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• 酪氨酸酶(Tyrosinase)是一种复杂的含铜氧化还原酶，在自然界中广泛存在，具有独特的催化活性，其过量表达易引起一些色素沉着性疾病，也能使果蔬发生酶促褐变^[1-6]。因而，研制一种新型安全高效的酪氨酸酶抑制剂在食品保鲜和抑制黑色素生物合成等领域意义重大。桑色素是一种具有生物活性的黄酮类化合物，在植物或植物来源的食物中广泛存在，Wang等^[7]采用光谱法和分子对接研究了桑色素对酪氨酸酶的抑制机理，结果表明，桑色素可逆地抑制酪氨酸酶活性，且表现为竞争型抑制，桑色素与酪氨酸酶结合方式主要是通过氢键和范德华力；圆二色谱分析结果表明，桑色素诱导了酪氨酸酶重新排列及其构象的变化；此外，分子对接结果表明：桑色素与底物左旋多巴共同竞争酪氨酸酶的活性部位。Xing等^[8]研究了(HGly)₃PW₁₂O₄₀和(HGly)₃SiW₁₂O₄₀对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用，结果表明，二者均能有效抑制酪氨酸酶活力，其半抑制浓度(IC₅₀)值分别为1.55和1.39 mmol/L，表明(HGly)₃PW₁₂O₄₀对酪氨酸酶的抑制效果优于(HGly)₃SiW₁₂O₄₀，双倒数图结果表明，(HGly)₃PW₁₂O₄₀的抑制类型为反竞争型，而(HGly)₃SiW₁₂O₄₀为非竞争型。

  多金属氧酸盐(POMs)因其具有新奇的结构、特有的物理化学性质和良好的热稳定性，这些优良的性质决定了它具有多样的功能，使其在催化化学、药物化学和抑酶抑菌等方面展现出广阔的应用前景，具有潜在的应用价值，是无机化学领域研究的热点之一^{[1, 9-12]}。Iqbal等^[13]研究发现，钨酸盐[H₂W₁₂O₄₂]^10-和[TeW₆O₂₄]^6-是有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，且[H₂W₁₂O₄₂]^10-抑制能力更强。本实验室的研究主要集中在Keggin型磷钼酸盐，而对Dawson型的磷钼酸的研究较少，仅发现Dawson型H₆[P₂Mo₁₈O₆₂]和H₈[P₂Mo₁₇Cr(OH₂)O₆₁]对酪氨酸酶二酚酶有抑制效果^[14]。本实验以Dawson型磷钼酸H₇[P₂Mo₁₇VO₆₂]、H₈[P₂Mo₁₆V₂O₆₂]、H₉[P₂Mo₁₅V₃O₆₂]、H₈[P₂Mo₁₄V₄O₆₂H₂]和H₉[P₂Mo₁₃V₅O₆₂H₂](分别简写为P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅)为效应物，研究其对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的抑制作用，以期为研制新颖的酪氨酸酶抑制剂提供实验基础。

  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  FT/IR-480型傅里叶变换红外光谱仪(日本株式会社JASCO公司)；Cintra2020型紫外可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)；IKARET型基本型加热磁力搅拌器(德国IKA实验室技术公司)；pH211C型酸度计(北京哈纳科仪科技有限公司)；CP214型电子天平(美国OHAUS仪器(上海)有限公司)。

  蘑菇酪氨酸酶、二甲基亚砜(DMSO)和L-3, 4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)购自美国Sigma-Aldrich公司，实验所用其它试剂均为市售分析纯，实验用水为超纯水。

  1.2   实验方法

  1.2.1   5种钒取代Dawson型磷钼酸的合成及其结构表征

  按照文献[15-16]的方法合成效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅。经红外光谱仪、紫外可见分光光度计和固体核磁共振波谱仪(UNITY+-300)表征其结构。

  1.2.2   酶动力学实验

  酶动力学实验的操作方法是参照本实验室已发表文献[14]进行测定的。酪氨酸酶的活力为920 U/mg，将其溶于pH=6.8的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(浓度为50 mmol/L)中，0.5 mmol/L的L-DOPA也溶解于磷酸盐缓冲液中，效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅溶解于DMSO中。首先将2.8 mL的L-DOPA溶液于30 ℃恒温水浴锅中孵育10 min，然后将L-DOPA溶液倒入比色皿中，同时加入100 μL的效应物，混匀，最后加入100 μL酪氨酸酶溶液，立即混匀，在475 nm波长下测定其吸光度随时间的变化曲线。以0.1 mL的DMSO为空白对照。效应物对酪氨酸酶激活效果的测定与抑制效果的测定方法一致，是在固定底物浓度和酶浓度的前提下，改变加入的效应物浓度，测定其相对剩余酶活力。其中，未加入效应物(空白对照为0.1 mL的DMSO)时的激活率为零。

  1.3   数据处理与分析

  实验数据均平行测定3次，数据处理采用软件SPSS17.0，绘图采用软件Origin 8.0。

  2.   结果与讨论

  2.1   光谱分析

  效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅经红外光谱、紫外光谱和³¹P固体核磁共振波谱表征其特征结构，结果表明，所合成效应物具有钒取代的Dawson型磷钼酸的特征结构，与文献[15-16]结果一致，证明合成的效应物即为P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅(见辅助材料图S1、S2和S3)。

  2.2   效应物对酪氨酸酶二酚酶的抑制效果

  以5种钒取代的Dawson型磷钼酸P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅为效应物，研究其对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用。由图 1可知，随着效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃浓度的增加，相对剩余酶活力逐渐下降，表明这3种效应物对酪氨酸酶二酚酶均有明显的抑制作用。从图 1中可以得到，导致酪氨酸酶活力下降至50%时的效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃浓度(IC₅₀值)分别为0.409、0.386和0.386 mmol/L。与天然的酪氨酸酶抑制剂熊果苷(IC₅₀=5.3 mmol/L)相比，效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃对酪氨酸酶的抑制效果更为显著^[17]。本实验室先前研究已发现的Dawson型磷钼酸H₆[P₂Mo₁₈O₆₂]和H₈[P₂Mo₁₇Cr(OH₂)O₆₁]对酪氨酸酶二酚酶也有抑制效果，其IC₅₀值分别为0.482和0.503 mmol/L，表明效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃对酪氨酸酶的抑制能力更强，这可能是由于过渡金属钒的取代增强了Dawson型磷钼酸的抑制效果，影响了磷钼酸与酪氨酸酶的铜离子之间的结合，而P₂Mo₁₇V的抑制效果优于H₈[P₂Mo₁₇Cr(OH₂)O₆₁]可能与取代的过渡金属元素的离子半径有关^[14]。与本实验室已研究发现的Keggin型磷钼酸Na₄PMo₁₁VO₄₀和(HGly)₄PMo₁₁VO₄₀(其IC₅₀值分别为0.522和0.447 mmol/L)，我们发现一个钒原子取代Dawson型P₂Mo₁₇V对酪氨酸酶二酚酶的抑制效果优于Keggin结构的磷钼酸，也优于甘氨酸基取代的Keggin型磷钼酸^[18]，由于先前并未研究两个(或者3个)钒原子数取代的Keggin型磷钼酸，因而无法比较P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃与Keggin型之间的抑制效果。实验结果还表明，0~1.0 mmol/L的P₂Mo₁₄V₄对酪氨酸酶的抑制作用十分微弱，因此未进一步深入探究。由图 2可知，随效应物P₂Mo₁₃V₅浓度的增加，相对剩余酶活逐渐上升，表明P₂Mo₁₃V₅对酪氨酸酶表现为激活作用，当加入效应物P₂Mo₁₃V₅浓度为0时，酪氨酸酶活力为0%，当效应物P₂Mo₁₃V₅浓度为0.25 mmol/L时，酪氨酸酶活力增加到了22.13%，当效应物P₂Mo₁₃V₅浓度为1 mmol/L时，酪氨酸酶活力增加到99.71%，显著提高了酪氨酸酶活性，本文主要侧重于研究酪氨酸酶抑制剂，因而在此并未对效应物P₂Mo₁₃V₅深入探究。酪氨酸酶抑制剂的研究前景广阔，广泛应用在医疗、化妆品行业、昆虫角质硬化、果蔬酶促褐变和水产品保鲜等方面，因而研制新颖且安全高效的酪氨酸酶抑制剂意义重大。

  图 1

  

  图 1  效应物P₂Mo₁₇V(A)、P₂Mo₁₆V₂(B)和P₂Mo₁₅V₃(C)对酪氨酸酶二酚酶的抑制效果

  Figure 1.  Inhibitory effects of P₂Mo₁₇V(A), P₂Mo₁₆V₂(B) and P₂Mo₁₅V₃(C) on the diphenolase activity of mushroom tyrosinase

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  图 2

  

  图 2  效应物P₂Mo₁₃V₅对酪氨酸酶二酚酶的激活效果

  Figure 2.  Activation effect of P₂Mo₁₃V₅ on the diphenolase activity of mushroom tyrosinase

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  2.3   效应物对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理

  测定效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理，结果如图 3所示。由图 3可知，以剩余酶活对酶浓度作图，得到一组相交于原点的直线，且直线的斜率随3种效应物浓度的增加而减小，表明这3种效应物对酪氨酸酶的抑制机理均是一个可逆过程，即3种效应物与酪氨酸酶必需基团结合是通过非共价键实现的，效应物虽然抑制了酪氨酸酶的活性，但未降低其有效酶量^{[1, 14]}。与本实验室先前研究的Keggin型Na₄PMo₁₁VO₄₀和(HGly)₄PMo₁₁VO₄₀相比，我们发现效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃的抑制机理与Na₄PMo₁₁VO₄₀相同，而与(HGly)₄PMo₁₁VO₄₀不同，这可能与甘氨酸基团的取代有关，使效应物与酶进一步形成独特的金属-有机框架结构，使得(HGly)₄PMo₁₁VO₄₀的抑制机理是不可逆的^[18]。效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃的抑制机理与Dawson型H₆[P₂Mo₁₈O₆₂]和H₈[P₂Mo₁₇Cr(OH₂)O₆₁]是一致的^[14]。

  图 3

  

  图 3  效应物P₂Mo₁₇V(A)、P₂Mo₁₆V₂(B)和P₂Mo₁₅V₃(C)对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理

  Figure 3.  Determination of the inhibitory mechanism of P₂Mo₁₇V(A), P₂Mo₁₆V₂(B) and P₂Mo₁₅V₃(C) on the diphenolase activity of tyrosinase

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  2.4   效应物对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型

  测定效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃对酪氨酸酶的抑制类型，通过Lineweaver-Burk双倒数图及进一步二次作图求得抑制类型和抑制常数，结果如图 4所示。由图 4可知，以底物浓度的倒数对反应速率的倒数作图得到一组相交于Y轴的直线，即随着效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃浓度的增加，其直线斜率逐渐变大，而纵截距不变，根据已发表文献[14]，我们得出3种效应物的抑制类型均为竞争型，即效应物与底物共同竞争酪氨酸酶的活性部位。分别以效应物浓度和直线斜率为横纵坐标，通过二次作图，求得效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃的抑制常数K_I分别为0.234、0.391和0.249 mmol/L。

  图 4

  

  图 4  效应物P₂Mo₁₇V(A)、P₂Mo₁₆V₂(B)和P₂Mo₁₅V₃(C)对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型

  Figure 4.  Determination of the inhibitory type of P₂Mo₁₇V(A), P₂Mo₁₆V₂(B) and P₂Mo₁₅V₃(C) on the diphenolase activity of tyrosinase. Insets:plot of slope and concentration

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  3.   结论

  本文采用酶动力学研究了5种钒取代的Dawson型磷钼酸P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅对酪氨酸酶的抑制作用。结果表明，效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃能有效的抑制酪氨酸酶二酚酶活性，其IC₅₀值分别为0.409、0.386和0.386 mmol/L，其中P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃的抑制效果优于P₂Mo₁₇V，3种效应物的抑制效果虽不及曲酸，但远远优于典型的酪氨酸酶抑制剂熊果苷^{[17, 19]}。结合抑制机理和抑制类型，我们发现效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃对酪氨酸酶均表现为可逆的竞争型抑制，且抑制常数K_I分别为0.234、0.391和0.249 mmol/L。实验还发现0~1.0 mmol/L的P₂Mo₁₄V₄对酪氨酸酶无明显的抑制作用，而效应物P₂Mo₁₃V₅对酪氨酸酶表现为激活作用，且当效应物P₂Mo₁₃V₅浓度为1 mmol/L时，对酪氨酸酶的激活率达到99.71%，显著提高了酪氨酸酶活性。由于本文侧重于研究一种新型高效的酪氨酸酶抑制剂，因而在本文中尚未对P₂Mo₁₃V₅的激活机理深入探究。随着所取代钒原子数的变化，效应物对酪氨酸酶表现不同的效应，这可能是不同个数的钒原子取代影响了Dawson型磷钼酸与酪氨酸酶二酚酶的结合方式，从而使效应物P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂、P₂Mo₁₅V₃、P₂Mo₁₄V₄和P₂Mo₁₃V₅与酪氨酸酶的相互作用有明显的差异，形成了一种独特的表现形式，即P₂Mo₁₇V、P₂Mo₁₆V₂和P₂Mo₁₅V₃对酪氨酸酶有较强的抑制能力，P₂Mo₁₄V₄无明显抑制能力，而P₂Mo₁₃V₅对酪氨酸酶表现为激活作用，由于Dawson型磷钼酸与酪氨酸酶作用机制较为复杂，尚需进一步深入探究。本实验可能为钒取代磷钼酸的综合利用提供理论和实践依据。

  辅助材料(Supporting information)[目标化合物的红外，紫外及核磁谱图]可以免费从本刊网站(http://yyhx.jl.cn)下载。

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  图 1  效应物P₂Mo₁₇V(A)、P₂Mo₁₆V₂(B)和P₂Mo₁₅V₃(C)对酪氨酸酶二酚酶的抑制效果

  Figure 1  Inhibitory effects of P₂Mo₁₇V(A), P₂Mo₁₆V₂(B) and P₂Mo₁₅V₃(C) on the diphenolase activity of mushroom tyrosinase

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  图 2  效应物P₂Mo₁₃V₅对酪氨酸酶二酚酶的激活效果

  Figure 2  Activation effect of P₂Mo₁₃V₅ on the diphenolase activity of mushroom tyrosinase

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  图 3  效应物P₂Mo₁₇V(A)、P₂Mo₁₆V₂(B)和P₂Mo₁₅V₃(C)对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理

  Figure 3  Determination of the inhibitory mechanism of P₂Mo₁₇V(A), P₂Mo₁₆V₂(B) and P₂Mo₁₅V₃(C) on the diphenolase activity of tyrosinase

  c(P₂Mo₁₇V, P₂Mo₁₆V₂ and P₂Mo₁₅V₃)/(mmol·L ^-1):a.0; b.0.067; c.0.133; d.0.2; e.0.267

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  图 4  效应物P₂Mo₁₇V(A)、P₂Mo₁₆V₂(B)和P₂Mo₁₅V₃(C)对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型

  Figure 4  Determination of the inhibitory type of P₂Mo₁₇V(A), P₂Mo₁₆V₂(B) and P₂Mo₁₅V₃(C) on the diphenolase activity of tyrosinase. Insets:plot of slope and concentration

  c(P₂Mo₁₇V, P₂Mo₁₆V₂ and P₂Mo₁₅V₃)/(mmol·L^-1):a.0; b.0.067; c.0.133; d.0.2; e.0.267

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