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膀胱癌液体活检的研究进展

曾波 ,  杨雁冰 ,  梁玲 ,  袁荃

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引用本文: 曾波, 杨雁冰, 梁玲, 袁荃. 膀胱癌液体活检的研究进展[J]. 应用化学, 2019, 36(4): 367-378. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2019.04.180412 shu
Citation:  ZENG Bo, YANG Yanbing, LIANG Ling, YUAN Quan. Recent Advances of Liquid Biopsy for Bladder Cancer Diagnosing[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2019, 36(4): 367-378. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2019.04.180412 shu

膀胱癌液体活检的研究进展

  • a.

    武汉大学化学与分子科学学院 武汉 430072

  • b.

    湖南大学分子科学与生物医学实验室(MBL), 化学生物学与纳米医学研究所, 化学化工学院 长沙 410082

    • 通讯作者: 袁荃, 教授, Tel:027-68756362, E-mail:yuanquan@whu.edu.cn, 研究方向:功能纳米材料控制合成及其生物医学应用研究
  • 基金项目:

    国家自然科学基金（21675120）、国家重点研发计划（2017YFA0208000）、国家自然科学基金创新研究群体科学基金（21521063）、“万人计划”青年拔尖人才支持经费和湖南大学科研启动基金（531107050973，531109010053）资助

摘要: 膀胱癌是一种高发病率和致死率的恶性肿瘤疾病，通常情况下在中后期才能被诊断出来，给患者带来了巨大的身心伤害。膀胱镜检查是膀胱癌诊断的金标准，但这种方法具有一定的侵入性，并且在膀胱癌的早期诊断中，灵敏度和特异性较低，容易出现较高的假阳性率。膀胱癌的发生会对血液和尿液的成分产生直接影响，因此非侵入性的液体活检将为膀胱癌的早期诊断带来新的检测方法。本篇综述介绍了基于液体活检的膀胱癌诊断方法的发展进程。首先，对膀胱癌的主要标志物进行了简单介绍。其次，重点总结了以液体（如尿液和血液）为检测对象的膀胱癌诊断方法和诊断机制。除此之外，我们对膀胱癌液体活检面临的机遇和挑战进行了阐述。我们希望这篇综述将为膀胱癌的液体活检提供指导。

English

  • 膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，在男性恶性肿瘤中发病率排在第四位，在女性中为第十一位，其发病率也在逐年上升[1]。根据浸润程度的不同，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。非肌层浸润性膀胱癌约占膀胱癌的75%，其中50%为低级，肿瘤主要形状为微乳头状，5年存活率为90%，但复发率高[2-3]；肌层浸润性膀胱癌约占膀胱癌的25%，并且多数为高级，肿瘤主要为混合形状，有一半发展为转移性肿瘤，5年存活率仅为5%[4-8]。有研究表明，长期抽烟会使膀胱癌的发病率上升约3倍；经常接触芳香胺等(联苯胺和β-萘)致癌性有机物也会导致发病率上升[9-11]。综上所述，及早诊断对于膀胱癌的后期治疗有着极大的意义[12-13]。

    膀胱癌的诊断方法主要包括体外成像、膀胱镜检查、组织活检和液体活检等。体外成像技术主要包括计算机断层扫描尿路成像、核磁共振成像和经腹超声等[14]，但该技术在癌症早期诊断中往往出现较高的假阳性率。膀胱镜检查作为膀胱癌诊断的金标准，近年来虽然已经被改进并采用软性材料，但是仍然具有较大的侵入性，给病人带来极大的痛苦，病人在检测之后的几天内会出现血尿和尿道疼痛等问题，并且该检查对于膀胱癌早期诊断的特异性和灵敏度较低[15-17]。组织活检检测对象为疑似病变组织，主要是对膀胱癌细胞形态和生物标志物进行检测，具有较高的特异性和灵敏度，但在取样过程中对病人有一定的侵入性，还存在样品前处理时间较长和步骤复杂等缺点。液体活检作为一种非侵入性的检测手段，可以对血液、尿液、唾液及汗液等体液中的疾病标志物进行检测来反映肿瘤细胞的整体表达情况。液体活检的检测手段主要包括光学、电化学、磁学和免疫学等[18-19]，可以对样品进行多次检测，并且具有较高的重现性。液体活检可以对多种生物标志物联合分析检测，进一步提高检测结果的灵敏度和特异性。液体活检具有较高的效率，检测时间一般在几分钟之内，可以实现对肿瘤标志物的快速检测。除此之外，液体活检还容易实现便携化，近年来已经被广泛应用于疾病诊断，具有非常好的应用前景[20-21]。

    本综述主要介绍基于液体活检的膀胱癌诊断方法的发展进程。首先，对膀胱癌的主要生物标志物进行了概括介绍。其次，重点总结了基于液体活检的不同检测手段如紫外可见(UV-Vis)吸收光谱、荧光光谱、电化学发光和电化学传感等在膀胱癌诊断中的应用。此外，我们对液体活检在膀胱癌诊断方面面临的机遇和挑战进行了阐述。我们希望通过本综述对膀胱癌液体活检法进行分类，为膀胱癌早期诊断的发展提供有效的目标和发展方向。

    1.   膀胱癌早期诊断方法

    膀胱癌的标志物主要包含DNA、mRNA、蛋白质和细胞等。DNA生物标志物包括DBC1、MYO3A、SOX11、NPTX2、NKX6-2、A2BP1、PENK和CA10等[22]，主要检测基因甲基化情况。mRNA生物标志物包含微小RNA-21(miRNA-21)[23]、存活素mRNA(survivin mRNA)、透明质酸酶mRNA和尿路上皮特异蛋白mRNA等，主要检测含量变化。蛋白质生物标志物包括细胞角蛋白(CK8、CK18、CK19、CK20)、核基质蛋白(NMP 22)、膀胱癌特异性核基质蛋白(BLCA-1、BLCA-4)、细胞凋亡相关蛋白(Bax、BCL-2、Caspase-3、XIAP)、基质金属蛋白(MMP-9、MMP-7)、血管内皮生长因子(VEGF)、组蛋白脱乙酰酶抑制剂M344、膀胱肿瘤细胞相关黏蛋白(LDQ10、19A211)、白细胞介素(IL-1α、IL-6、IL-8)、趋化因子、β-肌动蛋白(β-actin)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)[24]、纤连蛋白[25]、甲基转移酶[26]、端粒酶(telomerase)、存活素(survivin)和活素(livin)[27]等，主要检测含量变化及活性改变等情况。其它生物标志物包括染色体9p21、血清素、褪黑激素、透明质酸(HA)、纤维蛋白降解产物(FDP)、色氨酸及其代谢产物等[10, 13]。

    由上可知，膀胱癌生物标志物具有多样性，一些生物标志物在正常细胞中也会代谢产生，只是肿瘤的发生会导致代谢产物含量发生变化，这类生物标志物检测浓度一般在nmol/L或者μmol/L数量级，如CK8、CK18、NMP 22和细胞凋亡相关蛋白等。一些生物标志物是在肿瘤发生之后才会代谢产生，这类生物标志物只需要检测是否存在于样品中，根据检测方法的不同灵敏度和最低检出限，生物标志物浓度可以是nmol/L、pmol/L、fmol/L甚至是amol/L数量级，如存活素及其RNA、活素和miRNA等。还有一些生物标志物并非是检测浓度参数来实现诊断，而是因为癌症的发生导致其生物或化学性能变化，这类生物标志物检测浓度一般在nmol/L或者μmol/L数量级，如DNA和端粒酶等。因此，对不同标志物进行同时检测可以提高诊断准确性。同时, 由于不同阶段肿瘤表达的标志物种类和含量不同，对不同的肿瘤标志物进行检测可以对肿瘤进行分期和分级，以便在不同的发展阶段采用不同的治疗手段，设计个性化的医疗方案。因此，不同的研究团队也基于不同种类的标志物开发出了多样的检测方法，其中主要包括UV-Vis吸收光谱、荧光光谱、电化学发光、电化学传感、聚合酶链反应(PCR)和凝胶电泳等。

    1.1   基于UV-Vis吸收光谱的检测手段

    UV-Vis吸收光谱是基于价电子的跃迁而产生对紫外可见波段的光吸收，根据光吸收程度可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定和推断。基于UV-Vis吸收光谱的膀胱癌生物标志物分析方法主要是与酶联免疫吸附试验(ELISA)或夹心酶联免疫吸附试验等结合。生物标志物与酶标记的抗体特异性结合后，在特定的波长会产生光吸收，以此来定量检测生物标志物。

    Duan等[28]设计了一种四色态的双功能金纳米粒子(GNP)探针，用于直接检测尿液提取物中telomerase的活性和浓度(如图 1)。根据GNP探针显示出的4种颜色状态和检测样品在650和520 nm处吸光度的比值(即A650/A520)，将结果表示在一个数轴上。原点GNP探针为红色状态且A650/A520值小于0.23以及数轴负向A650/A520值大于0.60的坐标范围内，表示尿液提取物中telomerase活性不高或含量极少，为正常个体。数轴正向或负向A650/A520值在0.23~0.6之间，表示样品中有相对高浓度的telomerase，为膀胱癌患者。该检测策略可以以较高灵敏度和选择性区分膀胱癌患者、炎症患者和正常个体的尿液样品。与传统比色法相比，该双向法具有较好的鉴别能力并且可以快速评估telomerase的浓度和活性；与端粒扩增法相比，该策略更加精确和简单，并且避免了复杂和昂贵的检测手段，实现了肉眼可视化评估膀胱癌。但是，该策略所用的样本容量较小，仅为18人，还需要进一步扩增样本容量以确保适应于更多的膀胱癌患者。

    图 1

    图 1.  数轴理论用于膀胱癌临床评估的示意图[28]
    Figure 1.  Schematic drawing of the clinical evaluation of bladder cancer with number axis theory[28]
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    Li等[29]通过方阵滴定、涂层抗体(coating antibody)与检测抗体(detecting antibody)的不同组合，构建了survivin-ELISA，用于检测尿液中survivin的浓度(如图 2)。该方法巧妙地用不同组合的survivin单克隆抗体(McAb)和多克隆抗体(PcAb)作涂层抗体或检测抗体，利用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(IgG-HRP)与检测抗体特异性结合，再加入可被IgG-HRP特异性结合的显色底物(chromogenic substrate)，检测450 nm波长的吸光度值。将测试得到的102个膀胱癌患者和102个正常人的数据进行统计来测定批间精度、批内精度和最小检测量从而对该方法进行评估，进而确定此方法的灵敏度和特异性。通过优化不同条件，测得批内精度为8.39%，批间精度为8.57%，最小检测量为0.0625 ng/mL。当450 nm光密度为0.09时，可以得到最优的灵敏度和特异性，分别为70.6%和89.2%。该诊断方法解决了膀胱癌检测耗时和昂贵的缺点，但是在膀胱癌液体活检中灵敏度和特异性并非最佳数值，并且临床病理特征和检测数据的相关性分析较低，还需要更多的样本进一步探讨此方法的预后价值。

    图 2

    图 2.  夹心ELISA检测survivin的原理图[29]
    Figure 2.  Schematic diagram of the sandwich ELISA for detecting survivin[29]
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    May等[30]通过UV-Vis吸收法结合ELISA法检测膀胱癌标志物CK8/18，通过测定溶液在450 nm波长的吸光度来间接检测CK8/18的浓度。Konety等[31]采用免疫试验，利用抗体anti-BLCA-4与尿液提取物中BLCA-4特异性结合后样品在405 nm波长处的吸光度变化来检测BLCA-4并确定BLCA-4浓度。此外，还有一些分析方法基于膀胱癌生物标志物CK8/18和BLCA-4等与相应抗体特异性结合之后，检测溶液在某一波长的吸光度，来确定溶液中生物标志物以及标志物浓度[32-34]。

    综上可知，基于UV-Vis吸收光谱检测膀胱癌生物标志物主要是与免疫试验或ELISA联用，在抗原抗体特异性结合之后，通过测试溶液吸光度变化来定量检测膀胱癌标志物浓度。基于UV-Vis吸收光谱的膀胱癌检测具有设备简单、操作快捷和快速检测等优点。然而，这种方法检测精度较低，虽然可以定性和半定量检测分析物浓度，但是难以实现膀胱癌标志物的精确定量。此外，这种方法在检测膀胱癌生物标志物方面还受限于灵敏度(低于60%)和特异性(低于80%)低的问题，因此膀胱癌诊断准确度较低。

    1.2   基于荧光光谱的检测手段

    荧光光谱是当一束光照射到某种物质上时，该物质分子吸收光子能量从基态跃迁到某一激发态，处于某一激发态的分子可以通过不同弛豫过程失去一部分能量回到基态，其中一种是无辐射弛豫，如物理淬灭、分子间能量转移、分子内能量转移和光化学反应等；另一种为辐射弛豫，如荧光和磷光。荧光光谱在膀胱癌生物标志物检测中，主要利用荧光发射光谱检测不同底物的发射波长和荧光强度，基于荧光光谱的分析方法有ELISA、荧光原位杂交(FISH)和荧光成像等[35-41]。

    He等[42]采用荧光共振能量转移法设计了一种均相酶联免疫分析技术(AlphaLISA)用于检测CK19片段(CYFRA 21-1)(如图 3)。这种方法采用两种不同的CYFRA 21-1单克隆抗体，一种修饰在AlphaLISA受体纳米粒子上，另一种通过生物素(biotin)连接在给体纳米粒子表面。在溶液中有CYFRA 21-1的情况下，用680 nm激光照射溶液，检测615 nm波长的发光强度可以确定CYFRA 21-1的浓度。这种方法的线性范围为0.08~500 ng/mL，检出限为0.08 ng/mL，批内和批间变异系数分别为3.00%~9.00%和4.00%~10.00%。该方法具有较高的特异性，对甲胎蛋白、癌胚抗原、神经特异性烯醇化酶、癌抗原19-9和CK8/18等蛋白无响应。这种方法还具有良好的临床应用潜力、操作相对简单和线性范围宽特点，但是此方法测定的期望值和理论值有一定偏差(±5%)，精确度还较低，灵敏度和特异性还需要进一步提升。

    图 3

    图 3.  AlphaLISA检测CYFRA21-1示意图[42]
    Figure 3.  Schematic illustration of the detection of CYFRA21-1 with AlphaLISA[42]
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    Lou等[43]根据聚集诱导发光(AIE)原理，设计了一种检测尿液细胞提取物中telomerase活性的方法。带正电荷的荧光团四苯基乙烯盐(TPE-Z)在溶液中自由扩散时不具有荧光性，在静电引力作用下，带正电荷的TPE-Z会自发地与带负电荷的DNA骨架结合。一旦与DNA链结合，就会限制分子内运动过程，从而阻断TPE-Z的无辐射弛豫通路并激活其荧光。由于较长的DNA链可以提供更多的负电荷，它为更多的TPE-Z分子提供更多的结合位点来结合和聚集，从而产生更强的荧光信号。因此，癌细胞中telomerase活性增强使DNA链延长，使得TPE-Z的荧光强度增加，根据溶液荧光强度的增量就可以检测telomerase活性的激活程度。该研究团队对41个膀胱癌患者的尿液样本和15个正常个体的尿液样本的检测结果证实了这种AIE方法的临床检测能力，并且还量化了不同细胞系的细胞内telomerase活性。这种方法具有无标记、低至10个细胞的灵敏度和分析时间低于1 h的优势。

    Duan等[44]根据比率荧光法利用telomerase延伸反应和miRNA诱导的滚环扩增反应，用氧化石墨烯和切口酶(nicking enzyme)实现信号放大，设计了一种同时检测尿样中的telomerase和miRNA-21的方法(如图 4)。第一步是扩展TS引物(telomerase作为模板)和miRNA(环探针作为模板)。延长的TS引物和miRNA分别与telomerase分子信标(TMBs)和miRNA分子信标(M-MBs)进行杂交，分别在约520和610 nm处检测出发射峰。第二步是nicking enzyme辅助循环，从第一步生成产物，增强荧光信号。利用氧化石墨烯吸附冗余的T-MBs和M-MBs，降低信号噪声。这种二元分析方法可以同时输出与telomerase和miRNA含量对应的双检测信号。对258份尿液样本测试表明，这种二元分析法可以区分尿液与膀胱癌患者、膀胱炎患者和正常个体。该方法检测telomerase的检出限低至0.4 cell/μL；对miRNA-21检测灵敏度非常高，检出限为1 pmol/L。

    图 4

    图 4.  telomerase和miRNA检测示意图[44]
    Figure 4.  Schematic outline of the binary assay for telomerase and miRNA detection[44]
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    Zhuang等[45]根据比率荧光法设计了两种荧光染料并联的生物探针，用于检测telomerase活性。一种是红光发射(665 nm)聚集态荧光猝灭染料Cy5，标记在telomerase TS引物5′端；另一种是蓝光发射(478 nm)聚集诱导发射染料Silole-R，两种荧光染料发射互不干扰。随telomerase活性增加DNA链延长，聚集增加，引起478 nm荧光强度增加而665 nm荧光强度不变，即双发射强度比(I478/I665)逐渐增大，由此可检测尿液样品中telomerase活性大小。通过对20例膀胱癌血尿和10例正常尿液样本的telomerase提取物的鉴别，证实了这种生物探针的实用性，并且在膀胱癌血尿样品检测中有较高的重现性和100%的阳性率。

    Gogalic等[46]根据夹心酶联免疫吸附试验设计了一种同时检测6种膀胱癌标志物(MMP-9、survivin、IL-8、VEGF、MMP-7、CYFRA 21-1)的阵列芯片，用635 nm激光激发，检测670 nm波长的发光情况。该多标志物同时检测策略结果互不干扰，多种标志物的联合分析可消除单一标志物检测结果的误诊，增加诊断准确率。Bubendorf等[40]采用多探针荧光原位杂交(UroVysion)技术，对多种膀胱肿瘤细胞的3号染色体、7号染色体、正常拷贝数的17号染色体和9p21特定区域染色成像，观察正常细胞与肿瘤细胞的荧光成像差别。

    由上可知，基于荧光光谱检测膀胱癌生物标志物主要是利用荧光发光光谱，检测荧光染料标记的溶液发光强度或者样品的荧光成像，以此来定性或者定量检测生物标志物。荧光光谱主要是2000年之后发展的检测手段，至今仍有科研团队开发出基于荧光光谱的新型检测方法，并且此法也是医学上最常用的检测方法之一。荧光光谱检测膀胱癌生物标志物具有操作简单、检出限低和重现性好的特点。然而，由于样品前处理无法纯净的提取待测标志物，造成检测过程中非特异性干扰较大，或者荧光成像背景荧光干扰较大，降低了荧光光谱的精确度。因此，需要开发可以屏蔽背景荧光和减少非特异性结合的探针等来克服以上问题。最近，长余辉发光材料得到了快速的发展，在激发停止后仍持续发出荧光，为膀胱癌细胞无背景荧光成像提供了一种可行性极强的策略。

    1.3   基于电化学发光的检测手段

    电化学发光是利用电极原位产生试剂，这些试剂在溶液中反应，完成较高能量的电子转移而生成激发态分子，不稳定的激发态分子回到基态过程中以光辐射形式释放能量，检测其发光光谱和强度从而达到对物质进行痕量分析的目的。

    Wu等[47]构建了一种无标记的电化学发光传感器检测telomerase活性(如图 5)。此传感器采用了功能化化学转化内消旋四聚卟啉(TAPP)修饰石墨烯(TAPP/CCG)的玻碳电极，使用Tween 20防止非特异性结合，Ru(bpy)32+作为信号报告器。带正电荷的TAPP通过π-π堆积和疏水作用力牢牢地吸附在石墨烯表面，防止石墨烯聚集且不破坏石墨烯的共轭π体系。带负电的核苷酸通过静电引力和π-π堆积吸附在石墨烯表面，带正电荷的Ru(bpy)32+由于DNA的静电引力而迁移到电极表面，以三丙胺为电子供体，Ru(bpy)32+与三丙胺在电极处进行电子转移，产生电化学发光信号，当telomerase催化TS引物延长，吸引更多的Ru(bpy)32+而使电化学发光信号增强，基于光强度的增量，可检测telomerase活性。TAPP/CCG传感器检测telomerase活性检出限低至10 HeLa cell/mL，比普通的比色分析法低约2万倍，比纳米金比色试验低100倍。该传感器以无PCR联用、耗费低和高灵敏度的特点，在未来的膀胱癌临床检测中有极大的潜力。

    图 5

    图 5.  基于卟啉-石墨烯纳米复合电极检测端粒酶活性的电化学发光法示意图[47]
    Figure 5.  Illustration of the electrochemiluminenscence assay for telomerase activity detection based on porphyrin-graphene nanocomposite electrode[47]
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    Han等[48]构建了一种无标记的电化学发光免疫传感器，用于检测NMP 22。此传感器首先将类石墨氮化碳与金纳米粒子结合，然后将anti-NMP 22修饰在Au-NH2上，由于抗体的结合影响了金纳米粒子的导电性能，导致电化学发光强度降低；然后用牛血清白蛋白(BSA)封锁表面非特异性结合位点；最后再免疫结合样品中的NMP 22，由于NMP 22阻碍了发光试剂和电子向电极表面的扩散，使得电化学发光强度进一步降低。根据数据分析，电化学发光强度与NMP 22浓度对数呈线性关系。NMP 22检测线性范围在50.0~2.0 ng/mL，检出限为10.0 pg/mL。

    基于电化学发光检测膀胱癌标志物的方法是近几年才发展的新兴手段。这种方法检测标志物的线性范围宽并且检出限极低，可至10 pg/mL。然而，这种方法的材料价格较为昂贵，并且一般不可重复检测使用，所以还需要进一步探究可以重复使用且重现性好的电化学发光检测手段。

    1.4   基于电化学传感的检测手段

    电化学传感主要是利用生物物质与待测物质接触时所产生的物理、化学变化，转化为电讯号输出以实现检测。膀胱癌标志物检测中主要是构建电化学免疫传感器，由分子识别系统和电化学转换器组合而成，分子识别系统是指固定的抗体或抗原，固定抗体或抗原在与对应的抗原或抗体结合时，电极的电化学性能会产生变化。所用电极可分为电流型、电位型和电容型，其中电流型较多[49]。

    Ma等[50]使用还原氧化石墨烯-四乙基五胺(rGO-TEPA)和AuPdPt纳米颗粒构建了一种高灵敏的电化学免疫传感器，用于检测NMP 22浓度(如图 6)。rGO由于高比表面积、极好的生物相容性和电学性能常被用作理想的信号放大材料。AuPdPt纳米颗粒能加速电子转移并增强信号响应。首先将抗体固定在AuPdPt纳米颗粒表面得到AuPdPt NPs-Ab，并保持抗体的高稳定性和生物活性。再将AuPdPt NPs-Ab固定在rGO-TEPA表面，用BSA封锁表面非特异性结合位点。最后加入待测样品，检测玻碳电极的微分脉冲伏安曲线和循环伏安曲线的变化情况。这种免疫传感器具有较宽的线性范围(0.040~20 U/mL)、低检出限(0.01 U/mL)和分析时间短(2 min)的优势。但此传感器仅用了两个膀胱癌尿液样品验证临床应用潜力，仍然需要进一步扩大样本容量以确保传感器具有较好的适用性。

    图 6

    图 6.  rGO-AuPdPt电化学免疫传感器制备示意图[50]
    Figure 6.  Schematic representation of the preparation process of rGO-AuPdPt-based electrochemical immunosensor[50]
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    Wu等[51]设计了一种新型三明治结构的电化学免疫传感器(如图 7)。该传感器用新型氨基功能化磷酸硅铝分子筛(NH2-SAPO-34)负载Pd/Co纳米粒子(NH2-SAPO-34-Pd/Co NPs)检测NMP 22浓度。此传感器通过Pd/Co NPs对蛋白质的吸附能力来固定二级抗体(Ab2)得到NH2-SAPO-34-Pd/Co-Ab2，采用电导率好、表面积大的rGO-NH固定一级抗体(Ab1)，用BSA来封锁非特异性结合位点，加入样品免疫结合NMP 22-Ab2后，再加入NH2-SAPO-34-Pd/Co-Ab2，通过检测电极的循环伏安曲线定量NMP 22浓度。这种免疫传感器具有较宽的线性范围(0.001~20 ng/mL)和低检出限(0.33 pg/mL)。在膀胱癌患者尿样检测中显示出较好的重现性(99.5%~101.2%，n=5)和灵敏度。

    图 7

    图 7.  NH2-SAPO-34-Pd/Co-Ab2基免疫传感器的制备及传感示意图[51]
    Figure 7.  Schematic representation of the fabrication process of NH2-SAPO-34-Pd/Co-Ab2-based immunosensor[51]
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    Liu等[52]设计了一种无标记telomerase活性检测传感器，该传感器利用DNA四面体结构控制分子自组装、多核酸骨架对聚苯胺的沉积和telomerase诱导生成端粒血红素/G-四链体的高催化作用，用表面等离子体共振、电化学阻抗谱、循环伏安法和微分脉冲伏安法测定芯片来表征传感器的电化学性能从而实现对膀胱癌的诊断。Jia等[53]研制了一种新型无标记电流型免疫传感器，用于NMP 22的灵敏检测。此传感器主要采用自下而上的合成方式，采用电沉积方法使铂纳米粒子“自下而上”沉积在介孔金上，再直接固定anti-NMP 22，免疫结合NMP 22后传感器的电流性能下降，且下降程度与浓度呈正相关。Li等[54]基于蛋黄双金属壳纳米粒子(Au@Pd/Ag NPs)和氨基化石墨烯(NH2-GS)设计了一种无标记电化学免疫传感器用于检测NMP 22。在玻碳电极上通过NPs与氨基基团的共价键结合作用将Au@Pd/Ag NPs负载在NH2-GS表面，得到具有高特异性表面积和优异电导性能的NH2-GS/Au@Pd/Ag，以循环伏安法和方波伏安法检测电极性能改变从而实现对膀胱癌的诊断。

    综上可知，基于电化学传感的膀胱癌生物标志物检测主要是利用比表面积高、生物相容性好和电化学性能优异的材料做基底，在其上修饰抗体，免疫结合生物标志物后，电极的电学性能会产生微小变化，并且可以通过仪器精准地捕捉到该变化，以此来定量检测生物标志物浓度。这种方法是近几年新发展起来的，也是发展最为迅速、最为优异的一种检测手段，线性范围比电化学发光更宽，检测限更低，可低至0.33 pg/mL。但是同样存在材料较为昂贵，且多数为一次性检测器件的缺点，仍然需要进一步开发可循环使用且重现性良好的材料。

    1.5   其它检测手段

    除了上述常用的几种检测手段，膀胱癌生物标志物还可以用一些包括凝胶电泳、亚硫酸氢焦磷酸测序、免疫印迹试验、拉曼光谱成像和核磁共振等[55]检测方法来进行定性和定量的检测。Eissa等[56-57]从尿球团中提取RNA，再用RT-PCR逆转录并扩增HA和survivin的mRNA生成cDNA，将生成的cDNA用凝胶电泳分离分析来检测正常人与膀胱癌患者尿球团中HA和survivin的表达情况差异。Chung等[22]采用亚硫酸氢焦磷酸测序和甲基化特异性定量PCR测定膀胱癌患者尿液沉淀物中DBC1、MYO3A、SOX11、NPTX2、NKX6-2、A2BP1、PENK和CA10等基因甲基化情况。Lu等[58]开发了一种基于微移液管的核酸检测方法，用于对细胞、细菌和植物等样本中DNA和RNA的高通量检测，这种方法避免了样品预处理等复杂的操作步骤。Lu等[59]基于磁性弛豫开关策略使用磁性微粒-DNA探针-磁性纳米粒子耦合物和双链特异性核酸酶催化达到了定量检测miRNA的目标。Yang等[27]以尿液中膀胱肿瘤T24细胞为检测对象，用凝胶电泳分离livin、survivin、XIAP和β-actin 4种蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜上，再用免疫印迹试验检测4种蛋白的浓度。Yosef等[60]采用拉曼光谱成像、相干反斯托克斯拉曼散射成像和二次谐波成像技术对高级膀胱肿瘤细胞和正常膀胱细胞进行成像，对比观察两种细胞，提出肿瘤细胞的特征变化情况。此外，Lin等[61]设计基于过滤器的微型设备检测并表征循环肿瘤细胞数量和形状。Appel等[62]利用膀胱癌细胞杨氏模量差别，通过超薄的硅凝胶膜对癌细胞进行分选。Bryan等[24]采用蛋白质印迹和质谱检测膀胱肿瘤EpCAM的含量变化。Wen等[63]用核磁共振代谢组学分析膀胱炎和正常个体尿液中酪胺和2-酮戊二酸的差别。Yu等[64]利用磁珠和核酸适配体构建纳米传感器，检测癌细胞中酶活性增强引起的化学发光强度变化等。这些检测手段为癌症诊断提供了一些新的检测方法。上述检测方法的具体检测数据如表 1所示。

    表 1

    表 1  不同膀胱癌生物标志物或检测方法的灵敏度和特异性比较
    Table 1.  Sensitivity and specificity comparison of different bladder cancer biomarkers detection methods
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    Biomarker/method Sensitivity% Specificity% Reference
    CYFRA 21-1 94.3 68.2 [65]
    FDPa 64.2 74.6 [65]
    BLCA-4 96.4 100 [31]
    NMP 22 52.3 89.7 [66]
    UBCⅡ 19.0 57.1 [66]
    UBC-ELISA 65 92 [67]
    FISH 53.2 74.0 [30]
    BTA StatTesta 72.9 64.6 [68]
    ImmunoCyt 76 63 [69]
    UroVysion 13 90 [69]
    BTA Stat testa=Bladder tumor antigen Stat test.

    2.   膀胱癌早期诊断的机遇和挑战

    综上可知，液体活检是一种具有非常好的发展前景的膀胱癌生物标志物检测方法。相比膀胱镜检查和组织活检的局部检测，液体活检是对尿液和血液的整体检测，反映了肿瘤细胞的整体表达情况。液体活检适用范围较广，可以对乳腺癌、结直肠癌、肺癌和胃癌等其它癌症进行诊断和监测。新一代测序技术和ddPCR技术的引入使循环肿瘤DNA检测技术得到了改进，降低了操作成本，节省了检测时间。此外，与单一生物标志物检测相比，生物标志物组检测具有更高的灵敏度和特异性，从单一标志物到多标志物的转变将有助于推动该领域向前发展，结合基因组学、转录组学和蛋白质组学以适应不同水平的标志物检测也有助于提高诊断准确性。电学传感具有较高的精确度，较低的检出限和高的灵敏度，近几年迅速发展的石墨烯、碳纳米管和金属复合氧化物材料等具有低成本、优异电导性能和良好生物兼容性，易于制备成高灵敏的检测器件，加速膀胱癌数字化诊断的发展进程。液体活检以其非侵入性、可频繁多次检测和快速检测等特点，在膀胱癌诊断中具有较好的发展潜力，但是还有许多生物、技术和临床方面的挑战需要解决。在液体活检前期样品处理中，对尿液中沉淀物如蛋白质、RNA和其它代谢物质的提取和分离还需要创新技术，以保证待测标志物不缺失和变质。循环肿瘤分子应该反映肿瘤的整体情况，但并不是所有的肿瘤位点均相同，难以确定癌症是来自原发性肿瘤还是转移性病变。在膀胱癌早期，生物标志物(如CK8/18等)表达量与正常人的表达水平相当，难以确诊是否患有膀胱癌。在膀胱癌生物标志物方面，目前还没有一种标志物的特异性和灵敏度能达到100%，因此液体活检目前还无法取代侵入性的膀胱镜检查。美国食品和药物管理局审核批准的膀胱癌生物标志物还需要进一步增多。此外，液体活检仍然缺乏大规模的临床数据支持，目前没有清晰的临床共识。虽然液体活检还存在很多问题需要克服，在未来的医疗行业中，液体活检对肿瘤治疗疗效快速评价、肿瘤复发转移风险监测、高危人群早期筛查和辅助诊断、新肿瘤药物筛选、个体化治疗方案选择和肿瘤转移机制的研究等方面均有着巨大的应用前景。

    3.   结论与展望

    综上所述，液体活检是一种非侵入性、结构简单、检测多样、灵敏度并且特异性较高的膀胱癌诊断方法。本篇综述介绍了基于液体活检的膀胱癌诊断方法的发展进程。首先，我们对膀胱癌诊断的主要生物标志物进行了整体概述。其次，重点总结了以液体(如尿液和血液)为检测对象的膀胱癌诊断手段和方法，如UV-Vis吸收光谱、荧光光谱、电化学发光和电化学传感等。除此之外，我们对膀胱癌液体活检面临的机遇和挑战进行了简要的阐述。我们希望这篇综述将为膀胱癌的液体活检和膀胱癌诊断提供指导，并为液体活检的未来提供发展方向。

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  • 图 1  数轴理论用于膀胱癌临床评估的示意图[28]

    Figure 1  Schematic drawing of the clinical evaluation of bladder cancer with number axis theory[28]

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    图 2  夹心ELISA检测survivin的原理图[29]

    Figure 2  Schematic diagram of the sandwich ELISA for detecting survivin[29]

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    图 3  AlphaLISA检测CYFRA21-1示意图[42]

    Figure 3  Schematic illustration of the detection of CYFRA21-1 with AlphaLISA[42]

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    图 4  telomerase和miRNA检测示意图[44]

    Figure 4  Schematic outline of the binary assay for telomerase and miRNA detection[44]

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    图 5  基于卟啉-石墨烯纳米复合电极检测端粒酶活性的电化学发光法示意图[47]

    Figure 5  Illustration of the electrochemiluminenscence assay for telomerase activity detection based on porphyrin-graphene nanocomposite electrode[47]

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    图 6  rGO-AuPdPt电化学免疫传感器制备示意图[50]

    Figure 6  Schematic representation of the preparation process of rGO-AuPdPt-based electrochemical immunosensor[50]

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    图 7  NH2-SAPO-34-Pd/Co-Ab2基免疫传感器的制备及传感示意图[51]

    Figure 7  Schematic representation of the fabrication process of NH2-SAPO-34-Pd/Co-Ab2-based immunosensor[51]

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    表 1  不同膀胱癌生物标志物或检测方法的灵敏度和特异性比较

    Table 1.  Sensitivity and specificity comparison of different bladder cancer biomarkers detection methods

    Biomarker/method Sensitivity% Specificity% Reference
    CYFRA 21-1 94.3 68.2 [65]
    FDPa 64.2 74.6 [65]
    BLCA-4 96.4 100 [31]
    NMP 22 52.3 89.7 [66]
    UBCⅡ 19.0 57.1 [66]
    UBC-ELISA 65 92 [67]
    FISH 53.2 74.0 [30]
    BTA StatTesta 72.9 64.6 [68]
    ImmunoCyt 76 63 [69]
    UroVysion 13 90 [69]
    BTA Stat testa=Bladder tumor antigen Stat test.
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  • 发布日期:  2019-04-01
  • 收稿日期:  2018-12-27
  • 接受日期:  2019-02-03
  • 修回日期:  2019-02-02
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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