同比例的PLGA/P3HT静电纺丝纤维

  Table 1.  Different weight ratio of PLGA/P3HT electrospinning fibers

  Sample	m(PLGA)/mg	m(P3HT)/mg	V(CHCl3)/mL	w(P3HT)/%
  PLGA	400	0	2	0
  PLGA/P3HT3	400	12	2	3
  PLGA/P3HT5	400	20	2	5
  PLGA/P3HT10	400	40	2	10

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  表 2  由图 1C得到元素的原子质量分数

  Table 2.  Atomic mass fraction of elements calculated from Fig. 1C

  Sample	w(C)/%	w(O)/%	w(S)/%
  PLGA	54.93	40.15
  PLGA/P3HT3	55.02	31.31	0.65
  PLGA/P3HT5	56.04	32.14	0.80
  PLGA/P3HT10	56.40	32.37	1.56

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