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• 多面体齐聚倍半硅氧烷分子(Polyhedral Oligomeric Silsesquioxane, POSS)是一种具有三维立方体结构的无机硅纳米材料^[1-3]，其规整的硅氧立方体内核和8个易于化学修饰的端基位点备受研究者关注^[4]。将POSS引入聚合物体系中可以构建稳定性好、机械性能高、抗氧化的聚合物复合材料^[5-6]。通过活性/可控自由基聚合(Controlled Living Radical Polymerization, CLRP)技术，一系列结构规整且具有拓扑结构的POSS-聚合物复合材料^[7-9]被设计合成出来，在生物传感^[10]和药物传输^[11-12]等生物医学领域表现出良好的应用前景。

  目前，应用于生物标志物检测领域的功能型响应性材料相继地被开发出来，成为研究的热点^[13-18]。然而，传统的小分子荧光探针多受制于溶解度差^[19-22]、与其它检测基元集成困难^[23-25]、难于原位定点成像^[26-29]等因素，严重制约了其在生物医学领域的应用。通过化学修饰手段，可将小分子荧光探针引入聚合物体系，构建功能性的聚合物探针^[30-33]，有效改善小分子荧光探针的生物相容性、检测功能集成化，并使其具备纳米尺寸效应。迄今为止，将POSS基团引入到聚合物荧光探针方面的研究工作还比较少^{[1, 12]}。本文将以POSS衍生物作为链转移剂，萘酰亚胺(NI)作为pH敏感单元^[34-38]，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)作为温度敏感的响应单元^[39-43]，通过可逆加成断裂自由基聚合(Reversible Addition-fragmentation chain Transfer, RAFT)方法合成具有pH/温度响应的荧光探针Poly(POSS-NI-NIPAM)(Scheme 1)。研究探针Poly(POSS-NI-NIPAM)在pH值(5.8~8.0)区间内的荧光变化性能，考察探针对pH和温度响应中可逆循环检测性能。最后，探讨该探针在人宫颈癌细胞(HeLa细胞)中pH值的变化情况。

  图 Scheme 1

  

  Figure Scheme 1.  Synthesis of polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)

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  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  Bruker Avance 400型核磁共振仪(NMR，德国Bruker公司)，以四甲基硅烷为内标，室温下测定；Waters LCT Premier XE TOF型高分辨质谱(HRMS，美国Waters公司)；VARIAN Cary 100型紫外可见吸收光谱仪(UV-Vis)和VARIAN-Cary型荧光光谱仪(美国Agilent公司)；LAKECORE-S040D型超纯水器(上海涞科仪器有限公司)；pHS-25型pH计(瑞士Mettler Toledo有限公司)；Waters 1515-2414型凝胶渗透色谱仪(GPC, 美国Waters公司)，流动相为四氢呋喃。

  偶氮二异丁腈(AIBN)购自上海麦克林生化科技有限公司，分析纯，经乙醇重结晶纯化；N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)购自上海麦克林生化科技有限公司，分析纯，经正己烷重结晶纯化；单氨基-七异丁基POSS(AIPOSS)购自Hybrid Plastics，分析纯；四氢呋喃(THF)购自国药集团试剂有限公司，分析纯，使用前，经金属钠干燥，蒸馏，保存备用。

  1.2   实验方法

  1.2.1   NI(N-(2-甲基丙烯酰乙酯基)-4-(N-甲基哌嗪基)-1, 8-萘酰亚胺)的合成

  参照文献[34]方法，在100 mL三口瓶中，将N-(2-羟乙基)-4-(N-甲基哌嗪基)-1, 8-萘酰亚胺(600 mg, 1.80 mmol)溶于20 mL干燥二氯甲烷中，随后加入0.25 mL三乙胺，并保持在冰浴下搅拌；然后，将10 mL二氯甲烷溶解的甲基丙烯酰氯(180 μL, 1.80 mmol)溶液，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加入三口瓶中，室温下，反应12 h。减压旋蒸除去溶剂，柱层析色谱分离，二氯甲烷/甲醇(体积比10:1)，得到黄色产物NI 330 mg, 产率46%。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:1.87(s, 3H, —CCH₃), 2.46(s, 3H, —NCH₃), 2.77(s, 4H, —(CH₂)₂N—), 3.32(s, 4H, —(CH₂)₂NCH₃), 4.47(t, J=5.2 Hz, 2H, —NCH₂—), 4.54(t, J=5.2 Hz, 2H, —CH₂O—), 5.50(s, 1H, alkene-H), 6.05(s, 1H, alkene-H), 7.22(d, J=8.0 Hz, 1H, Ph—H), 7.69(t, J=7.2 Hz, 1H, Ph—H), 8.40(d, J=8.4 Hz, 1H, Ph—H), 8.52(d, J=8.0 Hz, 1H, Ph—H), 8.57(d, J=7.2 Hz, 1H, Ph—H); HRMS(ESI-MS):计算值C₂₃H₂₆N₃O₄[M+H]⁺ 408.1923, 实测值:408.1933。

  1.2.2   POSS-CTA(双硫酯基-异丁基-POSS链转移剂)的合成

  在100 mL三口烧瓶中，加入AIPOSS(2 g, 2.29 mmol)并溶解于50 mL干燥二氯甲烷，随后加入三乙胺(0.304 g, 3 mmol)，并保持在冰浴下搅拌；取2-溴丙酰溴(0.65 g, 3 mmol)的20 mL干燥二氯甲烷稀释液，并用恒压滴液漏斗缓慢滴加入瓶中，室温下反应12 h。减压旋蒸除去溶剂，乙醇重结晶，真空干燥得到白色固体POSS-Br 2.08 g, 收率87%。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:0.63~0.58(m, 16H, —SiCH₂—), 0.96(d, J=6.8 Hz, 42H, —CH(CH₃)₂—), 1.67~1.58(m, 2H, —SiCH₂CH₂—), 1.89~1.80(m, 7H, —SiCH₂CH—), 1.89(d, J=6.6 Hz, 3H, —CHBrCH₃), 3.27(q, J=6.8 Hz, 2H, —NHCH₂—), 4.41(q, J=6.6 Hz, 1H, —CHBrCH₃), 6.41(s, 1H, —NH—); HRMS(ESI-MS):计算值C₃₄H₇₅NO₁₃Si₈Br[M+H]⁺:1008.2576;实测值:1008.2571。

  Ar气保护下，在100 mL三口瓶中分别加入乙基黄原酸钾(3 g, 19.86 mmol)、POSS-Br(1.5 g, 1.490 mmol)溶于45 mL丙酮，室温反应24 h。减压旋蒸除去溶剂，柱层析色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(体积比25:1)，真空干燥后得到白色产物POSS-CTA 900 mg, 产率58%。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:0.69~0.54(m, 16H, —SiCH₂—), 0.95(d, J=6.8 Hz, 42H, —CH(CH₃)₂—), 1.42(t, J=7.2 Hz, 3H, —CH₂CH₃), 1.55(d, J=7.4 Hz, 3H, —CHCH₃), 1.93~1.78(m, 9H, —SiCH₂CH—, —SiCH₂CH₂—), 3.33~3.18(m, 2H, —NHCH₂—), 4.35~4.18(m, 1H, —CHCH₃), 4.74~4.59(m, 2H, —CH₂CH₃), 6.34(s, 1H, —NH—); HRMS(ESI-MS):实测值C₃₇H₇₉NNaO₁₄S₂Si₈[M+Na]⁺:1072.2994;实测值:1072.2999。

  1.2.3   Poly(POSS-NI-NIPAM)的合成

  在25 mL的史莱克管中，依次加入N-异丙基丙烯酰胺(0.567 g, 5.010 mmol)、链转移剂POSS-CTA(35 mg, 0.0334 mmol)和NI(10 mg, 0.0246 mmol)，1 mL干燥四氢呋喃和AIBN(2.4 mg，0.0167 mmol), Ar气保护下冻融脱气循环3次，加热至65 ℃，反应9 h。反应液缓慢滴加至200 mL冷乙醚中沉淀3次，抽滤得到黄色固体0.547 g。数均相对分子质量为12565, 质均相对分子质量为18353, 多分散性指数PDI为1.46。

  2.   结果与讨论

  2.1   合成与表征

  2.1.1   POSS-CTA的合成

  经两步有机反应合成RAFT反应链转移剂POSS-CTA：1)AIPOSS和2-溴丙酰溴通过亲核加成-消除反应得到热力学稳定的中间体POSS-Br；2)以丙酮为溶剂，乙基黄原酸钾上的硫原子亲核进攻POSS-Br，生成溴化钾和链转移剂POSS-CTA。该方法操作简便，原料易得。其中，POSS-Br和POSS-CTA均通过¹H NMR和HRMS证实了化合物结构的正确性。

  2.1.2   Poly(POSS-NI-NIPAM)的结构

  从N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)出发，以无水四氢呋喃为溶剂，AIBN为链引发剂，POSS-CTA为链转移剂，合成了共聚物Poly(POSS-NI-NIPAM)(Scheme 1)。通过¹H-NMR和GPC对Poly(POSS-NI-NIPAM)的结构和相对分子质量分别进行表征。如图 1所示，在Poly(POSS-NI-NIPAM)的核磁共振氢谱中，萘酰亚胺单元中—OCH₂CH₂N—的亚甲基氢化学位移出现在4.39处，萘酰亚胺中甲基哌嗪基团的—CH₃甲基氢化学位移出现在2.55处；在高场部分，1.77和0.56处信号分别对应单体POSS-CTA的亚甲基和甲基氢，上述聚合物核磁氢谱图结果证实了各单体均成功参与了聚合反应。GPC测试结果表明，Poly(POSS-NI-NIPAM)的数均相对分子质量(M_n)为12565, 质均相对分子质量(M_w)为18353，多分散性指数为1.46。进一步表明，采用RAFT反应生成的聚合物相对分子质量可控，且分布均匀。

  图 1

  

  图 1  Poly(POSS-NI-NIPAM)在DMSO-d₆(25 ℃)的核磁共振氢谱图

  Figure 1.  ¹H NMR spectra of Poly(POSS-NI-NIPAM) in DMSO-d₆ at 25 ℃

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  如图 2所示，对不同浓度萘酰亚胺单体NI的吸收光谱进行了滴定测试，并对其在400 nm处的吸光度值与质量浓度变化进行了线性关联，得到式(1)。

  $ {A_{400}} = 9.9446c-0.00114, {\rm{ }}R = 0.9999 $

  图 2

  

  图 2  单体NI和Poly(POSS-NI-NIPAM)在甲醇溶液中的紫外可见吸收光谱(A)和单体NI在400 nm的吸光度变化与聚合物浓度之间的线性拟合(B)

  Figure 2.  UV-Vis spectra of monomer NI with various concentration and Poly(POSS-NI-NIPAM)) in methanol solution(A), absorbance vs concentration(μmol/L) for solution methanol of NI at λ_abs=400 nm(B)

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  式中，质量浓度为1.0 g/L Poly(POSS-NI-NIPAM)的溶液在吸收光谱400 nm处的吸光度值为A₄₀₀=0.36985, 经公式计算得出聚合物中单体NIPAM和NI之间的摩尔比233:1。

  2.2   探针与pH值的变化响应检测

  通过系统的测试条件优化，萘酰亚胺单体(NI)在乙醇溶液中具有较高的荧光量子产率，同时考虑到Poly(POSS-NI-NIPAM)具有良好的水溶性，因此本文所有的光谱测试均采用V(水):V(乙醇)=9:1的体系。基于萘酰亚胺单体NI对pH优异的响应性能，对聚合物探针Poly(POSS-NI-NIPAM)在不同pH值下的光谱性质进行了测试。如图 3A所示，紫外-可见吸收光谱表明，当pH值由10.0至2.2时，Poly(POSS-NI-NIPAM)的最大吸收波长(λ_abs=410 nm)略微蓝移，并在400 nm处形成明显的等吸收点。如图 3B所示，选用等吸收点400 nm作为激发波长，当pH值为10.0时，Poly(POSS-NI-NIPAM)的初始荧光很弱，这可以归因于萘酰亚胺与哌嗪基团相邻的氮原子之间发生PET过程导致萘酰亚胺的荧光淬灭；随着pH值降低，萘酰亚胺中的哌嗪单元发生质子化，PET过程被禁止，NI的荧光强度(λ_em=520 nm)恢复，进一步发现荧光强度变化与pH值(5.8~8.0)变化呈现良好的线性相关。另外，通过式(2)计算了Poly(POSS-NI-NIPAM)的pK_a为6.51。

  $ {\rm{lg}}\frac{{{I_{{\rm{max}}}} - I}}{{I - {I_{{\rm{min}}}}}} = {\rm{pH - p}}{K_{\rm{a}}} $

  图 3

  

  图 3  Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L)检测不同pH的紫外可见吸收光谱(A)和荧光光谱(B)(溶液:V(水):V(乙醇)=9:1, λ_ex=400 nm, 22 ℃)

  Figure 3.  UV-Vis(A) and fluorescence(B) spectra changes of the polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L) at various pH values measured in V(water):V(ethanol)=9:1 at 22 ℃, λ_ex=400 nm

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  式中，I为荧光强度；I_max为pH线性响应范围内荧光最大强度值；I_min为荧光强度最小值。

  2.3   探针对温度变化响应的检测

  基于N-异丙基丙烯酰胺单元^[42-43]能对温度变化的快速响应性能和接近人体的低临界溶解温度(LCST)，测试探针对不同温度的光谱响应性能。研究发现，当其在低温时为澄清透明溶液，当体系温度升高时，则有浑浊出现。如图 4A所示，pH=7.14的条件下，Poly(POSS-NI-NIPAM)在26 ℃左右时，其在400 nm处的吸光度发生突变，表明聚合物此时发生了由亲水至疏水的相转变。由于聚合物体系中引入了疏水性POSS基团，使聚合物能够形成更大体积的聚合物线团，进而使其活动性及溶解性均有所下降，导致了Poly(POSS-NI-NIPAM)的LCST偏低。如图 4B所示，聚合物体系Poly(POSS-NI-NIPAM)在520 nm处荧光随着温度的升高而逐渐降低，只有发生相转变时(温度从26~27 ℃)其荧光强度明显变强。这可以解释为随着温度升高，萘酰亚胺分子热运动导致其荧光逐渐淬灭；当温度达到LCST时，其微环境由极性转变为非极性，聚合物在溶液中由伸展的线团结构转变为紧密的球状结构，荧光表现为突然增强。当温度高于LCST时，聚合物探针的荧光变化与萘酰亚胺单体荧光随温度的变化表现出一致性。

  图 4

  

  图 4  pH=7.14时Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L)对温度响应的紫外可见吸收(A)和荧光光谱(B)

  Figure 4.  UV-Vis(A) and fluorescence(B) spectra changes of the polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L) at different temperature measured at pH=7.14

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  众所周知，探针检测的可逆性能够真实反映出被分析物的实时分布，也是其能否应用于细胞成像的一个重要衡量指标^[2]。本文分别测试了探针在pH值变化(4.22/10.09)和温度变化(20~40 ℃)时Poly(POSS-NI-NIPAM)荧光强度的可逆循环性能，如图 5所示，经过10次循环实验测定，发现该探针仍能呈现出良好的可逆性能，表明Poly(POSS-NI-NIPAM)可作为一种新型的聚合物荧光传感器检测pH/温度变化。

  图 5

  

  图 5  Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L)对不同pH(A)和温度(B)荧光强度变化曲线图(溶液体系:V(水):V(乙醇)=9:1, ), λ_ex=400 nm)

  Figure 5.  Changes in the fluorescent intensity of the polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L) under different pH values(A) and temperature(B) condition in V(water):V(ethanol)=9:1, λ_ex=400 nm

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  2.4   细胞成像实验

  基于Poly(POSS-NI-NIPAM)理想的光学性质和优异的生物相容性，进一步通过细胞共聚焦成像实验测试了该探针可应用检测细胞内的pH值变化。在HeLa细胞培养液中加入Poly(POSS-NI-NIPAM)(10 μmol/L)的缓冲液，孵育1 h后进行成像，以405 nm为激发波长，收集500~540 nm的荧光。如图 6所示，调节细胞内pH值为8.0时，未观察到明显荧光；随着细胞内pH值恢复至7.4，HeLa细胞中绿色荧光明显增强；当调节细胞内pH值为6.0时，其绿色荧光进一步增强。结果表明，在HeLa细胞成像实验中，Poly(POSS-NI-NIPAM)的荧光信号变化随细胞内pH的降低而增强，实验结果与光谱测试结果一致，表明该聚合物探针可应用于生物样本中pH值变化的检测。

  图 6

  

  图 6  Poly(POSS-NI-NIPAM)(10 μmol/L)在pH =6.0(A)、7.4(B)和8.0(C)条件下的HeLa细胞孵育1 h荧光效果图。A₀、B₀、C₀：明场照片；A₁、B₁、C₁:激发波长405 nm, 检测波长(520±20) nm；A₂、B₂、C₂：明场和荧光的叠加图

  Figure 6.  Confocal fluorescence images of HeLa cells incubated with Poly(POSS-NI-NIPAM)(10 μmol/L) at pH=6.0(A), 7.4(B) and 8.0(C) for 1 h. A₀, B₀, C₀:bright field; A₁, B₁, C₁:λ_ex=405 nm, λ_em=(520±20) nm; A₂, B₂, C₂:merged images

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  3.   结论

  利用可逆加成断裂自由基聚合(RAFT)反应设计合成了基于萘酰亚胺(NI)染料和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体的pH/温度双响应的聚合物荧光探针Poly(POSS-NI-NIPAM)，并对其pH响应性能和温敏性分别进行了研究。探针在pH值5.8~8.0环境下具有优异的pH检测性能，荧光变化与pH呈现良好的线性相关，pK_a值为6.51。此外，Poly(POSS-NI-NIPAM)对pH和温度均具有良好的可逆循环检测性能。最后通过探针对HeLa细胞成像实验，实现了对细胞内pH值变化的检测。探针Poly(POSS-NI-NIPAM)作为一种功能性纳米复合材料在生物样本的检测方面具有潜在的应用前景。

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  Scheme 1  Synthesis of polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)

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  图 1  Poly(POSS-NI-NIPAM)在DMSO-d₆(25 ℃)的核磁共振氢谱图

  Figure 1  ¹H NMR spectra of Poly(POSS-NI-NIPAM) in DMSO-d₆ at 25 ℃

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  图 2  单体NI和Poly(POSS-NI-NIPAM)在甲醇溶液中的紫外可见吸收光谱(A)和单体NI在400 nm的吸光度变化与聚合物浓度之间的线性拟合(B)

  Figure 2  UV-Vis spectra of monomer NI with various concentration and Poly(POSS-NI-NIPAM)) in methanol solution(A), absorbance vs concentration(μmol/L) for solution methanol of NI at λ_abs=400 nm(B)

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  图 3  Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L)检测不同pH的紫外可见吸收光谱(A)和荧光光谱(B)(溶液:V(水):V(乙醇)=9:1, λ_ex=400 nm, 22 ℃)

  Figure 3  UV-Vis(A) and fluorescence(B) spectra changes of the polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L) at various pH values measured in V(water):V(ethanol)=9:1 at 22 ℃, λ_ex=400 nm

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  图 4  pH=7.14时Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L)对温度响应的紫外可见吸收(A)和荧光光谱(B)

  Figure 4  UV-Vis(A) and fluorescence(B) spectra changes of the polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L) at different temperature measured at pH=7.14

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  图 5  Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L)对不同pH(A)和温度(B)荧光强度变化曲线图(溶液体系:V(水):V(乙醇)=9:1, ), λ_ex=400 nm)

  Figure 5  Changes in the fluorescent intensity of the polymeric fluorescent sensor Poly(POSS-NI-NIPAM)(0.5 g/L) under different pH values(A) and temperature(B) condition in V(water):V(ethanol)=9:1, λ_ex=400 nm

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  图 6  Poly(POSS-NI-NIPAM)(10 μmol/L)在pH =6.0(A)、7.4(B)和8.0(C)条件下的HeLa细胞孵育1 h荧光效果图。A₀、B₀、C₀：明场照片；A₁、B₁、C₁:激发波长405 nm, 检测波长(520±20) nm；A₂、B₂、C₂：明场和荧光的叠加图

  Figure 6  Confocal fluorescence images of HeLa cells incubated with Poly(POSS-NI-NIPAM)(10 μmol/L) at pH=6.0(A), 7.4(B) and 8.0(C) for 1 h. A₀, B₀, C₀:bright field; A₁, B₁, C₁:λ_ex=405 nm, λ_em=(520±20) nm; A₂, B₂, C₂:merged images

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