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• 丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，味芳、性微寒、具有活血调经、祛瘀止痛、养心安神的功效^[1]。汞是一种能长期存在的环境污染物，具有易迁移性、高生物富集性等特性^[2]，目前我国丹参中汞离子严重超标的问题则时有报道^[3-4]，这严重影响了我国丹参的质量和信誉。为了环境和人类的健康系统，也为了让我国丹参产品走向世界，走出国门，我们就必须参严格控制丹参产品的质量。

  目前，检测丹参中汞离子常用的有以下几种分析方法：电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法^[5]、紫外分光光度法^[6]、原子吸收光谱法^[7]、微波消解-原子荧光光谱法^[8]、原子荧光光谱法^[9]及X射线荧光法^[10]。但是这些方法仪器庞大，价格昂贵，实验操作复杂，需要专业技术人员进行分析，不适合对样品进行现场快速检测^[11]。所以，目前迫切需要建立一个新型快速，且方便系统的分析方法来检测丹参中的汞离子。

  电致化学发光，也称为电化学发光(ECL)，它是电化学和化学发光相结合的产物，是通过电化学反应直接或间接引发的化学发光现象。通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电势或通过一定的电流，电极产物之间或电极产物与体系中其它外加共存物质之间发生化学反应而产生化学发光，或发光物质直接在电极上发生氧化还原反应后生产某种不稳定的中间态物质分解而发光。

  2008年，Ono等^[12]报道了在汞离子存在的情况下，汞离子可以和胸腺嘧啶(T)形成一种比碱基配对还要稳定的结构T-Hg²⁺-T。Hg²⁺与胸腺嘧啶(T)之间的相互作用机理为：Hg²⁺可以取代胸腺嘧啶中的第3个氮氢基成为连接两个胸腺嘧啶之间的桥梁。由于T-Hg²⁺-T复合的热稳定性要高于腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)之间的碱基互补配对，因此，在汞离子的存在下，更易形成T-Hg²⁺-T的复合结构。

  本文利用分子识别技术和胸腺嘧啶碱基对(T-T)错配可以选择性捕获Hg²⁺形成T-Hg²⁺-T的特殊结构这种特性^[12]来构建“Off-On”电化学发光生物传感器对丹参中汞离子进行检测。该传感器由ECL基底和ECL信号开关两部分组成，使用二茂铁标记的DNA(Fc-DNA)作为DNA探针，其不但可以与环糊精(CD)作用^[13]而且可以使Ru(bpy)₃²⁺分子发生电化学发光猝灭^[14-15]。金纳米粒子(AuNPs)表面积大，电催化活性高，可作为信号增强平台^[16]。传感系统是通过首先在玻璃碳电极(GCE)上修饰β-CD-AuNPs/全氟磺酸(Nafion)复合物，然后通过二茂铁和β-CD功能化AuNPs之间的超分子相互作用将Fc-DNA固定在修饰过的GCE上。结果表明，当检测体系中没有Hg²⁺存在时，ECL传感器保持了原始的发夹结构，二茂铁可以有效地猝灭Ru(bpy)₃²⁺的发光；当有Hg²⁺存在时, Hg²⁺可与修饰电极上DNA的T碱基发生较强的特异结合, 形成T-Hg²⁺-T发卡结构, 使DNA分子构象发生改变, 其末端具有电化学活性的二茂铁基团远离电极表面, 电化学响应随之发生变化，ECL的变化强度(ΔI_ECL)可以反映检测液中Hg²⁺的含量，实现Hg²⁺的定量检测。

  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  MPI-E型电致化学发光(ECL)分析系统(西安瑞迈分析仪器有限公司)；CHI-660型电化学分析仪(美国CHI分析仪器公司)；JEOL-JEM-2100F型透射电子显微镜(TEM, 日本JOEL公司)；Q50型超声波清洗仪(上海必能信超声公司)；TGL-16C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

  三电极系统，玻碳电极(Φ=2.0 mm)作为工作电极、Ag/AgCl(饱和KCl溶液)作为参比电极、铂丝为对电极，均购自上海辰华仪器有限公司。

  丹参(江西上饶)，二茂铁标记的寡核苷酸序列(Fc-DNA)：Fc-5′-ATT GTT GTC CCC TCT TCT TTT GGC TGG TGA GAT CAG CC-3′购自生工生物工程上海股份有限公司，联吡啶钌(Ru(bpy)₃²⁺，99.95%)、巯基己醇(SH-(CH₂)₆-OH，＞97.0%)、三丙胺(TPA)均购自于美国Sigma公司，铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)均购自于洛阳市化学试剂厂，磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O，天津市科密欧化学试剂有限公司)，乙醇(CH₃CH₂OH，天津市天力化学试剂有限公司)，硼氢化钠(NaBH₄，国药集团化学试剂有限公司)，氯金酸(HAuCl₄，光谱纯，上海医药试剂公司)，β-环糊精(β-CD，Wacker化学公司)，二甲基亚砜(DMSO，天津市科密欧化学试剂有限公司)，氢氧化钠(NaOH，洛阳市化学试剂厂)，全氟磺酸(Nafion，天津市大茂化学试剂厂)。0.1 mol/L含有三丙胺的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)由0.1 mol/L磷酸二氢钾和0.1 mol/L磷酸氢二钾按一定比例配制，以上未标明纯度的化学试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

  1.2   β-环糊精功能化金纳米粒子(β-CD-AuNPs)的制备

  巯基-β-环糊精(SH-β-CD)是按照文献[17]方法合成。β-环糊精金纳米粒子(β-CD-AuNPs)参考文献[18]方法改进合成。将20 mL HAuCl₄(0.6 mmol/L)二甲基亚砜水溶液(V(H₂O)：V(DMSO)=1：4)与含0.8 mg SH-CD和60.4 mg硼氢化钠(NaBH₄)搅拌形成的16 mL DMSO快速混合，该反应混合物要在室温下连续搅拌24 h，然后，在反应混合物中添加32 mL CH₃CN并用离心法分段收集沉淀。然后分别用50 mL的CH₃CN和DMSO(V(CH₃CN)：V(DMSO)=1：1)的混合溶液和50 mL乙醇离心洗净多次，收集沉淀，在60 ℃的真空环境下放置干燥12 h后得β-CD-AuNPs。

  1.3   ECL-Hg²⁺生物传感器的制备

  1.3.1   玻碳电极上发光层的构建

  将0.50 g Nafion溶于100 mL水中，室温下磁力搅拌2 h后得到质量分数0.5%的Nafion溶液，再和环糊精金纳米粒子(β-CD-AuNPs)悬浮液(V(Nafion)：V(β-CD-AuNPS)=1：2)混合并超声30 min得到β-CD-AuNPs/Nafion分散液，于4 ℃下保存备用。分别用0.30和0.05 μm Al₂O₃粉末打磨玻碳电极，然后用超纯水超声清洗。用微量注射器吸取10 μL的β-CD-AuNPs/Nafion分散液滴加在清洗过的玻碳电极表面，并且让其在室温下自然晾干，得到β-CD-AuNP_S/Nafion修饰的玻碳电极(β-CD-AuNPs/Nafion/GCE)。

  将β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极放入1.0 mL的1.0 mmol/L联吡啶钌(Ru(bpy)₃²⁺)溶液中浸泡30 min，后用10 mmol/L PBS(pH=7.4)彻底冲洗制得发光底层，记作Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极。

  1.3.2   玻碳电极上猝灭层的构建

  将Ru(bpy)₃²⁺/CD-AuNPs/Nafion/GCE电极浸泡在0.3 mL 0.1 mmol/L的Fc-DNA中，室温放置60 min后再用10 mmol/L的PBS(pH=7.4)彻底冲洗，制得Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD- AuNPs/Nafion/GCE汞离子电化学发光(ECL)传感器，传感器的制备过程示意图如图 1所示。

  图 1

  

  图 1.  检测Hg²⁺的ECL生物传感器制备过程示意图

  Figure 1.  Schematic diagram of the design and preparation of the ECL biosensor for Hg²⁺ detection

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  1.4   测定方法

  使用三电极系统，铂丝为对电极，Ag/AgCl(饱和KCL)为参比电极，Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极为工作电极。

  室温下，将Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极浸入到20 mL含50 mmol/L三丙胺(TPA)的0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液中，选择光电倍增管为800 V、放大级数为3、扫描速率为0.1 V/s，灵敏度1.0×10^-4，在0.6~1.2 V(vs.Ag/AgCl)的范围内施加循环伏安(CV)扫描模式，同时记录CV和ECL信号。

  1.5   丹参中Hg²⁺的检测

  我们采集了江西上饶的丹参作为样品。采用微波消解法处理样品：将丹参药材置于60 ℃的烘箱中干燥后粉碎，过0.850 mm尼龙筛，保存备用。取药材粗粉约0.30 g，精密称定后置于100 mL聚四氟乙烯消解罐中，依次加入4.0 mL HNO₃、2.0 mL H₂O₂和2.0 mL H₂O，振摇使混合均匀，静置2 h，按表 1所列步骤条件进行微波消解。消解完全后，将消解液过滤转移至25 mL容量瓶中，用2%HNO₃定容至刻度，摇匀后备用。同法制作空白样品，样品制备好后进行检测。

  表 1

  

  表 1  微波消解条件

  Table 1.  Microwave digestion conditions

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  Steps	Heating-up Time/min	Temperature/℃	Time of duration/min
  1	7	120	3
  2	7	160	4
  3	10	180	20

  2.   结果与讨论

  2.1   β-环糊精金纳米粒子(β-CD-AuNPs)的表征

  对实验中合成的β-CD-AuNPs复合物进行微观形态的TEM表征(图 2)。由图 2可以看出，合成的β-CD-AuNPs的平均直径为20 nm，球状且均匀。

  图 2

  

  图 2.  β-环糊精金纳米粒子合成的TEM照片

  Figure 2.  TEM image of the β-CD-AuNPs

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  2.2   可控固相Ru(bpy)₃²⁺-电致化学发光膜的特征

  在0.1 mol/L的含0.05 mol/L TPA的PBS(pH=7.4)中, 记录了不同修饰电极的ECL信号，结果如图 3所示。裸GCE电极上无ECL信号(图 3A曲线a)，当Ru(bpy)₃²⁺固定到β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极表面时，可以观察到明显的ECL信号(图 3A曲线b)，同时对电极进行差示脉冲伏安法(DPV)检测，未发现电流变化(图 3B曲线b)，而当Fc-DNA通过主客体识别固定到Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极上，可以观察到，ECL强度显著下降(图 3B曲线c)，对电极进行DPV检测，可以发现在0.2 V时产生了一个强的Fc的氧化还原电流(图 3B曲线c)。

  图 3

  

  图 3.  不同修饰电极的ECL信号(A)和DPV信号(B)

  Figure 3.  ECL responses(A) and DPV responses(B) of different electrodes

  a.GCE; b.Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE; c.Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE

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  结果表明，从图 3A曲线b和图 3B曲线c可以看出，Fc-DNA可以高效猝灭Ru(bpy)₃²⁺的ECL信号，猝灭机理是由于Fc⁺(Fc的氧化态)与Ru(bpy)₃²⁺的双分子能量或电子转移，及干扰自由基反应。从图 3B曲线b和c可以看出，Ru(bpy)₃²⁺的ECL猝灭效率取决于Fc-DNA在Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极的表面覆盖度大小。

  2.3   孵育时间的优化

  Hg²⁺电致化学发光传感器的孵育时间在检测中起着重要作用，因此在这里考察了该ECL传感器在200 ng/mL Hg²⁺中孵育不同时间对ECL强度的影响。结果如图 4所示，Hg²⁺的孵育时间在10~40 min中，ECL强度随着时间增加而增强。40 min后，ECL强度上升缓慢并到达一个平台。所以，本文选择40 min作为孵育时间。

  图 4

  

  图 4.  汞离子孵育时间对ECL强度的影响

  Figure 4.  ECL responses of Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE to 200 ng/mL Hg²⁺ with different incubation time

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  2.4   电致化学发光Hg²⁺生物传感器的分析性能

  在优化的实验条件下，使用Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE电极对Hg²⁺检测的质量浓度范围和灵敏度进行评价。图 5A为ECL传感器对不同浓度Hg²⁺的ECL响应信号，由图 5B可以看出，Hg²⁺质量浓度增加，ECL强度增强，ECL强度与Hg²⁺质量浓度在0.04 ng/mL到800 ng/mL的范围内呈正相关关系，线性回归方程式为y=815.5lg x+9725，相关系数r=0.9978(图 5B)，检测限为0.02 ng/mL(S/N=3)。

  图 5

  

  图 5.  传感器在不同Hg²⁺质量浓度下的ECL曲线图(A)及传感器ECL强度与Hg²⁺质量浓度对数之间的关系图(B)

  Figure 5.  ECL responses to different mass concentrations of Hg²⁺(A) and the calibration curve of the ECL response as a function of the concentration of Hg²⁺(B)

  Error bars represent the standard deviation of three parallel experiments

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  表 2

  

  表 2  各种汞离子检测方法检测限的比较

  Table 2.  Comparison of sensitivity for different Hg(Ⅱ) ion assay methods

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  Analytical method	Label	Detection limit/	Ref.
  Fluorescence detection	Graphene Oxide	0.3 nmol/L	[19]
  Fluorescence detection	Au clusters	10.0 nmol/L	[20]
  Fluorescence detection	Molecular Beacon	19.0 nmol/L	[21]
  Electrochemical	AuNPs	0.5 nmol/L	[22]
  Electrochemical	glucose oxidase	100 pmol/L	[23]
  Electrochemical	reduced graphene oxide-polyfuran nanohybrids	10.0 pmol/L	[24]
  Colorimetry	AuNPs	1.0 nmol/L	[25]
  Colorimetry	metal NPs	5.0 nmol/L	[26]
  Fluorescent/Colorimetric	rhodamine derivative	5.0 nmol/L	[27]
  Resonance scattering	AuNPs	1.3 nmol/L	[28]
  Resonance Rayleigh Scattering	/	20.0 pmol/L	[29]
  Electrochemiluminescence	Fc-Ru(bpy)32+ system	0.1 nmol/L	This work

  2.5   干扰实验

  分别研究了Sn²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Li⁺和Na²⁺这11种其它金属离子对这个新型传感器的影响，以检测该传感器的选择性。将该传感器浸泡在20 mL含50 mmol/L TPA的0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液中40 min，再在含一定质量浓度的金属离子溶液中进行ECL信号测定(图 6)，其中，Hg²⁺质量浓度为100 ng/mL，其它金属离子的质量浓度为10 μg/mL。结果显示，当干扰离子质量浓度高于Hg²⁺质量浓度2个数量级时，电化学发光强度并无变化，只有Hg²⁺的ΔI_ECL呈现明显变化。说明Hg²⁺和ECL传感器进行了特异性识别，从而导致Hg²⁺与其它金属离子相比，有最高的信号增益变化。

  图 6

  

  图 6.  不同金属离子的ECL强度变化对比图

  Figure 6.  Effects of various metal ions on the ECL response measured by ECL biosensor

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  2.6   传感器的再生

  Fc-DNA所制备的ECL汞离子生物传感器很容易再生重建。Fc-DNA通过分子识别固定在电极上并且将电极浸泡到0.1 mmol/L Fc-DNA溶液中60 min即可使传感器实现再生，操作简单。如图 7所示，该传感器与800 ng/mL Hg²⁺孵育后，再在Fc-DNA溶液中浸泡后，传感器信号可以恢复到原始空白值，N代表传感器可再生次数。因此，说明制作好的ECL汞离子生物传感器具有较好的再生性。

  图 7

  

  图 7.  ECL生物传感器的再生示意图

  Figure 7.  The regeneration diagram of the ECL biosensor

  N:represents the number of times the sensor was re-generated

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  2.7   传感器的应用

  在空白样品中并没有电致化学发光强度变化，所以证明不存在Hg²⁺。接下来，在丹参样品中添加不同程度的Hg²⁺，当Hg²⁺质量浓度为800、100和50 ng/mL时，相应的回收率分别为(104.1±10.22)%、(101.2±8.12)%和(99.1±2.28)%。因此，这种方法对于监测传统中医药植物丹参中低质量浓度的Hg²⁺具有重要意义。

  3.   结论

  本研究构建的基于主客体识别技术及T-Hg²⁺-T特异性结合的新型“Off-On”电致化学发光生物传感器成功实现了对中药材丹参中Hg²⁺的检测。该传感器利用二茂铁对联吡啶钌发光信号的猝灭作用和T-T错配碱基与Hg²⁺的特异性结合能力，根据Hg²⁺培育前后电化学发光(ECL)信号的增加值来定量测量Hg²⁺，在0.04~800 ng/mL范围内对Hg²⁺具有良好的线性响应，检测限为0.02 ng/mL(S/N=3)。此传感器制备简单，具有良好的再生性，并且可重复利用且没有任何明显的损耗，相较于传统检测汞离子的方法操作简单，成本低。

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  图 1  检测Hg²⁺的ECL生物传感器制备过程示意图

  Figure 1  Schematic diagram of the design and preparation of the ECL biosensor for Hg²⁺ detection

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  图 2  β-环糊精金纳米粒子合成的TEM照片

  Figure 2  TEM image of the β-CD-AuNPs

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  图 3  不同修饰电极的ECL信号(A)和DPV信号(B)

  Figure 3  ECL responses(A) and DPV responses(B) of different electrodes

  a.GCE; b.Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE; c.Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE

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  图 4  汞离子孵育时间对ECL强度的影响

  Figure 4  ECL responses of Fc-DNA/Ru(bpy)₃²⁺/β-CD-AuNPs/Nafion/GCE to 200 ng/mL Hg²⁺ with different incubation time

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  图 5  传感器在不同Hg²⁺质量浓度下的ECL曲线图(A)及传感器ECL强度与Hg²⁺质量浓度对数之间的关系图(B)

  Figure 5  ECL responses to different mass concentrations of Hg²⁺(A) and the calibration curve of the ECL response as a function of the concentration of Hg²⁺(B)

  Error bars represent the standard deviation of three parallel experiments

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  图 6  不同金属离子的ECL强度变化对比图

  Figure 6  Effects of various metal ions on the ECL response measured by ECL biosensor

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  图 7  ECL生物传感器的再生示意图

  Figure 7  The regeneration diagram of the ECL biosensor

  N:represents the number of times the sensor was re-generated

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  表 1  微波消解条件

  Table 1.  Microwave digestion conditions

  Steps	Heating-up Time/min	Temperature/℃	Time of duration/min
  1	7	120	3
  2	7	160	4
  3	10	180	20

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  表 2  各种汞离子检测方法检测限的比较

  Table 2.  Comparison of sensitivity for different Hg(Ⅱ) ion assay methods

  Analytical method	Label	Detection limit/	Ref.
  Fluorescence detection	Graphene Oxide	0.3 nmol/L	[19]
  Fluorescence detection	Au clusters	10.0 nmol/L	[20]
  Fluorescence detection	Molecular Beacon	19.0 nmol/L	[21]
  Electrochemical	AuNPs	0.5 nmol/L	[22]
  Electrochemical	glucose oxidase	100 pmol/L	[23]
  Electrochemical	reduced graphene oxide-polyfuran nanohybrids	10.0 pmol/L	[24]
  Colorimetry	AuNPs	1.0 nmol/L	[25]
  Colorimetry	metal NPs	5.0 nmol/L	[26]
  Fluorescent/Colorimetric	rhodamine derivative	5.0 nmol/L	[27]
  Resonance scattering	AuNPs	1.3 nmol/L	[28]
  Resonance Rayleigh Scattering	/	20.0 pmol/L	[29]
  Electrochemiluminescence	Fc-Ru(bpy)32+ system	0.1 nmol/L	This work

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